PETUNJUK PRAKTIKUM

BIOLOGI SEL-MIKROBIOLOGI FARMASI

Penyusun:
Dr. Apt. Indah Purwantini, M.Si.
Prof. Dr. apt. Puji Astuti., M.Sc.
Dr. Sylvia T. Pratiwi., M.Si
Dr. rer.nat. Apt. Yosi Bayu Murti., M.Si.
Dr. Djoko Santosa, M.Si
Prof. Dr. Apt. Erna Prawita Setyowati, M.Si.
Prof. Dr. Apt. Wahyono., SU.

DEPARTEMEN BIOLOGI FARMASI

FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS GADJAH MADA
YOGYAKARTA
2023

i
 TATA TERTIB DAN PERATURAN
LABORATORIUM MIKROBIOLOGI-BiOLOGI SEL

1. Sebelum praktikum dimulai mahasiswa diwajibkan untuk :

a. Membuat rencana kerja praktikum yang akan dikerjakan pada hari itu.
b. Menyelesaikan tugas yang berhubungan dengan acara praktikum.
c. Menempuh pre-test yang dilaksanakan sebelum praktikum dimulai.
2. Bila berhalangan hadir diwajibkan memberi keterangan resmi.
3. Bagi mahasiswa yang terlambat lebih dari 15 menit tidak diperbolehkan ikut praktikum.
4. Dilarang menggunakan sepatu di area laboratorium. Sepatu harap disimpan pada rak sepatu
yang sudah disediakan dengan rapi.
5. Sandal untuk penggunaaan selama di dalam laboratorium harus selalu dijaga kebersihannya
dan selalu digunakan selama berada di dalam ruang laboratorium dan harap diletakkan di
rak sandal dengan rapi.
6. Dilarang meletakkan barang-barang pengguna laboratorium (tas dan barang berharga lain)
di atas meja kerja laboratorium. Tas dan barang berharga harap diletakkan di tempat yang
sudah disediakan.
7. Dilarang makan, minum, merokok atau membawa makanan/minuman di dalam
laboratorium. Dilarang bermain-main atau memasukkan/menggigit-gigit barang (seperti
pensil) dalam bentuk apapun baik secara sengaja atau tidak ke dalam mulut! Hal ini untuk
menghindari kemungkinan tertelannya kultur mikroorganisma yang digunakan di
laboratorium.
8. Selama bekerja di laboratorium mahasiswa diharuskan untuk:
a. Mencuci tangan dengan menggunakan air dan sabun sebelum dan sesudah bekerja di
laboratorium. Lakukan hal yang sama saat meninggalkan laboratorium untuk pergi ke
kamar kecil.
b. Membersihkan meja praktikum dan kotak aseptis dengan desinfektan sebelum dan
sesudah bekerja.
c. Memakai jas praktikum yang bersih dan terkancing rapi. Bagi yang menggunakan jilbab,
masukkan rumbai kerudung ke dalam jas praktikum.
d. Bagi yang berambut panjang, hendaklah rambutnya diikat.

ii
 e. Memberi label terhadap semua barang terutama yang disimpan dan diinkubasi (Nama,
golongan/kelompok, tanggal, jenis kultur dan keterangan lain yang dianggap penting).
f. Jika secara tidak sengaja ada bahan kultur yang tercecer, segera jenuhi dengan
disinfektan, tutup dengan paper towel dan lapor segera kepada pengawas laboratorium.
Area segera di dekontaminasi dengan disinfektan. Hati-hati dengan pembakar Bunsen,
matikan bila tidak sedang digunakan. Ketika sedang bekerja, hati-hati untuk tidak
menyentuh api bunsen dengan tangan.
g. Dilarang membuang biakan sisa atau habis pakai dan pewarna sisa di sembarang
tempat. Bahan tersebut harus dibuang di tempat yang telah disediakan oleh
asisten/laboran.
h. Semua material yang terkontaminasi segera ditempatkan pada tempat yang telah
disediakan untuk didekontaminasi oleh petugas. Semua material yang akan diautoklaf
ditempatkan di dalam wadah yang tepat untuk pengumpulan. Pipet yang telah terpakai
ditempatkan dalam disinfektan. Dilarang membawa kultur ke luar ruangan
laboratorium. Hal ini dilakukan untuk meminimalkan tersebarnya mikroorganisme.

9. Untuk setiap kecelakaan kerja harus segera dilaporkan kepada pengawas (asisten, laboran,
atau dosen jaga) untuk segera diambil tindakan yang tepat.
10. Setelah selesai menjalankan praktikum, alat-alat harus dikembalikan dalam keadaan bersih
dan kering. Untuk alat-alat bekas mikroba sebelum dibersihkan harus disterilkan terlebih
dahulu (baca poin 8 di atas).
11. Laporan praktikum diserahkan setelah tiap acara praktikum selesai dengan format laporan
yang disediakan.
12. Setiap pelanggaran terhadap tata tertib akan dikenakan sanksi.

iii
 DAFTAR ISI

TATA TERTIB DAN PERATURAN ................................................................................................. ii

DAFTAR ISI................................................................................................................................ iv
JADWAL ACARA PRAKTIKUM.................................................................................................... v
PRAKTIKUM I. PENGENALAN DAN IDENTIFIKASI SEL PROKARIOT DAN EUKARIOT: A:
PENGAMATAN BAKTERI DAN JAMUR (KAPANG DAN KHAMIR); PENGENALAN SEL DAN JARINGAN
TANAMAN………………………………………………………………………………………………………………………………..1
PRAKTIKUM II. GOOD LABORATORY PRACTICES: A.PENIMBANGAN DAN PEMIPETAN……………….9
PAKTIKUM III. TEKNIK KERJA ASEPTIS: PEMINDAHBIAKAN ………………………………………………….13
PRAKTIKUM IV. SKRINING PRIMER UNTUK MEMPEROLEH JAMUR TANAH PENGHASIL ANTIBIOTIK
……………………………………………………………………………………………………………………………..18
PRAKTIKUM V. PENENTUAN NILAI KHM/KBM DENGAN METODE DILUSI CAIR
………………………………………………………………………………………………………………………………………….21
PRAKTIKUM VI. UJI ANGKA LEMPENG TOTAL DAN UJI ANGKA KAPANG/KHAMIR………………………24
PRAKTIKUM VII. UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI DENGAN METODE DIFUSI…………………………………………..29
PRAKTIKUM VIII. UJI SENSITIVITAS BAKTERI TERHADAP ANTIBIOTIK …………………………………………31
PRAKTIKUM IX. UJI MPN (MOST PROBABLE NUMBER) ……………………………………………………………..34
PRAKTIKUM X. UJI STERILITAS RUANGAN …………………………………………………………………………………38

iv
 JADWAL ACARA PRAKTIKUM BIOLOGI SEL - MIKROBIOLOGI FARMASI

WAKTU ACARA PRAKTIKUM

Minggu I Praktikum I : Pengenalan Dan Identifikasi Sel Prokariot Dan

Eukariot: A . Pengamatan Bakteri Dan Jamur (Kapang Dan
Khamir); B. Pengenalan Sel Dan Jaringan Tanaman
Praktikum II: Good Laboratory Practices: A.Penimbangan Dan
Pemipetan; B.Sterilisasi Dan Pembuatan Media
Minggu II Praktikum III: Teknik Kerja Aseptis: Pemindah Biakan
Praktikum IV: Skrining primer untuk memperoleh jamur tanah
yang menghasilkan antibiotik (tahap 1)
Praktikum V: Penentuan nilai KHM/KBM sampel (metode dilusi
cair)-- tahap 1
Minggu III Praktikum IV: Skrining primer untuk memperoleh jamur tanah
yang menghasilkan antibiotik (tahap 2)
Praktikum V: Penentuan KHM/KBM sampel (metode dilusi cair)--
tahap 2
Praktikum VI: Uji Angka Lempeng Total Dan Uji Angka
Kapang/Khamir
Minggu IV Praktikum IV: Skrining primer untuk memperoleh jamur tanah
yang menghasilkan antibiotik (tahap 3)
Praktikum VII: Uji aktivitas antibakteri dengan metode difusi
Praktikum VIII: Uji sensitvitas bakteri terhadap antibiotik
Praktikum IX: Uji MPN (tahap 1)
Minggu V Praktikum IX: Uji MPN (tahap 2)
Praktikum X: Uji sterilitas ruangan

Keterangan:
1. Sebelum memulai praktikum mahasiswa wajib menyerahkan tugas (PR, laporan dan
rencana kerja) kepada asisten jaga.
2. Setiap akan dimulai praktikum dilakukan pre-tes tertulis dengan topik praktikum
pada hari tersebut.
3. Responsi (ujian) praktikum dilakukan pada akhir praktikum.
4. Persentasen nilai praktikum terhadap nilai akhir mata kuliah adalah sebagai berikut:
 Pretest 5 %
 Laporan resmi: Pekerjaan dan hasil praktikum 10 %
 Responsi 10 %
5. Nilai Praktikum menjadi bagian dari nilai akhir mata kuliah Biologi Sel-Mikrobiologi
Farmasi, yaitu sebesar 25% (Proporsi nilai adalah 3 bagian nilai kuliah, 1 bagian nilai
praktikum).

v
 PRAKTIKUM I. PENGENALAN DAN IDENTIFIKASI SEL PROKARIOT DAN EUKARIOT:
A: PENGAMATAN BAKTERI DAN JAMUR (KAPANG DAN KHAMIR)

TUJUAN

Melihat morfologi sel dan koloni bakteri Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, dan
Escherichia coli. Melihat morfologi sel serta koloni jamur dan yeast: Aspergillus sp, Rhizopus sp.
dan Candida albicans.

PENDAHULUAN
Pengamatan Bakteri
Bakteri dapat diidentifikasi baik secara morfologi, biokimiawi maupun secara genetik
(molecular). Identifikasi bakteri secara morfologi dilakukan dengan mempelajari bentuk, ukuran
dan susunan sel. Perubahan lingkungan mungkin dapat sedikit mempengaruhi bentuk dan
ukuran sel, misalnya bakteri berbentuk batang dapat menjadi lebih pendek atau lebih panjang
dalam kondisi lingkungan tertentu, namun hampir tidak pernah terjadi perubahan dari bentuk
batang menjadi bentuk bulat atau sebaliknya.
Sebagian besar bakteri berbentuk silinder atau bulat. Bakteri silinder dapat berbentuk
lurus atau lengkung. Bentuk silinder lurus itu disebut rod (batang) bervariasi dari panjang tipis
hingga pendek tebal. Bentuk silinder lengkung juga bervariasi, pendek dan sedikit lengkung
menyerupai koma hingga spiral panjang. Disamping itu bakteri berbentuk batawng juga
bervariasi dalam tingkat keeratannya satu sama lain setelah pembelahan sel. Hal ini
menentukan apakah selnya berupa sel tunggal, berpasangan atau merupakan rantai panjang.
Pada bakteri berbentuk bulat atau coccus, sel-selnya dapat tampak berpasangan
(Diplococcus), rantai panjang (Streptococcus), berbentuk bujur sangkar (tetracoccus), berbentuk
kubus (Sarcina) atau tidak beraturan menyerupai buah anggur (Staphylococcus). Susunan sel ini
tidak sestabil bentuk sel karena susunan sel dapat berubah selama penanganan dan preparasi
sampel untuk pengamatan mikroskop.

1
 Gambar 1. Beberapa bentuk dan susunan sel bakteri .
(http://classroom.sdmesa.edu/eschmid/Lectur24.jpg, tanggal akses: 24 Januari 2017)

2
 Gambar 2. Beberapa morfologi koloni mikroba yang sering dijumpai
(https://classconnection.s3.amazonaws.com/868/flashcards/2086868/png/screen_shot_2012-
10-14_at_50751_pm1350248975925.png, tanggal akses: 24 Januari 2017).

Pengamatan Kapang dan Khamir

Morfologi Kapang
Kapang adalah fungi multiseluler yang berfilamen dan pertumbuhannya mudah dilihat
karena penampakannya yang berserabut seperti kapas. Kapang terdiri dari suatu thalus yang
tersusun dari filamen yang bercabang yang disebut hifa. Kumpulan dari hifa disebut miselium.
Hifa kapang dapat bersekat (disebut dengan septa) dan dapat pula tidak bersekat (konositik).
Kapang dengan hifa bersekat termasuk dalam kelas Ascomycetes, Basidiomycetes dan
Deuteromycetes. Sedangkan kapang yang konositik termasuk dalam kelas Phycomycetes.
Umumnya hifa kapang tidak berwarna (transparan).
Miselia mungkin memiliki bentuk spesifik, sehingga dapat dipakai dalam identifikasi,
misalnya: rhizoid pada Rhizoid sp, sel kaki pada Aspergillus sp atau percabangan bentuk Y pada
Geotrichum sp. Pada miselium vegetatif yang timbul di atas permukaan dapat ditemukan spora.
Dalam pengamatan morfologi kapang dengan mikroskop yang perlu diamati adalah :
1. Hifa : bersepta atau tidak, transparan atau keruh, berwarna atau tidak.
2. Spora seksual : oospora, askospora, basidiospora atau bentuk lainnya.
3. Spora aseksual: sporangiospora, konidiospora, arthrospora.

3
4. Badan buah: sprongium, bentuk, warna, letak, ukuran. Apabila menghasilkan konidia, perlu
ditentukan tipe konidianya.
5. Dasar badan buah: berupa kolumela, vesikula. Perlu ditentukan bentuk dan ukurannya.
6. Pendukung badan buah: tunggal atau dalam bentuk berkas, bercabang atau tidak.
7. Bentuk-bentuk khusus, misal: stolon, rhizoid, sel kaki, apofisa, klamidospora dan lain-lain.

Gambar 3. Morfologi kapang

(http://www.atsu.edu/faculty/chamberlain/Website/Lects/fungi2.jpg;
http://www.authorstream.com/Presentation/aSGuest136839-1439055-basic-mycology/,
tanggal akses: 24 Januari 2017).

4
Morfologi Khamir
Khamir (yeast) merupakan fungi uniseluler dan berkembang biak dengan tunas
(budding), pembelahan sel, spora aseksual maupun seksual. Ukuran sel khamir lebih besar dari
sel bakteri (+ 1-9 m x 2-50 m). Bentuk sel khamir bermacam-macam, ada yang berbentuk
botol atau membentuk miselium semu (pseudomiselium). Mikro struktur sel khamir terdiri atas
kapsul dinding sel, membran sitoplasma, nukleus, vakuola, mitokondria, globula lipida dan
sitoplasma.

ALAT DAN BAHAN

1. Preparat awetan dan biakan murni Bacillus subtilis, Streptococcus sp, Staphylococcus
aureus, dan Escherichia coli.
2. Preparat awetan dan biakan murni jamur: Aspergillus sp, Rhizopus sp.
3. Preparat awetan dan biakan murni yeast: Candida albicans.
4. Mikroskop cahaya
5. Minyak imersi

CARA KERJA:

1. Amati bentuk-bentuk sel bakteri, kapang dan khamir pada preparat awetan yang telah
disediakan dengan menggunakan mikroskop, mulailah dengan perbesaran lemah (5x) dan
dilanjutkan dengan perbesaran sedang (10x) hingga kuat (40x atau 100x menggunakan
minyak imersi).
2. Amati kenampakan koloni pada biakan murni bakteri, kapang dan khamir.
3. Buatlah gambar sel dilengkapi dengan keterangan yang diperlukan (nama , bentuk dan
ukuran sel, hifa, spora dan lain-lain dan beri keterangan yang diperlukan (nama preparat,
perbesaran yang dipakai, dan lain-lain)
4. Bersihkan minyak imersi pada lensa dengan menggunakan larutan xylol.

5
 B. PENGENALAN SEL DAN JARINGAN TANAMAN

TUJUAN
Mahasiswa mampu mengenal bagian, jenis-jenis sel dan jaringan tanaman

PENDAHULUAN
Sel tanaman, hewan dan manusia termasuk dalam kelompok sel eukariot. Dalam
penggunaannya di dunia farmasi dan kesehatan, sel tersebut dapat dikultur untuk dimanipulasi
atau direkayasa untuk tujuan tertentu.
Di dalam sel tumbuhan berbagai organela penyusun sel berperan dalam pembelahan
dan fungsi metabolisme sel. Inti sel atau nukleus sel tumbuhan misalnya mengendalikan semua
aktivitas sel. Kendali itu terletak pada struktur yang sama yaitu informasi genetik atau faktor
keturunan yang terkandung di dalam serat panjang DNA. Serat panjang DNA tersebut
bergabung dengan protein membentuk kromatin. Benang kromatin ini panjangnya dapat
mencapai 1-10 m dan harus berada di dalam nukleus yang hanya mempunyai diamater 10 m.
Selama pembelahan inti, bahan kromatin ini memadat sedemikian rupa dengan cara
menggulung ke arah panjangnya sehingga membentuk benda berwarna gelap yang disebut
kromosom. Jumlah kromosom untuk setiap sel tumbuhan berbeda-beda. Sehingga dengan
teknik pembuatan preparat akan dapat diketahui jumlah kromosom setiap tumbuhan.
Pemilihan organ tumbuhan yang bersifat meristematik dan mengetahui waktu terjadinya
mitosis untuk suatu jenis tumbuhan memegang peranan penting.

ALAT DAN BAHAN

1. Mikroskop, pipet mikro, dek glas, coverslip, Minyak imersi, Xylol, Kertas lensa,
blade/pisau
2. Bahan utama yang digunakan adalah ujung akar umbi bawang merah (Allium cepa),
hydrilla sp., Rhoe discolor. Bahan-bahan lain seperti larutan kolkisin, asam asetat
glasial, HCl, gliserin, larutan pewarna acetoorcein atau acetocarmin.

CARA KERJA
PENGAMATAN SEL TANAMAN
1. Pengamatan Mikroskop
a) Siapkan mikroskop, cari sumber pencahayaan yang baik dan cukup untuk pengamatan
specimen (disesuaikan dengan pengaturan cermin/lampu dan diafragma)

6
 b) Pasang preparat awetan pada meja benda dan dijepit dengan penjepit
c) Dengan perlahan-lahan naikkan tubus dengan pengatur tubus sekrup kasar sehingga
diperoleh gambaran obyek. Untuk mendapatkan gambaran yang paling jelas, naik-
turunkan tubus dengan hati-hati memakai pengatur tubus sekrup halus.
d) Bagian-bagian tertentu dari obyek dapat ditentukan dengan mengatur kedudukan
preparat. Kedudukan preparat dapat diatur dengan menggunakan sekrup-sekrup
pengatur meja preparat.
e) Mulailah pengamatan pada perbesaran lemah yang diikuti dengan perbesaran yang
lebih tinggi.
f) Gunakan minyak imersi pada pengamatan perbesaran tinggi dengan cara meneteskan
minyak imersi pada kaca penutup.
g) Amati preparat sample dan laporkan hasil pengamatan.
h) Setelah menggunakan mikroskop dengan minyak imersi, bagian lensa obyektif yang
terkena minyak imersi dibersihkan dengan xylol. Xylol diteteskan di atas kertas lensa
yang halus, kemudian diusapkan pada bagian yang terkena minyak imersi.
2. Kromosom
a) Fiksasi ujung akar umbi bawang merah pada pukul 07.00-09.00 WIB dengan cara akar
dipotong sepanjang 0,5-1,0 cm, kemudian direndam dalam larutan asam asetat glasial
45% selama 15 menit. Dilakukan pembilasan terhadap ujung akar umbi bawang merah
dengan akuades sebanyak 3 kali masing-masing 10 menit.
b) Ujung akar tersebut selanjutnya dihidrolisis dengan larutan HCl 1 N kemudian
dipanaskan di dalam thermostat 60o C selama 1-2 menit.
c) Setelah dihidrolisis, larutan HCl dibuang, diganti larutan acetoorcein atau acetocarmin.
Pewarnaan dilakukan selama 1 jam.
d) Diambil satu potong ujung akar, diletakkan di atas gelas benda yang sudah diberi 1
tetes gliserin kemudian ditutup dengan gelas penutup. Dilakukan penghancuran ujung
akar dengan cara men-squash.
e) Diamati di bawah mikroskop dengan perbesaran lemah, apakah tampak kromosom sel
yang dimaksud ? apakah tampak fase-fase mitosis ? Lanjutkan pengamatan dengan
perbesaran kuat.

3. Bagian sel
1). membran sel, dan plasmolisis/deplasmolisis (Bahan Rhoe discolor)
a) Sayatlah permukaan bagian daun Rhoe discolor (bagian berwarna ungu merah)

7
 b) Letakkan sayatan pada kaca objek yang telah ditetesi air dan tutuplah dengan cover
glass
c) Amati di bawah mikroskop, gambar
d) Apabila sel daun sudah tampak dengan jelas, teteskan larutan garam pada salah satu
tepi gelas penutup, dan pada tepi yang lain tempelkan kertas penghisap sehingga air
akan tertarik oleh kertas dan medium sayatan diganti oleh larutan garam
e) Amatilah dengan mikroskop selama kurang lebih 5 menit. Catatlah semua perubahan
yang terjadi terutama sewaktu terjadinya plasmolisis.
f) Gantilah larutan garam dengan air, kemudian amati lagi apa yang terjadi.

2). Nukleus, nukleous, sitoplasma dan membran sel (Allium cepa L)

a) Sayatlah permukaan bagian kulit bawang merah (Allium cepa)
b) Letakkan sayatan pada kaca objek yang telah ditetesi air dan tutuplah dengan cover
glass

c) Amati dibawah mikroskop, dan gambarlah pada lembar laporan praktikum

8
 PRAKTIKUM II. GOOD LABORATORY PRACTICES
A. PENIMBANGAN DAN PEMIPETAN

TUJUAN:
1. Melakukan penimbangan bahan kimia menggunakan alat timbang dengan benar
2. Menggunakan pipet mikro dengan benar

PENDAHULUAN
Bekerja di laboratorium membutuhkan teknik- teknik yang benar untuk menghindari eror dan
kesalahan yang bisa terjadi akibat kekeliruan dalam menimbang maupun menggunakan pipet.
Menimbang atau memipet yang tidak akurat dapat menyebabkan hasil penelitian menjadi tidak
reprodusible, larutan stok menjadi tidak akurat dan hasil penelitian menjadi tidak berarti. Perlu
dilakukan good practice, pemeliharaan dan pengetahuan cara menggunakan alat timbang dan
pipet ukur yang benar untuk memperoleh hasil penelitian yang sesuai.

BAHAN DAN ALAT YANG DIGUNAKAN

- Alas/Kertas timbang, alat timbang, pipet mikro, alat gelas

CARA KERJA
A.1. Penimbangan
1. Melihat dan mendengarkan demo cara menimbang dengan benar oleh dosen/asisten
jaga
2. Siapkan media yang akan ditimbang
Kelompok Jenis media Berat yang ditimbang
1 Nutrient Agar (NA) Untuk 50 ml media: 1 gram
2 Potato Dextrose Agar (PDA) Untuk 50 ml media: 1,95 gram
3 Nutrient Agar (NA) Untuk 50 ml media: 1 gram
4 Potato Dextrose Agar (PDA) Untuk 50 ml media: 1,95 gram
5 Nutrient Agar (NA) Untuk 50 ml media: 1 gram
6 Potato Dextrose Agar (PDA) Untuk 50 ml media: 1,95 gram

3. Hidupkan alat timbang, gunakan alat timbang sesuai dengan peruntukkannya

4. Gunakan alat timbang sesuai dengan instruksi yang ada
5. Timbang media sesuai dengan instruksi kerja
6. Bersihkan alat timbang dan sekitar alat timbang setelah selesai digunakan
A.2. Pemipetan
1. Mendengar dan melihat demo penjelasan cara menggunakan pipet mikro yang benar

9
 oleh dosen/asisten jaga (cara memilih ukuran volume, cara mengambil cairan, cara
mengeluarkan cairan, cara mengambil tips dan cara mengeluarkan tips)
2. Hal-hal yang tidak boleh dilakukan:
- mengambil pipet tips dengan menekan terlalu keras
- mengeluarkan tips dengan menarik terlalu keras ujung bawah pipet
- memutar indikator volume di luar range yang diperbolehkan

Praktek oleh mahasiswa:

3. Bersihkan pipet dengan etanol 70% sebelum digunakan
4. Putar indikator ukuran volume pada pipet ukur pada posisi 1000 µl.
5. Pindahkan aquadest ke botol timbang dan timbang dengan alat timbang, catat. Lakukan
10 kali (tiap mahasiswa dalam 1 kelompok harus melakukan pemipetan ini minimal 2
kali). Jika terdapat variasi lebih dari ± 0.5%, maka perlu dievaluasi cara pipetting dan
perlu latihan lagi.
6. Bersihkan pipet dengan etanol 70% setelah digunakan

Gambar 4. Pemipetan
(https://andyjconnelly.wordpress.com/2017/02/12/practical-pipetting-a-guide/;
tanggal akses, 15 Agustus 2018)

10
 B. STERILISASI DAN PEMBUATAN MEDIA
TUJUAN

1. Melakukan pembuatan media dan mempersiapkan peralatan untuk kerja mikrobiologi

2. Melakukan sterilisasi peralatan dan media dengan autoklaf

PENDAHULUAN

Media untuk pertumbuhan mikroba harus mengandung nutrisi dasar yaitu: sumber
karbon (C), sumber nitrogen (N), mineral (P, Mg, Ca, Na) dan vitamin. Berdasarkan
komposisinya media dapat digolongkan menjadi media sintetik dan media kompleks. Untuk
kegiatan rutin laboratorium biasanya digunakan media kompleks yang mampu menyediakan
nutrisi kompleks yang diperlukan mikroba. Salah satu contoh media kompleks adalah nutrien
Agar yang mengandung pepton dan beef extract. Pepton mengandung sedikit karbohidrat,
vitamin dan macam-macam asam amino dengan prosentase tergantung pada asal peptonnya.
Beef extract adalah ekstrak daging yang kaya akan nutrisi. Selain berfungsi untuk kultivasi
mikroba, media juga berfungsi untuk menyeleksi mikroba tertentu dan melakukan pengukuran
kuantitatif suatu antibiotik atau vitamin. Berdasarkan struktur fisiknya media dapat
dikelompokkan menjadi medium cair, padat dan setengah padat. Untuk membuat media padat
biasanya digunakan agar yang memadat pada suhu sekitar 400C.
Proses sterilisasi diperlukan untuk menghilangkan mikroba pada bahan dan alat yang
akan digunakan dalam kerja mikobiologi. Ada beberapa macam metode sterilisasi. Pemilihan
metode antara lain tergantung pada apa yang akan disterilisasi dan sifat bahan yang akan
disterilisasi.

BAHAN DAN ALAT YANG DIGUNAKAN:

1. Alat: Labu erlenmeyer, Pipet tetes, Gelas ukur, pH meter, Autoklaf

2. Bahan media: Nutrient Agar, Potato Dextrose Agar

CARA KERJA:

Pembuatan media
Media yang akan digunakan dibuat dengan cara sebagai berikut:
1. Media NA atau PDA yang sudah ditimbang sebelumnya (praktikum 2), dipindahkan ke
dalam labu Erlenmeyer 100 ml. Bahan media NA dan PDA sudah ditimbang untuk
pembuatan 50 ml media).

11
2. Larutkan media tersebut dalam sebagian aquadest
3. pH media diatur sesuai dengan yang dikehendaki (lihat pada kemasan media) dengan
menambahkan HCl atau NaOH.
4. Setelah pH sesuai, sisa aquadest ditambahkan dan dicampur homogen.
5. Tutup wadah media dengan kapas berbalut kassa kemudian alumunium foil.
6. Beri label yang berisi : nama media, tanggal pembuatan media, nama kelas_gol_kelp (misal
Kelas A_IV_7)
7. Sterilkan media dalam autoklaf pada suhu 1210C selama 15 menit.

Catatan:
1. Jika media yang telah steril tidak langsung digunakan dapat disimpan dalam refrigerator.
2. Untuk membuat media Agar miring, segera setelah sterilisasi selesai media dimiringkan
dengan kemiringan yang sesuai dan dibiarkan memadat.

12
 PRAKTIKUM III. TEKNIK KERJA ASEPTIS: PEMINDAH BIAKAN

TUJUAN
1. Mampu melakukan kerja aseptis
2. Memindahkan biakan dari satu media ke media lain
3. Melakukan teknik streaking dan spreading

PENDAHULUAN

Biakan murni (pure culture) sangat diperlukan dalam kegiatan mikrobiologi, misalnya
untuk keperluan diagnostik, karakterisasi mikroorganisme, industri mikrobiologi dan lain-lain.
Untuk mendapatkan kultur yang murni selain nutrisi dan lingkungan yang menunjang
pertumbuhan mikroorganisme tersebut juga perlu dicegah adanya kontaminan dalam biakan.
Untuk itu diperlukan suatu teknik aseptis.
Teknik aseptis sangat diperlukan untuk memindahkan biakan dari satu tempat ke
tempat lain. Dengan teknik aseptis seorang mikrobiologi berusaha mencegah terjadinya
kontaminasi pada biakan. Teknik aseptis juga mencegah seorang mikrobiologis terkontaminasi
dengan biakan yang mungkin bersifat patogen. Untuk menyempurnakan kerja aseptis, hal yang
perlu diperhatikan adalah: (1) Area tempat kerja dibersihkan dengan desinfektan: (2). Alat-alat
untuk keperluan kerja aseptis disterilisasi terlebih dahulu; (3). Pekerjaan dikerjakan secara
cepat dan efisien.
Teknik aseptis juga diperlukan dalam upaya pemindahbiakan. Biakan mikroba dapat
dipindahkan dari media padat ke media padat yang baru untuk menjaga fase pertumbuhan
mikroba, dari media padat ke media cair untuk tujuan fermentasi atau dari media cair ke media
padat untuk memperoleh kolon tunggal (single koloni).

ALAT DAN BAHAN

1. Alat: Lampu spiritus, Ose, mikropipet ukuran 20-200 uL, spreader glass
2. Bahan: Nutrient Agar miring, Nutrient Agar pada cawan petri, Kultur cair, Kultur pada agar
miring, Kultur yang akan ditanam adalah: Escherichia coli ATCC 25932; Staphylococcus
aureus ATCC 25923

13
CARA KERJA

Pemindahan biakan dari media cair ke media padat

1. Siapkan cawan petri berisi media Nutrient Agar
2. Buka tabung yang berisi kultur bakteri E. coli yang akan dipindahkan, panasi mulut tabung
dengan lampu spiritus.
3. Ambil kultur bakteri sebanyak 100 uL menggunakan mikropipet secara aseptis.
4. Buka cawan petri dan teteskan kultur tersebut pada bagian pinggir petri.
5. Lakukan streaking dengan menggunakan ose dengan arah goresan yang bersambung
secara kontinyu.
6. atau masukkan spreader glas dalam alcohol, panaskan pada burner, tempelkan pada
bagian dalam petri, dan sebarkan kultur bakteri dengan menggunakan spreader glass.
7. Tutup kembali cawan petri , beri label : Nama bakteri_Nama kelas_gol_kelp, tanggal praktikum
8. Inkubasi pada 370C sampai praktikum yang akan datang.

Pemindahan biakan dari media padat ke media padat

1. Buka tabung yang berisi kultur bakteri S. aureus, panasi mulut tabung dengan lampu spiritus
2. Panasi ose sampai merah.
3. Ambil sedikit biakan dari m e d i a A g a r miring, goreskan ke dalam tabung yang berisi
media Agar miring yang lain
4. Panasi kembali mulut tabung, tutup dengan kapas berbalut kasa dan alumunium foil,
panasi kembali tutupnya.
5. Beri label : Nama bakteri_Nama kelas_gol_kelp, tanggal praktikum
6. Inkubasi pada 370 untuk praktikum yang akan datang.

14
Teknik streaking

Teknik spreading/sebaran
Gambar 5. Teknik Streaking dan Spreading
(https://microbeonline.com/spread-plate-technique-principle-procedure-results/, tanggal akses
18 Agustus 2018); Grainger et al., 2001.

15
 Gambar 6. Teknik pemindahan biakan dari piring petri ke media Agar miring.
(http://www.arabslab.com/vb/uploaded/8_11195597457.jpg, tanggal akses: 24 Januari 2017).

16
 Gambar 7. Teknik pemindahan biakan antar Agar miring
(http://www.arabslab.com/vb/uploaded/8_21195597457.jpg, tanggal akses: 24 Januari 2017).

17
 PRAKTIKUM IV. SKRINING PRIMER UNTUK MEMPEROLEH
JAMUR TANAH PENGHASIL ANTIBIOTIK

TUJUAN
Setelah melakukan praktikum mahasiswa diharapkan:
1. Mampu melakukan berbagai teknik mikrobiologi dalam skrining (menanam, mengisolasi
dan memurnikan baikan, malakukan test terhadap kemampuan biakan menghasilkan
antibiotik)
2. Mendapatkan jamur yang menghasilkan antibiotik.

PENDAHULUAN

Saat ini mikroba tidak hanya dipandang sebagai organisma yang merugikan manusia
karena dapat menyebabkan penyakit, tetapi juga merupakan jasad yang dapat dimanfaatkan
bagi kesejahtaraan umat manusia. Telah diketahui bahwa mikroba dapat menghasilkan
berbagai macam produk yang bermanfaat bagi manusia seperti enzim, asam amino, protein,
vitamin dan antibiotik. Penemuan antibiotik penisilin oleh Alexander Fleming telah membuka
era baru dalam pencarian obat yang berasal dari mikroba.
Mikroba terseleksi yang dipergunakan dalam industri fermentasi dihasilkan dari proses
skrining (penapisan). Skrining dilakukan untuk mendapatkan mikroba yang potensial. Strain
(galur) terpilih merupakan penghasil antibiotik yang harus menghasilkan metabolit yang dapat
menghambat pertumbuhan atau reproduksi mikroba patogen tetapi tidak toksis terhadap
inang. Hasil yang positif dari proses skrining primer masih harus mengalami penelitian lebih
lanjut sampai menjadi antibiotik yang bisa dimanfaatkan. Mikroba terdapat dimana-mana
termasuk dalam tanah. Tanah merupakan sumber yang kaya akan mikroba. Banyak mikroba
yang diisolasi dari tanah berpotensial menghasilkan antibiotik yang digunakan sekarang.

ALAT DAN BAHAN

Tahap I
1. Petri (1)
2. Tabung reaksi (3)
3. Mikropipet ukuran 1 ml (1) dan yellow tip (5)
4. Spreader glass
5. Media selektif (Czapex dox/SDA/PDA dan antibiotik kloramfenikol)
6. Larutan salin
7. Sampel tanah kurang lebih 1 gram

18
 Tahap II
1. Petri (2)
2. Ose bulat
3. Labu Erlenmeyer 50 cc (2) untuk wadah mensterilkan media
4. Media pertumbuhan (Czapex dox/SDA/PDA)
Tahap III
1. Petri (2)
2. Labu Erlemeyer 50 cc (2) untuk wadah mensterilkan media
3. Pelubang gabus
4. Ose jarum
5. Media NA
6. Kultur mikroba uji (Gram positif S. aureus dan Gram negatif E. coli) dalam kaldu nutrien
yang ditanam sehari.

CARA KERJA
Tahap I
A. Penyiapan media
1. Cairkan media Czapex dox/SDA/PDA beku di atas kompor secara hati-hati sampai mencair
sempurna
2. Diamkan media sampai suhu kurang lebih mencapai 40-50oC
3. Masukkan larutan kloramfenikol 50 mg/L ke dalam media tersebut (dilakukan secara aseptis)
dan gojok sampai homogen
4. Tuangkan 10 ml media ke dalam petri steril, dan dibiarkan sampai memadat.

B. Penyiapan sampel

1. Suspensikan 1 gram sampel tanah dengan 10 mL larutan saline dalam tabung steril.

2. Ambil cairan sebanyak 1 ml, kemudian masukkan ke dalam tabung reaksi yang telah berisi 9
ml saline (pengenceran 10-1)

3. Ambil cairan pada langkah 2 (pengenceran 10-1) sebanyak 1 ml, kemudian masukkan ke dalam
tabung reaksi lain yang telah berisi 9 ml saline (pengenceran 10-2)

4. Ambil 0,5 mL suspensi pada langkah no 3 tersebut dan tuangkan dalam petri steril yang
telah dituangi media selektif padat (Czapex dox/SDA/PDA dengan ditambah antibiotik).
Ratakan dengan menggunakan spreader glass.

5. Cawan petri diberi label kemudian diinkubasi pada suhu kamar, sampai praktikum
berikutnya.
19
Tahap II
1. Cairkan media Czapex dox/SDA/PDA beku di atas kompor secara hati-hati sampai mencair
sempurna

2. Tuangkan 10 mL media ke dalam petri steril, dan dibiarkan sampai memadat.

3. Pilih salah satu koloni jamur yang tumbuh, diambil dengan ose, tanam dalam media
pertumbuhan
7. Beri label : Nama kelas_gol_kelp, tanggal praktikum
4. Inkubasi pada suhu kamar sampai praktikum berikutnya.

Tahap III
1. Cairkan media Nutrient Agar beku di atas kompor sampai mencair sempurna
2. Tunggu beberapa saat sampai tidak terlalu panas
3. Masukkan 100 uL bakteri uji/10 mL media (kelp 1-3 : E.coli, kelp 4-6 : S.aureus) pada media
(2)
4. Tuangkan 10 mL media ke dalam masing-masing cawan petri steril dan diamkan media
sampai membeku.
5. Buat 3 ‘plug’ (irisan) pada media yang ditumbuhi jamur (hasil praktikum tahap 2)
6. Pindahkan 3 plug koloni jamur tersebut ke media yang telah diinokulasikan dengan bakteri uji
8. Beri label : Nama bakteri_Nama kelas_gol_kelp, tanggal praktikum
9. Inkubasi pada suhu 370 C 24 jam dan amati adanya hambatan pada daerah sekitar plug

7. Catat hasil uji pada laporan sementara. Jika tampak ada zona hambatan/jernih di sekitar plug,
ukur diameternya kemudian dicatat.

20
 PRAKTIKUM V. PENENTUAN NILAI KHM/KBM SAMPEL DENGAN METODE DILUSI CAIR

TUJUAN
Setelah melakukan praktikum ini mahasiswa diharapkan dapat menentukan kadar hambat
minimum dan kadar bunuh minimum dari suatu sampel terhadap mikroba uji.

PENDAHULUAN
Penentuan potensi suatu senyawa yang diketahui memiliki aktivitas antimikroba melalui
uji difusi dapat dilakukan dengan menentukan Kadar Hambat Minimum (KHM) dan KBM (Kadar
Bunuh Minimum) senyawa tersebut. KHM dan KBM senyawa uji ditentukan dengan
menggunakan metode dilusi, baik dilusi padat maupun dilusi cair.
Metode ini dilakukan dengan membuat seri pengenceran senyawa uji dalam media dalam
tabung, dan selanjutnya ditambahkan dengan suspensi mikroba uji. Setelah masa inkubasi,
kemampuan senyawa dalam menghambat (bakteriostatik/fungistatik) atau membunuh
(bakterisidal/fungisidal) mikroba dapat ditentukan dengan mengamati kekeruhan larutan uji
dalam tabung. Nilai KHM ditentukan dari kadar terkecil senyawa uji yang mampu menghambat
pertumbuhan bakteri, ditunjukkan dengan kejernihan larutan. Nilai KBM biasanya dapat
diperoleh dengan meningkatkan kadar hambat minimum senyawa uji, dan dikonfirmasi dengan
cara menggoreskan larutan berisi sampel uji dari kadar terkecil yang menunjukkan kejernihan
larutan pada permukaan media Agar. Setelah masa inkubasi, tidak ditemukannya pertumbuhan
dari hasil goresan menujukkan bahwa senyawa uji pada kadar tersebut memiliki aktivitas
bakterisidal/fungisidal.

ALAT DAN BAHAN

Alat
1. Piring petri (1)

2. Mikropipet, blue tip dan yellow tip (5)

3. Tabung reaksi 5 mL sebanyak 5 buah

4. Gelas ukur 10 mL (1)

5. Ose

Bahan

1. Sampel berupa minyak atsiri kunyit dan daun cengkeh

2. Kontrol: media, pelarut (dimetilsulfoksida/DMSO), bakteri uji (S. aureus dan E.coli)

21
 3. Media Nutrient Broth

4. Suspensi bakteri uji (S. aureus dan E.coli) dalam kaldu nutrien (media Nutrient Broth) yang
ditanam sehari sebelumnya.

CARA KERJA
A. PENENTUAN NILAI KHM SAMPEL

1. Pembagian sampel untuk praktikum ini adalah sebagai berikut:

Kelompok Nama sampel Bakteri uji
1 Minyak atsiri kunyit Staphylococcus aureus
2 Minyak atsiri kunyit Escherichia coli
3 Minyak atsiri kunyit Staphylococcus aureus
4 Minyak atsiri cengkeh Escherichia coli
5 Minyak atsiri cengkeh Staphylococcus aureus
6 Minyak atsiri cengkeh Escherichia coli

2. Buat stok larutan minyak atsiri uji 100uL/mL dalam DMSO 10% (ambil 200 uL minyak atsiri
dalam 2 mL DMSO 10%).
3. Dalam tabung reaksi yang berisi 1 mL media NB, dibuat seri pengenceran sampel
(pengenceran kelipatan ½, two fold dilution) dalam media NB (Nutrient Broth), sehingga
diperoleh konsentrasi 50uL/mL, 25 uL/mL, 12.5 uL/mL dan 6,25 uL/mL.
4. Ke dalam masing-masing tabung, tambahkan 20 µL suspensi bakteri uji (Staphyloccocus
aureus atau Eschericia coli dalam larutan salin kadar 108 CFU/mL yang telah dibandingkan
kekeruhannya dengan standart Mc. Farland).
5. Dalam uji aktivitas ini juga digunakan:
a. kontrol pelarut, yaitu larutkan DMSO dalam media (sehingga konsentrasi DMSO 10%)
ditambah dengan 20 µL suspensi bakteri uji
b. kontrol media, yaitu media 2 mL tanpa penambahan suspensi bakteri.
6. Beri label : Nama kelas_gol_kelp, tanggal praktikum
7. Larutan uji dan kontrol yang telah dibuat diinkubasi selama 18-24 jam pada suhu 37°C.
Penentuan nilai kadar hambat minimum (KHM) dilihat pada kejernihan/kekeruhan larutan
dalam tabung yang telah diinkubasi. Nilai KHM merupakan konsentrasi terendah yang
mampu menghambat pertumbuhan bakteri yang ditandai dengan kejernihan larutan uji
dalam tabung reaksi.

B. PENENTUAN NILAI KBM SAMPEL

1. Cairkan media NA (Nutrient Agar) beku di atas kompor secara hati-hati sampai mencair
sempurna
2. Tuangkan 10 mL media ke dalam cawan petri steril dan dibiarkan sampai memadat
22
3. Inokulasikan bakteri uji pada tabung yang terlihat keruh (hasil praktikum sebelumnya)
dengan menggunakan ose steril pada media padat (langkah no 2)
4. Beri label : Nama kelas_gol_kelp, tanggal praktikum
5. Media selanjutnya diinkubasi selama 18-24 jam pada suhu 37°C. Hasil diamati dengan
melihat ada atau tidaknya koloni bakteri yang tumbuh pada media. Nilai KBM merupakan
konsentrasi terendah yang mampu membunuh pertumbuhan bakteri yang ditandai dengan
tidak adanya koloni pada media padat. Catat nilai KBM sampel.

Gambar 8. Skema dilusi cair (Murti, 2012)

23
 PRAKTIKUM VI: UJI ANGKA LEMPENG TOTAL DAN UJI ANGKA KAPANG/KHAMIR

TUJUAN
Pada akhir praktikum diharapkan mahasiswa dapat melakukan perhitungan
bakteri/kapang/khamir secara tidak langsung dan menetapkan cemaran bakteri yang terdapat
dalam sediaan makanan, minuman, kosmetika, obat atau obat tradisional.

PENDAHULUAN

Uji angka lempeng total merupakan metode yang umum digunakan untuk menghitung
adanya bakteri yang terdapat dalam sediaan yang diperiksa. Uji angka lempeng total dapat
dilakukan dengan dua teknik yaitu teknik cawan tuang (pour plate) dan teknik sebaran (spread
plate). Pada prinsipnya dilakukan pengenceran terhadap sediaan yang diperiksa kemudian
dilakukan penanaman pada media lempeng agar. Jumlah koloni bakteri yang tumbuh pada
lempeng agar dihitung setelah inkubasi pada suhu dan waktu yang sesuai. Perhitungan
dilakukan terhadap petri dengan jumlah koloni bakteri antara 30-300. Angka lempeng total
dinyatakan sebagai jumlah koloni bakteri hasil perhitungan dikalikan faktor pengencer.
Angka kapang/khamir menunjukkan adanya cemaran kapang/khamir dalam sediaan
yang diperiksa. Setiap sediaan mensyaratkan batas angka kapang/khamir tertentu yang masih
dianggap aman. Perhitungan dilakukan terhadap petri dengan jumlah koloni 40-50 buah. Angka
kapang/khamir dinyatakan sebagai jumlah koloni kapang/khamir hasil perhitungan dikalikan
faktor pengenceran.

ALAT DAN BAHAN

5. Alat- Alat: petri (7), Tabung reaksi (6), Labu Erlenmeyer untuk wadah mensterilkan media,
Blue Tip (15), Gelas ukur 10 ml (1); AKK: Tabung reaksi (4), Petri (6), Blue tip (10), Gelas
ukur 10 ml (1)
6. Bahan: Sampel yang diperiksa (serbuk jamu), Medium Plate Count Agar (PCA) dan larutan
fisiologis, Medium PDA (Potato Dextrosa Agar) mengandung kloramfenikol 100 ml/l,
larutan ASA (Air Suling Agar 0,05%)

24
CARA KERJA

Angka Lempeng Total (Praktikum ini hanya dilakukan oleh kelompok 1 dan 2)
1. Kelompok 1 menimbang 1 gram sampel yang akan diuji kemudian disuspensikan dalam
10 mL larutan ASA.
2. Lakukan pengenceran sampai 10-6 . Untuk efisiensi dalam pengerjaan, dalam praktikum ini
dikerjakan bersama dengan kelompok lain dengan dengan pembagian kerja sebagai berikut:

Kelompok Pengenceran Cara kerja

1 10-1 Ambil 1 ml larutan (1) dan dimasukkan pada tabung reaksi yang
berisi ASA 9 ml, campur hingga homogen
10-2 Ambil 1 ml larutan 10-1 dan dimasukkan pada tabung reaksi
yang berisi ASA 9 ml, campur hingga homogen
10-3 Ambil 1 ml larutan 10-2 dan dimasukkan pada tabung reaksi
yang berisi ASA 9 ml, campur hingga homogen
2 10-4 Ambil 1 ml larutan 10-3 dan dimasukkan pada tabung reaksi
yang berisi ASA 9 ml, campur hingga homogen
10-5 Ambil 1 ml larutan 10-4 dan dimasukkan pada tabung reaksi
yang berisi ASA 9 ml, campur hingga homogen
10-6 Ambil 1 ml larutan10-5 dan dimasukkan pada tabung reaksi yang
berisi ASA 9 ml, campur hingga homogen

3. Cairkan media PCA beku di atas kompor secara hati-hati sampai mencair sempurna
4. Dibiarkan sampai mencapai suhu sekitar 40-50oC.
5. Tuang sebanyak 1 ml suspensi tiap hasil pengenceran di atas cawan petri.
6. Ke dalam setiap cawan petri tersebut dituangkan 10 mL medium PCA (suhu + 40-500C),
kemudian dihomogenkan dan dibiarkan memadat
7. Petri diinkubasi pada suhu 370 C selama 24 jam dalam posisi terbalik.
8. Lakukan penghitungan koloni bakteri yang tumbuh pada cawan petri. Tuliskan semua jumlah
koloni yang tumbuh per pengenceran (data digabungkan dari kelompok 1 dan 2). Angka
lempeng total dihitung dengan ketentuan seperti di bawah ini.

Cara Perhitungan Angka Lempeng Total

Dipilih cawan petri dari satu pengenceran yang menunjukkan jumlah koloni antara 30–
300. Jumlah koloni rata-rata dari kedua cawan petri dihitung lalu dikalikan dengan faktor
pengencernya. Hasil dinyatakan sebagai Angka Lempeng Total dalam tiap gram contoh. Untuk
beberapa kemungkinan lain yang berbeda dari pernyataan di atas, maka diikuti petunjuk
sebagai berikut:
1. Bila hanya salah satu diantaranya kadua cawan petri dari pengenceran yang sama
menunjukkan jumlah antara 30–300 koloni, dihitung rata-rata dari kedua cawan dikalikan

25
 dengan faktor pengenceran.
2. Bila pada cawan petri dari kedua tingkat pengenceran yang berurutan menunjukkan jumlah
antara 30–300 koloni, maka dihitung jumlah koloni dan dikalikan faktor pengencer
kemudian diambil angka rata-rata. Jika pada tingkat pengenceran yang lebih tinggi didapati
koloni yang lebih besar dua kali jumlah koloni pada pengenceran dibawahnya, maka dipilih
tingkat pengenceran terendah.
3. Bila dari seluruh cawan petri tidak satupun yang menunjukkan 30–300 koloni, maka dicatat
angka sebenarnya dari tingkat pengenceran terendah dan dihitung sebagai Angka Lempeng
total perkiraan.
4. Bila tidak ada pertumbuhan pada semua cawan petri dan bukan disebabkan karena
inhibitor, maka Angka Lempeng total dilaporkan sebagai kurang dari satu dikalikan dengan
faktor pengencer paling rendah
5. Bila jumlah koloni per cawan lebih dari 300, maka cawan dengan tingkat pengenceran
tertinggi dibagi dalam beberapa sektor (2, 4 atau 8). Jumlah koloni dikalikan dengan faktor
pembagi dan faktor pengencerannya. Hasil dilaporkan sebagai Angka Lempeng Perkiraan.
6. Bila jumlah koloni lebih dari 200 pada 1/8 bagian cawan, maka jumlah koloni adalah 200 x 8
x faktor pengenceran. Angka lempeng total perkiraan dihitung sebagai lebih besar dari
jumlah koloni yang diperoleh.

Persyaratan
Lihat peraturan KaBPOM terbaru

Angka Kapang/Khamir (hanya dikerjakan oleh kelompok 3-6)

CARA KERJA

1. Kelompok 3 menimbang 1 gram sampel yang akan diperiksa kemudian disuspensikan

dalam 10 ml larutan pengencer (ASA)
2. Lakukan pengenceran sampai 10-4. Untuk efisiensi dalam pengerjaan, dalam praktikum ini
dikerjakan bersama dengan kelompok lain dengan pengaturan sebagai berikut:
Kelompok Pengenceran Cara kerja
3 dan 5 10-1 Ambil 1 ml larutan (1) dan dimasukkan pada tabung reaksi yang
berisi ASA 9 ml, campur hingga homogen
10-2 Ambil 1 ml larutan 10-1 dan dimasukkan pada tabung reaksi
yang berisi ASA 9 ml, campur hingga homogen
4 dan 6 10-3 Ambil 1 ml larutan 10-2 dan dimasukkan pada tabung reaksi
yang berisi ASA 9 ml, campur hingga homogen
10-4 Ambil 1 ml larutan 10-3 dan dimasukkan pada tabung reaksi
yang berisi ASA 9 ml, campur hingga homogen
26
3. Cairkan media PDA di atas kompor secara hati-hati sampai mencair sempurna
4. Tuangkan 10 mL media ke dalam cawan petri steril dan dibiarkan sampai memadat
5. Dari masing-masing pengenceran dipipet 1 mL kemudian dituangkan pada permukaan
medium PDA, segera diratakan dengan spreader glass. Sebagai kontrol digunakan medium
PDA dan larutan pengencer yang dituangkan pada media PDA
6. Seluruh cawan petri diinkubasi pada suhu 20-25°C dan diamati pada hari ketiga sampai ke-
7. Jumlah koloni yang tumbuh diamati dan dihitung. (data yang diperoleh merupakan data
gabungan kelompok 3-4. dan 5-6).
8. Angka kapang/khamir dihitung dengan ketentuan seperti di bawah ini.

Cara Perhitungan Angka Kapang

Dipilih cawan petri dari satu pengenceran yang menunjukkan jumlah koloni antara 40-
60. Jumlah koloni dari kedua cawan petri dihitung kemudian dikalikan dengan faktor
pengencerannya. Bila pada dua cawan petri pada dua tingkat pengenceran dan berturutan
menunjukkan jumlah antara 40-60, maka dihitung jumlah koloni dan dikalikan faktor
pengenceran kemudian diambil rata-rata. Angka diambil dinyatakan sebagai angka
kapang/khamir dalam tiap gram contoh. Untuk beberapa kemungkinan lain yang berbeda dari
pernyataan di atas, maka diikuti petunjuk sebagai berikut:
1. Bila hanya salah satu diantara kedua cawan petri dari pengenceran yang sama
menunjukkan jumlah koloni antara 40-60 buah, dihitung jumlah koloni dari kedua cawan
dan dikalikan dengan faktor pengenceran.
2. Bila pada tingkat pengenceran yang lebih tinggi didapat jumlah koloni labih besar dari dua
kali jumlah koloni pada pengenceran dibawahnya, maka dipilih tingkat pengenceran
terendah.
3. Bila dari seluruh cawan petri tidak ada satu pun yang menunjukkan jumlah antara 40-60
koloni, maka dicatat angka sebenarnya dari tingkat pengenceran terendah dan dihitung
sebagai angka kapang/khamir perkiraan.
4. Bila tidak ada pertumbuhan pada semua cawan dan bukan disebabkan faktor inhibitor,
maka angka kapang/khamir dilaporkan sebagai kurang dari satu dikalikan faktor
pengenceran.

Contoh cara perhitungan:

Misalkan pada pengenceran 10-4 terdapat sebanyak 40 koloni maka angka kapang/khamir
adalah 40 x 104 = 40.104 koloni pergram sampel.

27
Persyaratan :
Lihat peraturan KaBPOM terbaru

28
 PRAKTIKUM VII. UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI DENGAN METODE DIFUSI

TUJUAN

Pada akhir praktikum mahasiswa diharapkan dapat melakukan mengenal teknik-teknik yang
umum dilakukan dalam uji mikrobiologi khususnya metode difusi dan menggunakannya untuk
uji aktivitas antimikroba.

PENDAHULUAN

Beberapa teknik uji mikrobiologi umum dilakukan dalam dunia farmasi, beberapa
diantaranya adalah: A. Metode difusi, B. Metode dilusi cair, C. Metode dilusi padat. Metode
difusi menggunakan media uji padat dan sampel dapat diaplikasikan dengan cakram kertas,
sumuran atau silinder logam. Prinsip dasar metode ini adalah zat aktif yang ada dalam
pembawa akan berdifusi ke media Agar (padat) disekitar tempat aplikasi secara radial.
Kemampuan difusi zat aktif ditentukan oleh kelarutan dan ukuran partikel dari zat aktif.
Mikroba uji yang terkena zat aktif dan susceptible (terpengaruh) akan terhambat
pertumbuhannya membentuk zona irradikal atau mati membentuk zona radikal. Ukuran dari
kedua zona itu disebut sebagai diameter hambatan.

ALAT DAN BAHAN

1. Alat: Petri, Gelas ukur 10 ml, Pinset, Pipet dan tips, Jangka sorong, paper disc
2. Bahan:minyak atsiri, Media NA atau Mueller Hilton, Mikroba (Staphylococcus aureus, dan
Eschericia coli), DMSO

CARA KERJA

1. Ambil 50 uL minyak atsiri diencerkan dengan 950 uL DMSO 10%. Campur sampai homogen
2. Ambil 500 uL larutan (1) dan diencerkan dengan 500 uL DMSO 10%. Campur sampai
homogen
3. Ambil 500 uL larutan (2) dan diencerkan dengan 500 uL DMSO 10%. Campur sampai
homogen
4. Cairkan media NA beku di atas kompor dengan hati-hati sampai mencair sempurna
5. Diamkan dan tunggu suhunya hingga mencapai ± 40-50oC
6. Ambil 100 uL bakteri uji (untuk 10 mL media) dan masukkan ke dalam media (2), labu
erlenmeyer digoyangkan agar campur homogen (kelompok 1-3 menggunakan bakteri E. coli ,
29
 kelompok 4-6 menggunakan bakteri S. aureus)
7. Segera tuang 10 mL media ke dalam cawan Petri dan diamkan hingga memadat.
8. Ambil paper disc dan diletakkan di permukaan media, kemudian ambil sebanyak 10 µL
sampel yang akan diuji dan diteteskan pada permukaan paper disc, atau ambil paper disc
kemudian sebanyak 10 µL sampel yang diuji, diteteskan pada permukaan paper disc
biarkan sampai mengering, lalu letakkan paper disc pada permukaan media. Pengujian juga
dilakukan untuk kontrol positif (antibiotik yang sudha disiapkan) dan kontrol negatif
(pelarut yang digunakan) dengan cara yang sama dengan aplikasi sampel di atas.
8. Beri label : Nama kelas_gol_kelp, tanggal praktikum
9. Inkubasi pada suhu 37o C selama 24 jam pada posisi cawan petri terbalik.
10. Zone jernih/hambat yang terbentuk di sekeliling paper disc diukur diameternya
menggunakan jangka sorong. Jika kontrol negatif juga menunjukan adanya aktivitas yang
ditandai dengan adanya zone jernih di sekitar paper disc, digunakan sebagai faktor koreksi.

Gambar 9 . Skema uji antibakteri dengan metode difusi (Benson, 2001).

30
 PRAKTIKUM VIII. UJI SENSITIVITAS BAKTERI TERHADAP ANTIBIOTIK

TUJUAN:
Mahasiswa mampu melakukan uji sensitifitas dan menginterpretasikan hasilnya.

PENDAHULUAN
Pesatnya kemunculan bakteri resisten terjadi di seluruh dunia, sehingga membahayakan
kemanjuran antibiotik, yang telah mengubah dunia kedokteran dan penyelamatan jutaan nyawa
manusia. Beberapa dekade setelah pasien pertama diobati dengan antibiotik, infeksi bakteri
kembali menjadi ancaman. Krisis resistensi antibiotik telah dikaitkan dengan penggunaan
berlebihan dan penyalahgunaan obat-obatan ini, serta kurangnya pengembangan obat baru oleh
industri farmasi.
Isolasi bakteri dari sampel klinis akan menghasilkan informasi yang dapat digunakan untuk
memandu pemilihan rejimen antibiotik yang tepat berdasarkan pengetahuan tentang profil
sensitivitas spesies bakteri tertentu yang paling mungkin. Melalui penggunaan uji sensitivitas
antimikroba in vitro, laboratorium dapat secara spesifik menentukan antibiotik mana yang secara
efektif menghambat pertumbuhan isolat bakteri tertentu, sehingga memungkinkan dilakukannya
terapi yang ditargetkan. Resistensi antimikroba menjadi perhatian yang berkembang baik di
komunitas maupun di lingkungan perawatan kesehatan; dengan demikian, keputusan
pengobatan antibiotik empiris menjadi lebih rumit, dan pentingnya pengujian sensitivitas
antimikroba secara rutin untuk memandu keputusan terapeutik telah meningkat.
Uji resistensi merupakan pengujian yang dilakukan untuk mengetahui kepekaan bakteri
terhadap suatu antibiotik. Penggunaan antibiotik yang berlebih atau tidak terkendali menyebabkan
efek samping yang berbahaya, yang menyebabkan bakter-bakteri tertentu resisten (tahan)
terhadap antibiotik.
Terdapat berbagai metode untuk pengujian sesitifitas ini, termasuk metode konvensional,
sistem otomatis, dan teknik molekuler yang lebih baru. Memahami metode ini memungkinkan
dokter untuk menafsirkan dengan benar hasil pengujian sensitivitas yang dilaporkan oleh
laboratorium mikrobiologi klinis. Secara umum, metode pengujian kepekaan antimikroba yang
digunakan di laboratorium klinis harus:
1. Memberikan informasi yang cepat dan akurat kepada dokter
2. Relatif murah
3. Relatif mudah untuk dilakukan

ALAT DAN BAHAN

31
1. Alat: cawan petri (1), gelas ukur, pinset
2. Bahan: antibiotic discs, bakteri E.coli dan S. aureus

CARA KERJA
1. Cairkan media NA beku di atas kompor dengan hati-hati sampai mencair sempurna
2. Diamkan dan tunggu suhunya hingga mencapai ± 40-50oC
3. Ambil 100uL bakteri uji (untuk 10 mL media) dan masukkan ke dalam media (2), labu erlenmeyer
digoyangkan agar campur homogen (kelompok 1-3 menggunakan bakteri E. coli , kelompok 4-6
menggunakan bakteri S. aureus)
4. Segera tuang 10 mL media ke dalam cawan petri dan diamkan hingga memadat.
5. Letakkan antibiotic discs pada permukaanmedia. Antibiotik yang digunakan diatur sebagai
berikut:
Kelompok Nama bakteri Jenis antibiotik yang digunakan
1 E.coli Vankomisin, klindamisin, rifampin
2 E.coli Vankomisin, klindamisin, rifampin
3 E.coli Vankomisin, klindamisin, rifampin
4 S. aureus Amoksisilin, ampisilin, streptomisin
5 S. aureus Amoksisilin, ampisilin, streptomisin
6 S. aureus Amoksisilin, ampisilin, streptomisin

6. Beri label : Nama kelas_gol_kelp, tanggal praktikum

7. Inkubasi cawan petri pada suhu 37oC selama 18-24 jam
8. Ukur diamater zona jernih di sekitar antibiotic disc, dan interpetasikan hasil pengujian
tersebut menggunakan tabel di bawah.

Gambar 10. Teknik uji sensitivitas

(https://microbenotes.com/kirby-bauer-disc-diffusion/, diakses 10 Maret 2023)

32
Tabel 1. interpretasi hasil uji sensitivitas bakteri E. coli terhadap beberapa antibiotik standar

Tabel 2. interpretasi hasil uji sensitivitas bakteri S. aureus terhadap beberapa antibiotik standar

33
 PRAKTIKUM IX. UJI MPN (Most Probable Number)

TUJUAN:
Mahasiswa mampu melakukan uji sensitifitas dan menginterpretasikan hasilnya.

PENDAHULUAN
Most Probable Number (MPN) digunakan untuk memperkirakan konsentrasi mikroorganisme
yang hidup dalam suatu sampel dengan cara mereplikasi pertumbuhan kaldu cair dalam
pengenceran sepuluh kali lipat. Ini biasanya digunakan dalam memperkirakan populasi mikroba di
tanah, air, dan produk pertanian. Uji MPN khususnya berguna pada sampel yang mengandung
bahan partikulat yang mengganggu metode penghitungan jumlah pelat.
MPN paling sering diterapkan untuk pengujian kualitas air, yaitu untuk memastikan apakah air
tersebut aman atau tidak dari segi bakteri yang ada di dalamnya. Sekelompok bakteri yang biasa
disebut fecal coliform bertindak sebagai indikator kontaminasi tinja pada air. Kehadiran bakteri
koliform fekal yang sangat sedikit mengindikasikan bahwa air kemungkinan besar tidak
mengandung organisme penyebab penyakit, sedangkan keberadaan bakteri koliform fekal dalam
jumlah besar menunjukkan kemungkinan besar bahwa air tersebut mengandung organisme
penyebab penyakit sehingga air tersebut tidak aman untuk dikonsumsi.
Air yang akan diuji diencerkan secara serial dan diinokulasi dalam Lactose Broth, koliform jika
ada dalam air akan memanfaatkan laktosa yang ada dalam medium untuk menghasilkan asam dan
gas. Adanya asam ditunjukkan dengan perubahan warna medium dan adanya gas terdeteksi
melalui gelembung-gelembung gas yang terkumpul dalam tabung Durham terbalik yang ada di
dalam medium. Jumlah total koliform ditentukan dengan menghitung jumlah tabung yang
memberikan reaksi positif (yaitu perubahan warna dan produksi gas) dan membandingkan pola
hasil positif (jumlah tabung yang menunjukkan pertumbuhan pada setiap pengenceran) dengan
tabel statistik standar.
Tes MPN dilakukan dalam 3 langkah : Tes dugaan (Presumptive Test), Tes konfirmasi
(Confirmation Test) dan Tes selesai (Complete Test).
Tes dugaan adalah screening test untuk mengambil sampel air untuk mengetahui keberadaan
organisme koliform. Jika uji dugaan negatif, pengujian lebih lanjut tidak dilakukan, dan sumber air
dianggap aman secara mikrobiologis. Namun, jika ada tabung dalam rangkaian pengujian tersebut
menunjukkan asam dan gas, air tersebut dianggap tidak aman dan pengujian yang dikonfirmasi
lebih lanjut dilakukan pada tabung yang menunjukkan reaksi positif.
Beberapa mikroorganisme selain koliform juga menghasilkan asam dan gas dari fermentasi
laktosa. Untuk memastikan adanya koliform, dilakukan uji konfirmasi dengan menggunakan media
34
lain. Jika dari tes konfirmasi ini menunjukkan hasil positif maka dilanjutkan dengan tes lengkap,
karena beberapa hasil positif dari tes konfirmasi mungkin salah. Untuk ini inokulum dari
masing-masing tabung positif uji konfirmasi digoreskan pada cawan EMB atau agar Endo.

ALAT DAN BAHAN

1. Alat : tabung reaksi, tabung durham, mikropipet dan yellow tip
2. Bahan: media Lactose Broth (LB), media Brilliant Green Lactose Broth (BGLB), sampel air

CARA KERJA
TAHAP 1
1. Lakukan pengenceran sampel sampai 10-2. Ambil 1 ml sampel diencerkan dengan 9 mL ,
kemudian dicampur hingga homogen. Larutan ini merupakan larutan pengenceran 10 -1.
Kemudian larutan diambil 1 mL dan diencerkan kembali dengan 9 mL media untuk
mendapatkan larutan pengenceran 10-2.
2. Siapkan 9 tabung reaksi yang masing-masing berisi 9 ml media Lactose broth yang telah berisi
tabung durham
3. Ambil 1 mL larutan sampel yang belum diencerkan dan masukkan ke dalam 3 tabung yang
berisi media LB 9 mL. Hal ini dilakukan juga untuk sampel yang telah diencerkan 10-1 dan 10-2
4. Inkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam. Amati adanya tabung yang memberikan hasil positif
(pada tabung durham terlihat ada ruang gas/udara), dan disimpan di refrigerator untuk
praktikum selanjutnya.

TAHAP 2
1. Selanjutnya dilakukan konfirmasi terhadap hasil tersebut dengan cara: tanam 1 ose kultur
yang diduga mengandung coliform pada 3 tabung media BGLB (untuk tiap pengenceran yang
menunjukkan hasil positif pada tahap awal/skrining).
2. Inkubasi kembali pada suhu 37oC selama 24-48 jam.
3. Catat jumlah tabung yang menunjukkan adanya gas dan hasil angka bakteri koliform
didapatkan dari tabel MPN yang memberikan nilai duga terdekat dengan kombinasi tabung
yang positif dan tabung yang negatif pada uji konfirmasi.

35
CATATAN
Untuk praktikum IX ini, 3 kelompok (1-3 dan 4-6) akan bekerjasama untuk mengerjakan 1 seri
pengujian.

Kelompok Tugas
1 Memasukkan masing-masing 1 ml sampel yang belum
diencerkan ke dalam 3 tabung berisi media LB
2 Mengencerkan sampel menjadi 10-1 (lihat cara kerja di
atas)
Memasukkan masing-masing 1 ml sampel yang
tersebut ke dalam 3 tabung berisi media LB
3 Mengencerkan sampel menjadi 10-2 (lihat cara kerja di
atas)
Memasukkan masing-masing 1 ml sampel yang
tersebut ke dalam 3 tabung berisi media LB
4 Memasukkan masing-masing 1 ml sampel yang belum
diencerkan ke dalam 3 tabung berisi media LB
5 Mengencerkan sampel menjadi 10-1 (lihat cara kerja di
atas)
Memasukkan masing-masing 1 ml sampel yang
tersebut ke dalam 3 tabung berisi media LB
6 Mengencerkan sampel menjadi 10-2 (lihat cara kerja di
atas)
Memasukkan masing-masing 1 ml sampel yang
tersebut ke dalam 3 tabung berisi media LB

36
Gambar 11. Teknik Uji MPN (https://almerja.net/reading.php?idm=40269, diakses 7 Mei 2023)

Tabel 3. Estimasi jumlah koliform menggunakan metode MPN 3 tabung

37
38
 PRAKTIKUM X. UJI STERILITAS RUANGAN

TUJUAN
Mahasiswa mampu melakukan pengujian sterilitas ruangan serta mampu menginterpreatasikan
hasil pengujiannya.

PENDAHULUAN
Pemantauan udara mikroba adalah proses pengambilan sampel dan menganalisis kontaminasi
mikroba di udara. Ini merupakan langkah penting dalam pengendalian kualitas produsen di industri
farmasi, kosmetik, makanan dan minuman. Kualitas udara memainkan peran penting dalam
lingkungan aseptik, ruang bersih, dan area produksi, di mana mikroorganisme di udara berpotensi
menimbulkan risiko kontaminasi silang pada bahan mentah dan produk akhir.
Kebutuhan akan pemantauan udara aktif yang efisien semakin meningkat seiring dengan
meningkatnya peraturan dan standar untuk produk farmasi, makanan, dan minuman. Dalam
industri-industri ini, kualitas lingkungan produksi berhubungan langsung dengan kualitas produk
jadi. Pemantauan udara aktif menentukan jumlah organisme yang dapat bertahan hidup per meter
kubik udara, dan merupakan bagian dari pengujian rutin berkelanjutan selama proses produksi.
Ada 2 metode yang dapat digunakan untuk memantau tersebut:
1. Metode aktif. Dalam pemantauan aktif sampler udara mikrobiologis secara fisik menarik volume
udara yang diketahui melalui alat pengumpul partikel yang dapat berupa cairan atau media kultur
padat atau membran nitroselulosa dan jumlah mikroorganisme yang ada diukur denganCFU
(colony forming unit)/m3 udara. Sistem ini dapat diterapkan ketika konsentrasi mikroorganisme
sedang tidak terlalu tinggi.
2. Metode pasif. Pemantauan pasif menggunakan settle plate, yaitu cawan petri yang berisi media
kultur, yang terkena udara selama waktu tertentu untuk dikumpulkan partikel biologis yang
“mengendap” keluar dan kemudian diinkubasi. Hasil dinyatakan dalam CFU/pelat/waktu atau
dalam CFU/m2 /jam. Apabila hasil pengujian positif adanya cemaran mikroba di udara, terutama
pada daerah kritis, dilanjutkan dengan uji identifikasi untuk mengetahui genus mikroorganisme
tersebut.

CARA KERJA
1. Tentukan jumlah titik pemantauan dengan rumus = √luas area (m 2), contoh: luas area 10 m2 ,
maka jumlah titik pemantauan ada 3,3 dibulatkan menjadi 4 titik pemantauan. Letak titik
pemantauan ditetapkan berdasarkan analisis risiko pada titik yang paling mungkin dan paling
berdampak pada hasil produksi ataupun pengujian.
39
2. Cairkan media NA/TSA beku sampai mencair sempurna, kemudian tuangkan 10 mL pada piring
petri steril dan diamkan memadat.
3. Lakukan pemaparan cawan petri selama 4 jam (dalam praktikum ini cukup 30 menit) di
tempat yang telah ditentukan.
4. Letakkan tutup cawan disamping media yang berisi media pembiakan (seperti pada gambar
12). Inkubasi pada 35-37oC selama 48 jam, Hitung jumlah bakteri yang tumbuh.
5. Lanjutkan inkubasi pada 20 – 25oC (suhu kamar) selama 4 hari dan jamur yang tumbuh pada
setiap cawan dan catat dalam laporan.

Gambar 12. Cara meletakkan cawan petri pada metode pasif settle plate
(https://www.pharmaceuticalsky.com/2021/12/sop-for-air-settling-plates-technique.html#:~:text=Settle%20
Plate%20Method,of%20settled%20bacteria%2Dcontaining%20particles, diakses Mei 2023)

Tabel 4. Batas cemaran mikroba yang diperbolehkan untuk ruangan A-D

40
 DAFTAR PUSTAKA
Anonim, 1992, Prosedur Operasional Baku Pengujian Mikrobiologi. Pusat Pemeriksaan Obat dan
Makanan. Direktorat Jendral Pengawasan Obat dan Makanan Departemen Kesehatan RI,
14-15, 21-25
Anonim. 2014, Farmakope Indonesia, Edisi 5, Departemen Kesehatan RI.
Atlas, R.M., Brown, A.E., Dobra, K.W., and Lionas, M., 1989, Experimental Microbiology
Fundamental & Aplication, MacMillan Publishing Company, New York.
Bangun, A., 1989, Isolasi & Identifikasi, PAU Bioteknologi UGM, Yogyakarta.
Benson, 2001, Microbiological Applications Lab Manual, Eighth Edition, The McGraw−Hill.
Browne, L.M. & Szenthe N.A., 1989, Laboratory Manual For Microbiology. 2nd ed, Department of
Chemistry University of Alberta, Canada.
Connely, A., 2017, Practical Pippeting: A guide, Laboratory Techniques, Science,
(https://andyjconnelly.wordpress.com/2017/02/12/practical-pipetting-a-guide/; tanggal
akses, 15 Agustus 2018
Grainger, J., Hurst, J., Burdass, D., 2001, Basic Practical Microbiologu: A Manual, The Society for
General Microbiolgy.
Griffin, D.H., 1981, Fungal Physiology, John Wiley & Sons Inc., New York.
Kaiser, GE., 2017, Microbiology Laboratory Manual, tersedia online
https://bio.libretexts.org/Demos%2C_Techniques%2C_and_Experiments/Microbiology_Lab
s_II/ Lab_08%3A_Using_Biochemical_Testing_to_Identify_Bacteria
Madingan, T.M., Martinko, J.M. and Parker, J. 1997. Biology of Microorganism. Ed.8.
Prentice Hall Inc. 15-157.
Rijal, N., 2017, Spread Plate Technique: Principle, Procedure and Results, Bacteriology, tersedia
online https://microbeonline.com/spread-plate-technique-principle-procedure- results/
Schlegel, H.G., 1993, General Microbiology, 7th ed, Translated by Margot Kogut, Cambridge
University Press

41