KATA PENGANTAR

Penuntun Praktikum Mikrobiologi Klinik ini disusun sebagai penuntun bagi mahasiswa yang
mengambil mata kuliah praktikum Mikrobiologi Klinik di Program Studi Farmasi STIKES
Harapan Ibu Jambi. Tujuan utamanya adalah membantu para mahasiswa farmasi dalam
mempelajari teknik dan prosedur dasar laboratorium mikrobiologi hingga prosedur klinik. Materi
praktikum Mikrobiologi Klinik meliputi pengenalan mikroskop, tekni pewarnaan, penyiapan alat
dan media, pengenalan berbagai sifat biokimia bakteri serta cara identifikasi bakteri. Materi
tersebut disusun dari berbagai buku Mikrobiologi Dasar, baik teori maupun penuntun praktikum.
Selain itu materi praktikum juga termasuk kedalamnya Studi Lapangan penyakit yang
disebabkan oleh parasit meliputi kunjungan ke Puskesmas terdekat. Materi-materi tersebut
disusun dari berbagai buku-buku Mikrobiologi, baik text book maupun penuntun praktikum.

Penyusun menyadari bahwa buku ini masih jauh dari sempurna, namun demikian diharapkan
tetap dapat membantu mahasiswa atau siapa saja yang berminat pada bidang mikrobiologi. Akhir
kata, saran maupun koreksi untuk perbaikan buku kami sangat harapkan.

Jambi, September 2019

Tim penyusun
 DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL i

KATA PENGANTAR ii

DAFTAR ISI iii

TATA TERTIB KETENTUAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI iv

PENYIAPAN DAN PENGGUNAAN ALAT v

DAFTAR ISI vii

DAFTAR TABEL ix

DAFTAR GAMBAR x

DAFTAR LAMPIRAN xi

Bab I Pendahuluan 1

Bab II Tinjauan Pustaka 3

II.1 Diabetes Melitus 3

II.2 Terapi Diabetes Melitus 4

II.2.1Obat Antihiperglikemia Oral 4

II.2.2Obat Antihiperglikemia Suntik 6

II.3 Hipertensi 7

II.4Terapi Hipertensi 8

II.5 Kepatuhan 12

II.5.1 Morisky Medication Adherence Scale-8 (MMAS-8) 14

II.5.2 Penulisan dan Pemberian Informasi Obat 14

II.6Pusat Kesehatan Masyarakat 15

 II.7Program Pengelolaan Penyakit Kronis 16

Bab III Metode Penelitian 17

III.1 Desain Penelitian 17

III.2 Tempat dan Waktu Penelitian 17

III.3 Subjek Penelitian 17

III.4 Jenis dan Sumber Data 18

III.5 Kuesioner MMAS-8 18

III.6 Intervensi Penulisan dan Pemberian Informasi Obat 18

III.7 Pengumpulan Data 19

III.8 Analisis dan Pengolahan Data 19

Bab IVHasil dan Pembahasan 21

IV.1 Data Demografi 21

IV.2 Pengaruh Faktor Demografi terhadap Perubahan Skor MMAS-8 23

IV.3 Pengaruh Pemberian Intervensi Penulisan dan Pemberian Informasi Obat terhadap
skor MMAS-8, Kadar GDP, Kadar GDPP, dan Tekanan Darah 28

IV.4 Pengaruh Frekuensi Pemberian dan Penulisan Informasi Obat Kelompok Intervensi
35

Bab V Kesimpulan dan Saran 37

DAFTAR PUSTAKA 38

LAMPIRAN 4
 TATA TERTB PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI KLINIS

1. Praktikan (mahasiswa peserta praktikum) wajib hadir 5 menit sebelum acara praktikum
berlangsung. Dan telah menggunakan jas lab bersih ketika masuk ke laboratorium.
2. Setiap praktikan harus mempelajari dan memahami teori dan prosedur kerja menyangkut
objek yang dilaksanakan pada hari itu, sebelum praktek berlangsung.
3. Semua alat dan bahan harus disterilkan sebelum dipakai.
4. Tidak boleh sama sekali memipet melalui mulut terutama suspense mikroba.
5. Praktikan harus menjaga suasana kondusif selama praktikum, kurangi bercakap-cakap
selama praktikum agar tidak merugikan pekerjaan sendiri atau rekan kerja lainnya.
6. Praktikan tidak diizinkan untuk makan, minum dan merokok atau memasukkan sesuatu
ke dalam mulut diruang laboratorium mikrobiologi.
7. Praktikan harus selalu menjaga kebersihan tangan dapat mencuci tangan dengan
antiseptik seperti lisol, natrium hipoklorida, methanol, dll, kemudian dengan sabun setiap
akan bekerja dan sewaktu siap bekerja.
8. Setiap mengerjakan praktikum dan pengamatan harus dicatat dan diamati secara hati-hati
dan cermat.
9. Praktikan diharuskan menjaga kemurnian bahan-bahan yang dipakai dan menjauhkan
segala macam kontaminan yang dapat mengganggu kevalidan hasil praktikum.
10. Praktikan harus bertanggungg jawab yerhadap kebersihan dan keamanan ruang
praktikum, serta alat-alat yang digunakan.
11. Praktikan harus melakukan destruksi untuk semua alat setelah pengamatan.
12. Praktikan diwajibkan membersihkan mikroskop dan mengembalikan ke tempat semuala
setelah selesai melaksanakan praktikum yang sebelumnya dalam keadaan bersih. Lensa
mikroskop harus dibersihkan dengan kertas lensa.
13. Praktikaan wajib memeriksa nyala api dan lampu listrik serta menutup kran air dan gas.
14. Praktikan tidak dibenarkan melakukan percobaan lain diluar objek praktikum yang
dilaksanakan hari itu.
15. Praktikan harus membuat laporan tentang objek yang dikerjakan dan ditunjang dengan
referensi pustaka yang diserahkan pada praktikum minggu berikutnya.
16. Jumlah kehadiran sangat menentukan dalam kesempatab mengikuti ujian akhir semester.
17. Pipet bekas dan jarum inokulasi harus diletakkan dalam wadah yang berisi desinfektan.
18. Jangan meletakkan pipet bekas atau jarum inokulasi begitu saja di atas meja kerja.
19. Jarum ose yang digunakan harus disterilkan terlebih dahulu dengan cara membakarnya di
api hingga berwarna merah menyala sebelum dan sesudah digunakan.
20. Bila terjadi tumpahan bakteri di atas meja kerja maka usaplah meja teersebut dengan
alkohol dan desinfektan lainnya (lisol 5%).
21. Media inokulasi harus selalu diberi label yang meliputi nama, tanggal inokulasi dan
sampel.
22. Seluruh bakteri yang digunakan berpotensi pathogen, oleh karena itu berhati-hatilah dalm
bekerja dan sebisa mungkin mengerjakan nya secara spesifik.
23. Setelah selesai pelaksanaan dan pengamatan praktikum, praktikan wajib membuat Data
sementara dalam laporan sementara yang akan dikoreksi oleh asisten pendamping
kelompok yang bersangkutan. Data sementara yang sudah disetujui asisten bisa langsung
dibawa pulang untuk dibuat Laporan Resmi mata acara praktikum pada hari itu.
Pengamatan dilakukan sesuai kebutuhan dan waktu yang telah ditentukan.
 PENYIAPAN DAN PENGGUNAAN ALAT

1. Penggunaan Autoklaf
Autoklaf merupakan suatu bejana yang dapat ditutup, ruang uap berdinding
rangkap yang diisi dengan uap jenuh bebas udara dan dipertahankan pada suhu serta
tekanan yang ditentukan selama periode waktu yang dikehendaki. Pada prinsipnya,
sterilisasi autoklaf menggunakan panas dan tekanan dari uap air. Biasanya untuk
mensterilkan media menggunakan temperatur 1210C dengan tekanan 2 bar selama 15
menit. Alasan mengapa digunakan temperatur 1210C karena pada saat itu
menunjukkan tekanan 2 bar yang akan membantu membunuh mikroorganisme dalam
suatu benda. Pada saat sumber panas dinyalakan, air yang ada di dalam autoklaf lama
kelamaan akan mendidih dan uap air yang terbentuk akan mendesak udara yang
mengisi autoklaf.
Setelah semua udara dalam autoklaf diganti dengan uap air, katup uap/udara
ditutup sehingga tekanan udara dalam autoklaf naik. Pada saat tercapai tekanan dan
temperatur yang sesuai, maka proses strerilisasi dimulai dan timer mulai menghitung
waktu mundur. Setelah proses sterilisasi selesai, sumber panas dimatikan dan tekanan
dibiarkan turun perlahan hingga tercapai tekanan normal. Jangan mempercepat
pengeluaran uap unntuk menurunkan tekanan, karena dapat mengakibatkan
terlepasnya sumbat kapas pada lab atau tabung atau muncratnya larutan hingga
membasahi kapas.

2. Penggunaan Oven
Oven merupakan alat yang digunakan untuk sterilisasi dengan menggunakan udara
kering. Alat sterilisasi ini dipakai untuk mensterilkan alat-alat gelas seperti
Erlenmeyer, Petridisk (cawan petri), tabung reaksi dan gelas lainnya. Bahan-bahan
seperti kapas, kain dan kertas juga dapat disterilkan dalam oven tetapi dalam
temperatur tertentu. Suhu oven dapat mencapaii 2000C, untuk sterilisasi cukup
digunakan suhu 1600C selama 2 jam, sebab paada suhu 1700C kertas pembungkus dan
kapas sudah mulai gosong. Peralatan yang belum kering sesudah dicuci tidak boleh
dibungkus dan disterilkan karena dapat menyebabkan keretakan paada gelas. Pintu
 oven jangan dibuka sebelum suhunya turun sampai suhu kamar, ini menghindari
retaknya gelas atau masuknya udara yang mengandung partikel debu.

3. Penggunaan Mikroskop
Mikroskop merupakan salah satu alat yang penting pada kegiatan laboratorium
khususnya mikrobiologi. Mikroskop merupakan alat bantu yang memungkinkan kita
dapat mengamati obyek yang berukuran sangat kecil (mikroskopis). Hal ini
membantu memecahkan persoalan manusia tentang organisme yang berukuran kecil
terutama bakteri, jamur dan beberapa mikro algae.
Ada 2 (dua) dasar yangberbeda untuk mikroskop, yaitu mikroskop optic dan
mikroskop electron. Mikroskop optik lebih banyak digunakan dalam proses
praktikum dan sudah banyak dimilliki. Mikroskop optic perlu dibedakan dengan
mikroskop biologi dan mikroskop stereo.

1) Mikroskop Cahaya/ mikroskop biologi

 Digunakan untuk mengamati benda-benda tipis dan transparan.. Salah satu ciri
yang membedakan hewan dan tumbuhan dapat dilihat secara struktural yakni melalui
pengamatan secara mikroskopis. Sel tumbuhan dapat dipersiapkan melalui sayatan
segar, tetapi tidak demikian dengan sel hewan, harus melalui proses fiksasi sampai
dengan pewarnaan untuk dapat membedakan strukturnya dengan lebih tegas. Benda
yang diamati biasanya diletakkan diatas kaca objek, dalam media air dan ditutup
Balsam Kanada. Penyinaran diberikan dari dibawah oleh sinar alam atau lampu.

Lensa objektif terletak pada suatu resolver yakni piringan yang dapat diputar-
putar, berada di bagian bawah tubus, biasanya berjumlah empat buah dengan
perbesaran 4 X; 10 X; 40 X dan 100 X. Objektif yang paling kuat untuk mikroskop
adalah 100 X dengan perbesaran total 1000 kali. Bila lensa okuler 10 X disebut
sebagai objektif minyak imersi, karena penggunaannya dengan minyak imersi dan
harus dipelajari secara khusus.

Diafragma berfungsi untuk mengatur intensitas cahaya yang diperlukan pada

waktu sedang mengamati sediaan mikroskopis, terletak di subpanggung sediaan.

Lensa kondensor berupa kombinasi dari dua buah lensa yang berfungsi untuk
memfokuskan cahaya ke benda yang sedang diamati. Dengan mengatur lensa
kondensor dan cermin cekung bila kondisi ruangan kekurangan cahaya, akan
diperoleh pencahayaan yang lebih baik.

Cermin dengan permukaan ganda cekung dan datar merupakan bagian optik
yang berfungsi untuk memantulkan cahaya dari sumber cahaya ke objek/benda yang
akan diamati, setiap mikroskop selalu dilengkapi dengan cermin tersebut. Bila sumber
cahaya cukup terang digunakan permukaan datar, sedangkan bila intensitas cahaya
dari sumber cahaya kurang, digunakanlah permukaan cermin yang cekung, sebab sifat
cermin cekung selain memantulkan cahaya juga lebih mampu mengumpulkan cahaya
lebih dahulu.
 2) Mikroskop stereo
Mikroskop stereo merupakan jenis mikroskop yang hanya bisa digunakan untuk
benda yang berukuran relatif besar. Mikroskop stereo mempunyai perbesaran 7
hingga 30 kali. Benda yang diamati dengan mikroskop ini dapat terlihat secara
tiga dimensi. Komponen utama mikroskop stereo hampir sama dengan mikroskop
cahaya. Lensa terdiri atas lensa okuler dan lensa obyektif. Beberapa perbedaan
dengan mikroskop cahaya adalah: (1) ruang ketajaman lensa mikroskop stereo
jauh lebih tinggi dibandingkan dengan mikroskop cahaya sehingga kita dapat
melihat bentuk tiga dimensi benda yang diamati, (2) sumber cahaya berasal dari
atas sehingga obyek yang tebal dapat diamati. Perbesaran lensa okuler biasanya
10 kali, sedangkan lensa obyektif menggunakan sistem zoom dengan perbesaran
antara 0,7 hingga 3 kali, sehingga perbesaran total obyek maksimal 30 kali. Pada
bagian bawah mikroskop terdapat meja preparat. Pada daerah dekat lensa obyektif
terdapat lampu yang dihubungkan dengan transformator. Pengatur fokus obyek
terletak disamping tangkai mikroskop, sedangkan pengatur perbesaran terletak
diatas pengatur fokus.

Hal-hal yang perlu diperhatikan bila menggunakan mikroskop :

a. Selalu membawa mikroskop dengan dua tangan.

b. Bila menggunakan preparat basah, tabung mikroskop selalu dalam keadaan tegak,
berarti meja dalam keadaan datar. Ini berlaku bagi mikroskop dengan tabung tegak,
tidak berlaku untuk mikroskop dengan tabung miring
c. Preparat basah harus selalu ditutup dengan gelas penutup saat dilihat di bawah
mikroskop
d. Selalu menjaga kebersihan lensa-lensa mikroskop termasuk cermin.
e. Bila ada bagian mikroskop yang bekerja kurang baik/hilang segera laporkan kepada
laboran.
f. Tidak dibenarkan melepas lensa-lensa mikroskop dari tempatnya.
g. Setelah selesai menggunakan mikroskop, pasang lensa objektif dg. Perbesaran paling
rendah pada kedudukan lurus ke bawah.
Prosedur Pemakaian Mikroskop

1) Periksa keadaan mikroskop, kelengkapan lensa, ada atau tidaknya kerusakan (tercatat
dalam label mikroskop)
2) Nyalakan lampu mikroskop
3) Lakukan pengamatan tanpa objek yang dipasang pada meja mikroskop. Aturlah
diafragma agar cahaya yang masuk sedikit atau banyak.
4) Setelah cahaya masuk lancer, letakkan sebuah objek pada meja mikroskop, jepit
dengan baik.
5) Pasanglah lensa objektif 4x, amati objek yang ada kemudian atur fokus dengan fokus
kasar, lalu pertajam gambar bayangan dengan pengatur fokus halus. Kemudian lensa
objektif diganti dengan perbesaran 10 x, atur fokus dengan pengatur fokus halus.
Lensa objektif ganti lagi dengan perbesaran 40x, atur lagi fokus untuk mendapatkan
gambar yang baik. Bila penggunaan lensa objektif 100x hendaknya saudara berhati-
hati. Jarak antara lensa dengan objek sangat dekat (± 0,1 mm). jadi gunakan pengatur
halus saja. Juga harus selalu digunakan minyak imersi, yang berfungsi sebagai
pengatur indek bias. Karena jarak lensa yang sangat dekat dengan objek, maka sinar
yang masuk tidak akan dibiaskan kea rah lain sehingga tidak melewati objek,
akibatnya tidak akan didapat gambar yang baik. Minyak emersi diletakkan pada objek
yang diamati cukup 1 tetes. Setelah memperoleh gambar yang baik dengan
perbesaran 40x, gunakan sekali lagi fokus halus untuk mempertajam gambar.
6) Bila telah selesai mengamati dengan minyak emersi, bersihkan minyak tadi dengan
menggunakan larutan xylol yang diteteskan pada kapas. Usap semua lensa objektif
dengan kapas yang berxylol tadi. Hati-hati dengan xylol karena banyak bahan yang
akan mudah larut dalam xylol.

4. Pipet
Gunakan pipet steril, disposable pipet atau pipet kaca yang disterilisasi dalam kaleng
kecil. Menghisap larutan dengan pipet menggunakan mulut tidak diperkenankan
karena dapat menginfeksi cairan tubuh.
5. Prosedur inkubasi
Mikroorganisme dapat tumbuh pada beberapa temperature. Akan tetap temperature
optimum yang biasa digunakan adalah 370C selama 18-24 jam. Letakkan tabung
inkubasi pada rak tabung dan jika menggunakan cawan petri maka inkubasinya dalam
posisi cawan di balikkan untuk menghindari penguapan air yang akan mengganggu
pengamatan.
PROSEDUR UMUM KERJA DI LABORATORIUM MIKROBIOLOGI
 OBJEK 1

PENYIAPAN MEDIA DAN STERILISASI

TUJUAN PRAKTIKUM

TEORI DASAR

Mikroorganisme terdapat dimana saja, hampir disetiap tempat. Bahkan benda-benda, air minum,
makanan kita sehari-hari yang kita anggap sudah bersih dan steril, setelah diamati menunjukkan
bahwa masih banyak organisme didalamnya. Keberadaan mikroorganisme ini tentu saja
membahayakan dan ada juga yang tidak.

Media pertumbuhan mikroorganisme adalah suatu bahan yang terdiri atas campuran nutrisi
(nutrient) yang digunakan oleh suatu mikroorganisme untuk tumbuh dan berkembangbiak pada
media tersebut. Mikroorganisme memanfaatkan nutrisi pada media berupa molekul-molekul
kecil yang dirakit untuk menyusun komponen sel-nya. Media pertumbuhan juga bias digunakan
untuk mengisolasi mikroorganisme, identifikasi, dan membuat kultur murni. Media berfungsi
sebagai tempat tinggal, sumber makanan, dan penyedia nutrisi bagi mikroorganisme yang akan
dibiakkan pada media, selain itu media juga berfungsi untuk membiakkan, mengasingkan,
mengirimkan, dan menyimpan mikroorganisme dalam waktu yang lama di laboratorium.

Media berdasarkan sifat terbagi menjadi tiga, yakni media padat, media cair, media semi padat
semi cair. Media berdasarkan komposisi/susunannya terdiri atas media sintetis, media semi
sintetis, dan media non sintetis. Jenis media yang sering digunakan yakni, Nutrient Agar, nutrient
Broth (NB), PDA (Potato Dextrose Agar), Salmonela shigella, Eosin Methylene Blue Agar
(EMBA). Berdasarkan Komposisi media terbagi atas Media alami atau non sintetis merupakan
media yang disusun dari bahan-bahan alami yang komposisinya tidak dapat diketahui secara
pasti. Pada umumnya media ini dibuat ekstrak dari bahan dasar seperti kentang, daging, telur,
tomat dsb, Media Semi sintetis merupakan media yang disusun dari bahan-bahan alami dan
sintetis, media semi sintetis contohnya kaldu nutrisi yang terdiri dari pepton, NaCl, ektrak daging
dan aquades, dan Media Sintetis merupakan media yang disusun dari senyawa kimia dengan
formulasi takaran dan jenisnya diketahui secara pasti. Contohnya Salmonella-Shigella agar, Mac
Conkey agar dsb. Pada saat proses penyiapan media perlu untuk dilakukan sterilisasi terlebih
dahulu ini bertujuan agar bahan yang kita siapkan tidak terkontaminasi oleh mikroba yang tidak
kita kehendaki. Sterilisasi yang bai k dapat mencegah tumbuhnya mikroba lain yang tidak
diharapkan dalam bahan yang telah disterilisasi.

Pemasukan medium dalam tempat (wadah) tertentu perlu dilakukan sebelum sterilisasi. Wadah
yang dapat digunakan misalnya tabung reaksi atau Erlenmeyer. Wadah tersebut harus bersih,
bebas debu, dan tidak terkontaminasi. Tabung reaksi digunakan misalnya untuk pembuatan agar
miring dan agar tegak, sedangkan Erlenmeyer digunakan untuk medium yang akan dituang
dalam petridish. Medium dimasukkan kedalam tabung reaksi sebanyak ± 5-6 ml (agar miring)
atau ±7-8 ml (agar tegak), tergantung tabung reaksi yang digunakan. Medium yang akan
disterilisasi tidak boleh lebih 2/3 volum Erlenmeyer untuk menghindari menyemburnya media ke
tutup. Hal ini dapat terjadi karena prinsip sterilisasi menggunakan uap panas bertekanan. Tabung
reaksi dan Erlenmeyer selanjutnya disumbat dengan kapas atau penutup tahan panas lain.

Pembuatan medium agar tegak dilakukan dengan memposisikan tabung secara tegak secepatnya
setelah disterilisasi. Sedangkan pembuatan medium agar miring dengan meletakkan tabung
miring dengan kemiringan tertentu dan dibiarkan sampai medium memadat. Kemiringan medium
dapat kita atur sesuai tujuan misalnya penyimpanan atau suspense. Medium dalam Erlenmeyer
setelah disterilisasi dapat dituang sebanyak ±15 ml tiap petridish, proses dilakukan secara
aseptik.
 Sterilisasi medium dengan menggunakan uap panas bertekanan (tekanan 1 atm; suhu
1210C selama 15 menit), sedangkan untuk sterilisasi larutan yang tidak tahan terhadap panas
dapat disterilisasikan dengan menggunakan berbagai macam saringan salah satunya saringan
yang mempunyai pori-pori berukuran 0,45µm.

PROSEDUR KERJA

1. Prosedur Pembuatan Media Alami

A. Media taoge cair
Bahan:
Taoge ........................................ 100 g
Sukrosa (gula pasir) ...................60 g
Akuades .................................... 1.000 ml

Cara pembuatan:

a. Taoge direbus dengan akuades sampai mendidih (1-2 jam).

b. Disaring kemudian ditambahkan sukrosa kemudian didihkan lagi sampai semua sukrosa
larut
c. Ditambahkan aquades yang hilang karena penguapan sampai volume 1.000 ml
d. Dimasukkan tabung.
e. Sterilisasi dengan otoklaf (121 ˚C; 15 menit) atau
 B. Media taoge agar
Susunan dan cara membuatnya sama seperti media taoge cair dengan ditambah agar-agar
1,5– 2 %. Agar-agar yang digunakan dapat berupa tepung agar (swallow globe).
Penambahan dilakukan bersama dengan sukrosa.

C. Media wortel agar

Bahan:
Wortel ................................ 100 g
CaSO4 ................................. 2g
Agar-agar ............................ 4g
Akuades ............................. 200 ml

Cara pembuatan:
a. Wortel digiling/diparut sampai hancur,
b. Ditambahkan akuades sebanyak 200 ml dan didihkan selama 10 menit.
c. Ditambahkan akuades yang hilang selama pemanasan
d. Disaring dengan kain dan ditambahkan CaSO4 dan agar-agar.
e. Didihkan lagi sampai semua larut kemudian dimasukkan tabung atau Erlenmeyer
Sterilisasi dengan otoklaf (121 ˚C; 15 menit) atau

D. Media dari bahan penyedap rasa

Bahan:
Gula pasir ........................... 3g
MSG .................................. 1g
Agar-agar ........................... 1,5 g
Akuades ........................... 100 ml

Cara pembuatan
a. Panaskan semua bahan sampai larut kemudian masukkan ke dalam wadah
(tabung/erlenmeyer).
 b. Sterilisasi dengan otoklaf (121 ˚C; 15 menit).
E. Potato Dekstrosa Agar (PDA)
Bahan:
Kentang .......................... 200 g
Dekstrosa ........................ 10 g
Agar-agar ......................... 15 g
Akuades ........................ 1.000 ml

Cara pembuatan
Kupas kentang dan cuci bersih, kemudian potong-potong menjadi kotak-kotak kecil (2x2
cm). Rebus potongan kentang tersebut dalam 500ml aquades selama 1,5-2 jam. Saring
campuran dengan kain tipis berlapis kapas sehingga diperoleh cairan ekstrak kentang yang
bening. Tambahkan dekstrosa dan agar, panaskan, dan aduk hingga homogen. Tambahkan
aquades hingga diperoleh volume akhir 1.000 ml. Sterilisasi dengan otoklaf (121 ˚C; 15
menit).

2. Sterilisasi Media
1. Isilah autoklaf dengan akuades hingga batas yang ditentukan.
2. Masukkan medium atau peralatan yang akan disterilkan.
3. Tutup autoklaf rapat-rapat, minta petunjuk asisten.
4. Biarkan klep uap terbuka, nyalakan autoklaf.
5. Setelah uap keluar dan klep uap meneteskan air, berarti ruangan dalam autoklaf telah
jenuh dengan uap air. Tutup klep uap tersebut. C atau tekanan uap 15 lbs.
6. 6. Biarkan autoklaf menyala hingga tercapai suhu 121 C selama 15 – 20 menit.
7. Pertahankan suhu 1210C
8. Setelah 15 – 20 matikan autoklaf dan buka klep uap perlahan-lahan untuk mengeluarkan
uap hingga tekanannya kembali nol.
9. Buka autoklaf dan keuarkan medium yang telah steril dari dalamnya dengan
menggunakan sarung tangan tahan panas.
10. PERHATIAN ! Jangan sekali-kali membuka tutup autoklaf bila tekanan uap belum turun
mencapai angka nol. Untuk meyakinkan tekanan sudah mencapai nol dapat dicek dari
suhu harus di bawah 100oC.
OBJEK II
INOKULASI DAN ISOLASI MIKROORGANISME

TUJUAN PRAKTIKUM

TEORI DASAR
Mikroorganisme di alam terdistribusi dimana-mana dalam jumlah besar dan sangat
kompleks. Mikroorganisme dapat berada di udara, tanah, air makanan dan lingkungan.
Sebelum mulai membiakan mikroba, pertama-tama kita harus mempertimbangkan
bagaimana cara menghindari kontaminan. Mikroba terdapat dimana-mana, tersebar di
udara atau pada permukaan suatu benda, oleh karena itu kita harus melakukan sterilisasi
media segera setelah disiapkan, yang biasa dilakukan dengan pemanasan. Hal ini perlu
dilakukan untuk menghilangkan mikroba kontaminan. Maka semua bahan dan alat yang
bersentuhan dengan suatu biakan murni harus steril.

MEDIA
Media biakan atau pertumbuhan mikroorganisma adalah suatu bahan yang terdiri atas
campuran nutrisi yang digunakan untuk tumbuh dan berkembangbiak mikroorganisma
pada media tersebut. Media disusun berdasarkan komponen-komponen penting yang
diperlukan oleh mikroorganisma sepetti mineral, karbohidrat, asam amino, pH, air.
Secara komersial media diformulasikan sedemikian rupa sehingga dapat digunakan untuk
isolasi dan identifikasi suatu mikroorganisme. Konsentrasi agar yang dapat digunakan
untuk media padat adalah 1,5-1,8 % dengan konsentrasi kurang dari 1% agar dapat
menghasilkan media semi padat.

Isolasi dan Inokulasi

Isolasi atau tindakan mengisolasi suatu mikroba ialah memisahkan mikroba tersebut dari
lingkungannya di alam dan menumbuhkannya sebagai biakan murni dalam medium
buatan. Untuk isolasi harus diketahui cara-cara menanam dan menumbuhkan mikroba
pada medium biakan serta syarat-syarat lain untuk pertumbuhannya (Jutono dkk, 1980).
Selain istilah isolasi, kita mengenal pula istilah inokulasi. Inokulasi berbeda dengan
isolasi, jika isolasi merupakan upaya memisahkan mikroba, sedangkan inokulasi
merupakan pekerjaan memindahkan mikroba dari medium yang lama ke medium yang
baru dengan tingkat ketelitian yang sangat tinggi. Dengan kata lain, inokulasi adalah
suatu upaya untuk menanamkan mikroba. Jadi antara isolasi dengan inokulasi memiliki
arti yang berbeda. Sebelum melakukan kegiatan isolasi dan inokulasi, biasanya dilakukan
terlebih dahulu kegiatan pembuatan pengenceran bertingkat. Menurut (Wasteson and
Hornes, 2009) tujuan dari pengenceran bertingkat yaitu memperkecil atau mengurangi
jumlah mikroba yang tersuspensi dalam cairan. Sehingga memudahkan dalam proses
penghitungan jumlah mikrobia. Penentuan besarnya atau banyaknya tingkat pengenceran
tergantung kepada perkiraan jumlah mikroba dalam sampel. Digunakan perbandingan 1 :
9 untuk sampel dan pengenceran pertama dan selanjutnya, sehingga pengenceran
berikutnya mengandung 1/10 sel mikroorganisme dari pengenceran sebelumnya.
Mikroba jarang terdapat di alam dalam keadaan murni. Kebanyakan merupakan
campuran bermacam-macam spesies mikroba. Macam-macam cara isolasi dan inokulasi
mikrobia adalah antara lain : 1) Cara tebar atau sebar (spread plate method) Teknik
spread plate merupakan teknik dengan cara menginokulasi kultur mikroba secara
pulasan/sebaran di permukaan media agar yang telah memadat. Metode ini dilakukan
dengan mengencerkan biakan kultur mikroba. Karena konsentrasi sel-sel mikroba pada
umumnya tidak diketahui, maka pengenceran perlu dilakukan beberapa tahap, sehingga
sekurangkurangnya ada satu dari pengenceran itu yang mengandung koloni terpisah (30-
300 koloni). Koloni mikrobia yang terpisah memungkinkan koloni tersebut dapat
dihitung(Jutono dkk, 1980). 2) Cara penuangan (pour plate method) Cara ini dasarnya
ialah menginokulasi medium agar yang sedang mencair pada temperatur 45-50ºC dengan
suspensi bahanyang mengandung mikroba, dan menuangkannya ke dalam cawan petri
steril. Setelah inkubasi akan terlihat koloni-koloni yang tersebar di permukaan agar yang
mungkin berasal dari 1 sel bakteri, sehingga dapat diisolasi lebih lanjut (Jutono dkk,
1980). 3) Cara gores (streak plate method) Cara gores umumnya digunakan untuk
mengisolasi koloni mikroba pada cawan agar sehingga didapatkan koloni terpisah dan
merupakan biakan murni. Cara ini dasarnya ialah menggoreskan suspensi bahan yang
mengandung mikroba pada permukaan medium agar yang sesuai pada cawan petri.
Setelah inkubasi maka pada bekas goresan akan tumbuh koloni-koloni terpisah yang
mungkin berasal dari 1 sel mikroba, sehingga dapat diisolasi lebih lanjut Penggoresan
yang sempurna akan menghasilkan koloni yang terpisah. Bakteri yang memiliki flagella
seringkali membentuk koloni yang menyebar terutama bila digunakan lempengan yang
basah. Untuk mencegah hal itu harus digunakan lempengan agar yang benarbenar kering
permukaannya.
PROSEDUR PRAKTIKUM
Teknik isolasi dengan cara pengenceran ini merupakan salah satu teknik preparasi
suspensi. Teknik ini dilakukan dengan cara mengambil sampel kemudian disuspensikan
dalam aquades steril. Tujuan dari teknik ini pada prinsipnya adalah melarutkan atau
melepaskan mikroba dari substratnya ke dalam aquades sehingga lebih mudah
penanganannya. Macam-macam preparsi bergantung kepada bentuk sampel :
1. Swab (ulas) Dilakukan menggunakan cotton bud steril pada sampel yang memiliki
permukaan luas dan pada umumnya sulit dipindahkan atau sesuatu pada benda tersebut.
Contohnya adalah meja, batu, batang kayu, potongan daging dan lain-lain. Swab
dilakukan dengan tahapan sebagai berikut :
a. Siapkan cotton bud steril,
b. Usapkan cotton bud memutar sehingga seluruh permukaan kapas dari cotton bud
kontak dengan permukaan sampel, dan
c. Swab akan lebih baik jika cotton bud dicelupkan terlebih dahulu ke dalam larutan
atraktan semisal pepton water.
2. Rinse (bilas) Ditujukan untuk melarutkan sel-sel mikroba yang menempel pada
permukaan substrat yang luas tapi relatif berukuran kecil, misalnya daun, bunga dan lain-
lain. Rinse dilakukan dengan tahapan berikut :
a. Celupkan sampel ke dalam aquades sterildengan perbandingan 1 : 9 (w/v), dan
b. Contohnya sampel daun diambil dan ditimbang 5 g kemudian dibilas dengan aquades
45 ml yang terdapat dalam beaker glass.
3. Maseration (penghancuran) 4. Sampel yang berbentuk padat dapat ditumbuk dengan
mortar ataupestle sehingga mikroba yang ada dipermukaan atau di dalam dapat terlepas
kemudian dilarutkan ke dalam aquades. Contoh sampelnya antara lain bakso, biji, buah
dan lain-lain.Perbandingan antar berat sampel dengan pengenceran pertama adalah 1 : 9
(w/v). Untuk sampel dari tanah tidak perlu dimaserasi. Maseration dapat dilakukan
dengan tahapan sebagai berikut :
a. Masukkan sampel ke dalam mortar atau pestle,
b. Hancurkan sample menggunakan mortar, dan
c. Sampel siap untuk diencerkan dan digunakan.

Teknik Pengenceran Bertingkat

a. Sampel yang mengandung mikroorganisme dimasukan ke dalam tabung pengenceran
pertama (1/10 atau 10-1 ) secara aseptis (dari preparasi suspensi). Perbandingan berat
sampel dengan volume tabung pertama adalah 1 : 9 dan ingat aquades yang digunakan
jika memakai teknik rinse dan swab sudah termasuk pengencer 10-1 . Setelah sampel
masuk lalu dilarutkan dengan mengocoknya.
b. Diambil 1 ml dari tabung 10-1 dengan pipet ukur kemudian dipindahkan ke tabung 10-
2 secara aseptis kemudian dikocok dengan membenturkan tabung ke telapak tangan
sampai homogen (idealnya adalah dihomogenkan menggunakan vortex).
c. Lanjutkan pemindahan hingga tabung pengenceran terakhir (cukup sampai
pengenceran 10-6 ) dengan cara yang sama, hal yang perlu diingat bahwa pipet ukur yang
digunakan harus selalu diganti, artinya setiap tingkat pengenceran digunakan pipet ukur
steril yang berbeda/baru. Prinsipnya bahwa pipet tidak perlu diganti jika memindahkan
cairan dari sumber yang sama.
Teknik Isolasi dan Inokulasi
Teknik ini merupakan lajutan dari pengenceran bertingkat. Pengambilan suspensi dapat
diambil dari pengenceran mana saja tapi biasanya untuk tujuan isolasi (mendapatkan
koloni tunggal) diambil beberapa tabung pengenceran terakhir (pengenceran 10-4 , 10-5 ,
dan 10-6 ). 4. Cara tebar atau sebar (spread plate method) h. Buatlah pengenceran 10-4
sampai 10-6 dari kultur murni bakteri dengan larutan pengencer, i. Ambil tabung reaksi
yang mengandung kultur murni bakteri, buka dan bakar leher tabung, j. Pindahkan 0,1 ml
kultur bakteri secara aseptis ke permukaan media NA dalam cawan petri, k. Bakar
spreader yang sebelumnya telah dicelupkan dalam alkohol, biarkan dingin (jika batang
spreader terbuat dari plastik, jangan lakukan pembakaran), l. Tebarkan/sebarkan kultur
bakteri dengan spreader secara merata dan biarkan sampai permukaan agar mengering
(lihat Gambar 48), m. Setelah permukaan agar mengering, selanjutnya inkubasikan secara
terbalik selama 24 jam pada suhu kamar dan amati pertumbuhannya, dan n. Bandingkan
pertumbuhan dari tiap-tiap pengenceran.

5. Cara penuangan (pour plate method)

a. Dinginkan mediaNA dalam tabung reaksi sampai suhu ± 45 - 50ºC (cirinya : terasa hangat di
kulit),
b. Buka tutup tabung yang mengandung kultur murni bakteri, dan bakar leher botol,
c. Pindahkan 1 ml kultur murni bakteri ke dalam tabung reaksi yang mengandung NA secara
aseptis,
d. Bakar leher tabung di atas bunsen, dan tuangkan media NA yang telah mengandung kultur
murni bakteri ke dalam cawan petri,
e. Goyangkan perlahan-lahan untuk mencampur kultur bakteri dengan NA sampai
homogen.Penggoyangan petri jangan terlalu kuat (goyangkan membentuk seperti angka 8).
Pada saat penuangan media, petri bisa diletakkan dalam radius maksimal 20 cm dari sumber api
(zona steril), f. Setelah agar memadat diinkubasi terbalik pada suhu yang berbeda-beda, yaitu
pada suhu kamar, suhu 37ºC, 40ºC, 50ºC selama 48 – 72 jam. Inkubasi dengan posisi terbalik
dilakukan setelah agar memadat,
g. Amati pertumbuhannya dan lakukan perhitungan koloni menggunakan colony counter,
h. Jumlah koloni per 1 cm2 = ¼ x 5 x jumlah koloni per cawan x 1 / faktor pengenceran,
i. Faktor pengenceran = pengenceran x volume yang diencerkan.

Cara gores (streak plate method)

a. Panaskan jarum ose hingga memijar di atas bunsen, kemudian dinginkan. Gunakan ose yang
telah dingin untuk menggores pada permukaan media agar dalam cawan petri (jika jarum ose
yang digunakan terbuat dari plastic atau jarum ose disposable, tidak perlu dipanaskan di atas
Bunsen),
b. Ambil 1 ose kultur murni bakteri dan goreskan pada permukaan media agar dimulai pada satu
ujung. Perhatikan teknik penggoresan!Ose disentuhkan pada permukaan media agar dalam
cawan petri, sewaktu menggores ose dibiarkan meluncur di atas permukaan agar,
c. Setiap kali menggoreskan ose untuk kuadran berikutnya, pijarkan ose terlebih dahulu dan
biarkan dingin, dan
d. Inkubasikan secara terbalik pada suhu kamar selama 24 jam dan amati pertumbuhannya.