2019

PANDUAN
PRAKTIKUM
MIKROBIOLOGI
PANGAN
Dr. Ir. Trini Sudiarti, M.Si
Departemen Gizi
Fakultas Kesehatan
masyarakat Universitas
Indonesia
PANDUAN PRAKTIKUM
MIKROBIOLOGI PANGAN

Disusun Oleh :

Dr. Ir. Trini Sudiarti, M.Si

LABORATORIUM GIZI
FAKULTAS KESEHATAN MASYARAKAT
UNIVERSITAS INDONESIA
2019

ii
 KATA PENGANTAR

Puji syukur kehadirat Allah SWT atas berkah dan rahmat Nya Petunjuk Praktikum Laboratorium
untuk Mikrobiologi Pangan dapat disusun.

Buku petunjuk laboratorium tersebut berisi berbagaima cara pembuatan medium, teknik aseptik,
teknik isolasi, cara pengujian mikrobiologi dan uji aktifitas mikrobiologi. Selain itu berisi panduan
praktikum untuk mahasiswa Prodi Gizi Semester 4 (genap) yang mengambil mata ajaran
Mikrobiologi Pangan. Prosedur praktikum dibuat sederhana dan disesuaikan dengan peralatan
yang ada agar mudah diikuti dan dikerjakan untuk mahasiswa.

Penulis sadari banyak kekurangan dalam buku petunjuk praktikum ini. Untuk itu penulis
mengharapkan saran dan kritik dari pembaca guna penyempurnaan. Semoga buku petunjuk
sederhana ini bermanfaat khususnya untuk mahasiswa yang akan melakukan praktikum
Mikrobiologi Pangan.

Depok, 01 Januari 2019

Penulis

Trini Sudiarti

iii
 DAFTAR ISI

Cover ....................................................................................................................................... i

Sub Cover ............................................................................................................................... ii

Kata Pengantar ...................................................................................................................... iii

Daftar Isi ............................................................................................................................... iv

Kontrak Praktikum ................................................................................................................. 1

Standar Operasional Praktikum Mikrobiologi ....................................................................... 3

Kerangka Penyusunan Laporan Praktikum ............................................................................ 4

Modul 1. Pengenalan Alat...................................................................................................... 6

Modul 2. Teknik Aseptik dan Sterilisasi................................................................................ 8

Modul 3. Pembuatan Medium.............................................................................................. 12

Modul 4. Isolasi Mikrobiologi ............................................................................................. 15

Modul 5. Pengujian Bakteri E. Coli ..................................................................................... 21

Modul 6. Aktivitas Biokimia ............................................................................................... 23

Modul 7. Pewarnaan Mikrobiologi ...................................................................................... 26

Daftar Pustaka ...................................................................................................................... 31

iv
 KONTRAK PRAKTIKUM

1. Praktikan (mahasiswa peserta praktikum) wajib hadir 5 menit sebelum acara praktikum
berlangsung. Keterlambatan lebih dari dari 5 menit tidak diperkenankan mengikuti pretest.
Praktikan tidak diperkenankan mengikuti praktikum apabila keterlambatan lebih dari 10 menit.

2. Praktikan diharuskan memakai sepatu tertutup, celana/rok panjang, jas praktikum berwarna
putih yang bersih (sebelum memasuki laboratorium), nametag (berisi nama lengkap), alat
pelindung berupa sarung tangan (handscoon) dan masker (pada saat pengambilan dan
penimbangan media, inokulasi mikroba, isolasi mikroba dan perlakuan yang berhubungan dengan
mikroba. Lalu praktikan diharuskan membawa label, korek api dan lap meja. Pemakaian jas
praktikum dan masker juga diwajibkan saat melakukan pengamatan hasil di luar jam praktikum).
Selain itu praktikan tidak diperbolehkan memakai celana/rok pendek, dan tidak diperbolehkan
memakai kontak lens. Apabila praktikan melanggar salah satu ketentuan diatas maka praktikan
tidak diperbolehkan mengikuti praktikum.

3. Setiap praktikan harus mempelajari dan memahami teori dan prosedur kerja sebelum praktek
berlangsung. Sebelum praktikum dimulai, praktikan wajib mengumpulkan laporan sementara yang
merupakan prasyarat mengikuti acara praktikum pada hari itu. Praktikan yang tidak
mengumpulkan laporan sementara, tidak diperbolehkan mengikuti praktikum pada hari itu.

4. Praktikan bekerja secara berkelompok sesuai pengelompokan yang telah ditentukan dan
diharapkan proaktif untuk belajar.

5. Setiap kelompok praktikum dibagi menjadi kelompok kecil

6. Praktikan diharuskan bekerja secara terencana, hati-hati dan teliti. Setelah selesai praktikum,
alat-alat maupun bahan yang telah digunakan harus dikembalikan dalam kondisi bersih dan utuh.
Semua praktikan bertanggung jawab terhadap kebersihan dan keamanan ruang praktikum, serta
alat-alat yang digunakan.

7. Praktikan yang memecahkan, merusakkan dan atau menghilangkan alat diharuskan melapor ke
dosen/asisten jaga dan mengganti alat tersebut secepatnya. Praktikan yang merusakkan,
memecahkan atau menghilangkan alat diwajibkan menuliskan pada blangko yang telah disediakan
di lab di bawah pengawasan dosen/laboran/assisten koordinator.

8. Praktikan diharuskan menjaga kemurnian bahan-bahan yang dipakai dan menjauhkan segala
macam kontaminan yang dapat mengganggu kevalidan hasil praktikum.

9. Tidak ada praktikum susulan, kecuali bagi praktikan yang berhalangan hadir karena alasan sakit
atau tugas prodi/fakultas/universitas. Praktikan terlebih dulu meminta ijin kepada koordinator
praktikum dan kepala laboratorium dengan membawa surat keterangan sakit atau surat tugas dari

1
prodi/fakultas/universitas kemudian koordinator praktikum dan kepala laboratorium memberikan
surat ijin mengikuti praktikum susulan.

10. Setelah selesai pelaksanaan dan pengamatan praktikum, praktikan wajib membuat Data
sementara dalam laporan sementara yang akan dikoreksi oleh asisten pendamping kelompok yang
bersangkutan. Data sementara yang sudah disetujui asisten bisa langsung dibawa pulang untuk
dibuat laporan resmi mata kuliah praktikum pada hari itu. Pengamatan dilakukan sesuai kebutuhan
dan waktu yang telah ditentukan.

11. Pengamatan praktikum yang dilakukan di luar jam praktikum harus didampingi oleh assisten
pendamping kelompok yang bersangkutan. Praktikan bisa membuat kesepakatan dengan assisten
pendamping sesuai kebutuhan dan waktu yang diperlukan.

12. Pengumpulan laporan resmi tiap sub bab praktikum dikumpulkan pada hari ujian praktikum.
Bila pada saat itu tidak menyerahkan laporan resmi, maka praktikan tidak dapat mengikuti ujian
praktikum.

13. Bila praktikan berhalangan dan tidak dapat mengikuti acara praktikum yang menyebabkan
nilai-nilainya kosong, maka nilai akhir adalah seluruh nilai yang ada dan kemudian dikonversi
berdasar standar nilai yang telah ditetapkan.

Menyetujui,

(....................................)

2
 STANDAR OPERASIONAL PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI

Setiap praktikan akan selalu berhubungan dengan mikroba patogen selama menjalankan
Praktikum Mikrobiologi. Untuk mencegah hal - hal yang tidak diinginkan, setiap praktikan
diharuskan mentaati peraturan yang telah ditetapkan dan menjalankan petunjuk yang diberikan
assisten/dosen jaga.

1. Tas dan benda-benda lain yang tidak diperlukan diletakkan pada tempat yang disediakan.
Jangan sekali-kali meletakkannya di atas meja laboratorium!
2. Bersihkan baik-baik meja laboratorium dengan desinfektan sebelum dan sesudah kegiatan
laboratorium.
3. Cucilah tangan anda baik-baik dengan air dan sabun sebelum dan sesudah kegiatan
laboratorium. Lakukan hal yang sama bila anda meninggalkan laboratorium untuk ke toilet
atau bila anda ke luar dari ruangan laboratorium.
4. Jangan merokok, makan atau minum di ruang laboratorium.
5. Jauhkan tangan anda dari mulut, hidung, mata dan telinga selama anda bekerja di
laboratorium.
6. Perlakukan semua organisme yang anda tangani sebagai patogen atau mampu menimbulkan
penyakit. Kebanyakan biakan yang disediakan laboratorium tidak berbahaya, tetapi beberapa
di antaranya berbahaya.
7. Anda tidak diperkenankan membawa keluar biakan mikroba apa pun dari ruangan
mikroba/ruangan laboratorium.
8. Usahakan supaya mikroba yang anda tangani tidak tercecer dan tidak tercampur dengan
mikroba lain.
9. Bila biakan yang sedang anda pindahkan tercecer ke lantai atau di meja praktikum, tuangkan
desinfektan di atasnya, bersihkan dengan kertas tissue/kapas dan buang di tempat yang
disediakan untuk bahan-bahan bukan kaca yang terkontaminasi.
10. Bila anda memecahkan tabung berisi mikroba, tuangkan desinfektan ke atasnya, sapukan
dan buang di tempat yang disediakan untuk pecahan kaca atau tuangkan spiritus dan
kemudian bakar.
11. Bila anda terkontaminasi atau terluka, hubungi assisten/dosen jaga.
12. Buanglah sampah-sampah yang tidak terkontaminasi di tempat yang disediakan.
13. Jarum inokulasi dan ose harus disterilkan dengan cara memijarkan seluruh panjang kawatnya
sebelum dan sesudah setiap penggunaan. Percikan biakan dapat dihindarkan dengan cara
memulai pemanasan di dalam kerucut api sebelah dalam yang berwarna lebih biru.
14. Apabila pipet yang sama perlu digunakan lebih dari 1 kali, jangan meletakkannya langsung
di atas meja di antara penggunaan, tetapi letakkanlah pada penyangga pipet yang telah
tersedia.
15. Api pada pembakar bunsen harus dimatikan pada waktu tidak digunakan.

3
16. Biakan yang tidak diperlukan lagi serta bahan-bahan bekas pakai yang mempunyai potensi
bahaya harus diletakkan dalam tempatnya masing-masing yang disediakan sebagai berikut :
a. Cawan petri, labu dan reaksi diletakkan di tempat yang disediakan.
b. Pipet harus diletakkan dalam wadah berisi desinfektan
c. Kaca obyek dan penutupnya harus diletakkan dalam tempat-tempat khusus yang telah
diberi desinfektan. Bakteri yang ada pada kaca obyek belum tentu mati semuanya
sekalipun telah difiksasi dengan panas, jadi berhati-hatilah menanganinya.
d. Jangan sekali-kali membuang biakan di tempat cuci.
17. Kurangi bercakap-cakap selama praktikum, agar tidak merugikan pekerjaan sendiri atau
rekan lain.
18. Setiap pengerjaan praktikum dan pengamatan harus dicatat dengan cermat.
19. Setiap praktikan diwajibkan membersihkan mikroskop dan mengembalikan ke tempat
semula setelah digunakan, selain itu praktikan diharuskan untuk membersihkan meja kerja,
memeriksa nyala api dan listrik dipadamkan, menutup kran air dan gas, mencuci tangan
dengan desinfektan, kemudian melapor ke assisten/dosen jaga.
20. Cucilah jas laboratorium anda sehingga selalu bersih pada waktu anda datang kembali ke
laboratorium pada waktu berikutnya. Gunakanlah sarung tangan dan masker yang selalu baru
di setiap praktikum mikrobiologi.

4
 KERANGKA PENYUSUNAN LAPORAN PRAKTIKUM

1. Setiap laporan ditulis tangan di kertas polio bergaris

2. Masing-masing praktikan diwajibkan membuat dan membawa laporan sementara praktikum

yang mencakup :
a. Judul Praktikum
b. Tujuan
c. Prinsip Kerja
d. Alat dan Bahan
e. Cara Kerja

Laporan sementara ini menjadi syarat praktikan mengikuti praktikum pada hari itu. Laporan
sementara akan dikembalikan kepada praktikan setelah ditandatangani oleh asisten pada hari
itu.

3. Setelah laporan sementara disetujui oleh asisten, laporan sementara yang dibawa pulang oleh
praktikan ini akan dilanjutkan menjadi laporan resmi dengan menambahkan cakupan :
a. Data pengamatan
b. Pembahasan (membahas jawaban dari pertanyaan diskusi)
c. Kesimpulan
d. Daftar Pustaka

4. Laporan resmi dikumpulkan pada hari ujian praktikum. Mahasiswa yang tidak
mengumpulkan laporan resmi tidak diperbolehkan mengikuti ujian praktikum

5. Praktikan yang melakukan copy paste akan dipanggil oleh tim asisten dan kemungkinan
terburuk nilai laporan bersangkutan sama dengan NOL.

5
 MODUL 1

PENGENALAN ALAT

Peralatan yang digunakan dalam praktikum dan penelitian mikrobiologi sebagian besar sama
dengan peralatan yang digunakan dalam praktikum kimia, diantaranya seperti penggunaan tabung
reaksi, pipet ukur, labu Erlenmeyer, gelas piala, botol tetes, pembakar spiritus, rak tabung reaksi,
dsb. Selain itu ada juga beberapa alat khusus yang harus diketahui dan dipelajari oleh mahasiswa
mengenai cara penggunaannya.

A. Tujuan :

Mengenal bermacam-macam alat dan cara penggunaannya secara benar pada praktikum
mikrobiologi.

B. Prinsip Kerja :

Simulasi/demo alat dan penjelasan mengenai cara kerja dan fungsi alat. Lalu dilanjutkan
dengan praktek penggunaan alat dengan benar sesuai dengan fungsinya.

C. Alat dan Fungsi :

1. Mikroskop
Mikroskop yang biasa digunakan untuk pengamatan adalah mikroskop bidang terang
dengan perbesaran lensa obyektif 100x. untuk menghindari bias pengamatan ini harus
dibantu minyak imersi
2. Autoklaf
Alat ini digunakan untuk mensterilkan bahan/alat/medium dengan cara pemanasan basah.
Lama sterilisasi umumnya adalah 15 menit pada suhu 121ºC dan tekanan 15 lbs.
3. Alat penghitung koloni (colony counter)
Alat ini digunakan menghitung banyaknya koloni mikroorganisme yang ditimbulkan pada
cawan bermedium
4. Oven (hot air sterilizer)
Alat ini digunakan untuk mensterilkan alat (peralatan gelas dan logam) dengan cara
pemanasan kering. Lama sterilisasi adalah 2 jam pada suhu 160ºC atau 1 jam pada suhu
170ºC.

6
 disimpan setelah ditanam
⑥
5. Inkubator
Setelah mikroorganisme selesai ditanam dalam medium biasanya perlu diinkubasikan pada
suhu konstan selama beberapa waktu sebelum diamati. Alat yang berfungsi sebagai tempat
inkubasi dengan suhu tetap disebut inkubator. Suhu inkubator dapat diatur sesuai dengan
suhu optimalpertumbuhan mikroorganisme yang diinkubasi
6. Jarum tanam (inoculating needle)
Alat ini digunakan untuk menanam sesuatu mikroorganisme pada medium ada 2 macam
jarum tanam yaitu jarum ose dan jarum tanam tajam.
7. Batang bengkok/spreader/batang Drigalsky
Alat ini digunakan untuk menanam mikroba dengan cara sebar/pulasan/spread
8. Lemari pendingin/refrigerator
Digunakan untuk menyimpan media steril yang siap pakai agar isi dan mutu media tersebut
tidak berubah, menyimpan untuk sementara waktu bahan/spesimen yang belum sempat
diperiksa agar tidak mengalami perubahan dan menyimpan cakram antibiotik/antibiotic
disk yang belum dipakai agar tidak mengalami perubahan.
9. Biological Safety Cabinet (BSC)
Adalah ruang/lemari tempat untuk bekerja dengan mikrobiologi termasuk menanam
mikroba
10. Alat-alat lain yang perlu diketahui di laboratorium mikrobiologi : mikropipet, cawan petri,
pembakar spirtus, kaca obyek, vortex, kaca penutup, magnet stirer, pinset, gelas arloji, disk
antibiotik, dan tabung Durham.

D. Pertanyaan-Pertanyaan Diskusi

1. Sebutkan nama dan fungsi serta gambarkan alat-alat praktikum mikrobiologi yang telah
dijelaskan oleh Dosen/Asisten!
2. Tuliskan prinsip kerja alat – alat tersebut!

7
 MODUL 2

TEKNIK ASEPTIK DAN STERILISASI

1. TEKNIK ASEPTIK

Teknik aseptik adalah sebutan untuk prosedur yang digunakan dalam pekerjaan mikrobiologi
dan kultur sel, teknik aseptik digunakan untuk memelihara dan menumbuhkan semua sel hidup
termasuk mikroorganisme, tujuan teknik aseptik adalah untuk menghindari terjadinya
kontaminasi/bercampurnya antara kultur sel biakan dengan mikroorganisme yang tidak diinginkan
yang berasal dari kulit, baju dan lingkungan sekitar area kerja atau juga antara praktikan dengan
biakan (bakteri patogen)

A. Tujuan :

Mengetahui teknik aseptik yang baik dan benar

B. Prinsip Kerja :

 Area kerja
Menjaga kebersihan dan kenyamanan area kerja sangat penting untuk mencegah
kontaminasi, sebelum memulai pekerjaan mikrobiologi lingkungan sekitar tempat kerja
sebaiknya disterilisasi lebih dahulu. Ruangan kerja harus disapu lalu dipel menggunakan
larutan desinfektan seperti : Lysol atau karbol, untuk mensterilkan permukaan meja kerja,
dapat disemprotkan larutan alkohol 70%, formalin 4% atau timol 5%, biarkan meja
mengering sebelum digunakan letakan dan atur semua peralatan kerja sedemikian rupa
sehingga dekat dengan tangan.

 Larutan atau medium steril

Periksalah media steril sebelum digunakan jangan sampai ada yang terkontaminasi, media
yang sudah terkontaminasi serta rusak tidak boleh digunakan, biasanya media yang rusak
berubah menjadi keruh, berubah warna, atau terlihat adanya titik- titik koloni dipermukaan
medium. Saat menuangkan medium steril atau memindahkan biakan, sumbat tabung harus
dibuka hal ini dapat menyebabkan terjadinya kontaminasi, cara untuk mengurangi

8
 kemungkinan kontaminasi adalah dengan secepatnya melewatkan mulut tabung ke
pembakar spiritus setelah dibuka dan sebelum tabung ditutup kembali. Selama tabung
terbuka posisi mulut tabung harus dekat dengan api (bukan dibakar), sumbat tabung harus
terus dipegang dengan jari dan tidak boleh diletakan dimeja kerja, hal yang sama juga
berlaku pada cawan petri steril, bagian cawan petri yang dibuka harus berada dekat dengan
api.

C. Bahan dan Alat

- Alkohol 70%
- Spirtus
- Pembakar spirtus
- Kain Lab bersih

D. Cara Kerja
1. Semprot area meja kerja dengan alkohol 70%, lalu diamkan beberapa saat
2. Lap meja menggunakan kain bersih
3. Nyalakan pembakar spirtus
4. Lalu bekerjalah didekat area pembakar spirtus yang telah menyala tersebut

2. STERILISASI
Satu tahapan penting yang harus dilakukan dan merupakan aturan standar selama
melaksanakan praktikum atau kerja mikrobiologi adalah sterilisasi. Sterilisasi adalah proses atau
kegiatan membebaskan suatu bahan atau benda dari semua bentuk kehidupan.Sterilisasi dapat
dilakukan tergantung dari bahan atau alat yang akan disteril. Sterilisasi dapat dilakukan dengan
berbagai cara yaitu sebagai berikut.
A. Tujuan :
Mengetahui cara-cara sterilisasi yang baik dan benar berdasarkan kategori sterilisasi
1. Sterilisasi menggunakan oven
- Prinsi kerja :

9
 Alat ini digunakan untuk sterilisasi peralatan gelas seperti : cawan petri, pipet, tabung biakan,
dsb. Cara kerja nya adalah dengan menggunakan suhu 160ºC selama kurang lebih 2 jam atau
170ºC selama 1 jam. Sterilisasi cara ini disebut dengan sterilisasi kering.
- Alat dan Bahan :
1. Oven
2. Erlenmeyer.
3. Tabung reaksi.
4. Cawan petri.
5. Beaker glass.
6. Pipet.

- Cara kerja :
1. Alat-alat gelas dibungkus dengan kertas atau alumunium foil.
2. Tulis nama dan volume alat gelas yang terbungkus
3. Pengatur suhu oven diatur menjadi 170oC dan alat disterilkan selama 2 jam.

2. Sterilisasi Menggunakan Autoklaf

- Prinsip kerja
Alat ini digunakan untuk sterilisasi bahan cair seperti medium dan air suling, sterilisasi
dicapai dengan cara mempertahankan suhu 121ºC selama 15 menit pada tekanan 2 atm,
Sterilisasi cara ini disebut dengan sterilisasi basah.
- Alat dan Bahan :
1. Autoclave
2. Media agar

- Cara kerja :
1. Sebelum melakukan sterilisasi cek dahulu banyaknya air dalam autoklaf. Jika air kurang
dari batas yang ditentukan maka dapat ditambah air sampai batas tersebut. Gunakan air
hasil destilasi, untuk menghindari terbentuknya kerak dan karat.
2. Masukkan peralatan dan bahan. Jika mensterilisasi botol bertutup ulir maka tutup harus
dikendurkan.
3. Tutup autoklaf dengan rapat lalu kencangkan baut pengaman agar tidak ada uap yang
keluar dari bibir autoklaf. Klep pengaman jangan dikencangkan terlebih dahulu.
4. Autoklaf dinyalakan, diatur timer dengan waktu minimal 15 menit pada suhu 121oC

10
 5. Ditunggu sampai air mendidih sehingga uapnya memenuhi kompartemen autoklaf dan
terdesak keluar dari klep pengaman. Kemudian klep pengaman ditutup dan tunggu
sampai selesai. Penghitungan waktu 15 menit dimulai sejak tekanan mencapai 2 atm.
6. Jika alarm tanda selesai berbunyi maka tunggu tekanan dalam kompartemen turun
hingga sama dengan tekanan udara di lingkungan (jarum pada preissure gauge
menunjuk ke angka nol). Kemudian klep- klep pengaman dibuka dan keluarkan isi
autoklaf dengan hati-hati.

3. PERTANYAAN – PERTANYAAN DISKUSI

a) Mengapa diperlukan melakukan teknik aseptik dalam pengujian mikrobiologi?

b) Apa yang dimaksud dengan sterilisasi basah dan kering, jelaskan peruntukannya?
c) Sebutkan dan jelaskan jenis sterilisasi selain sterilisasi menggunakan oven dan
autoclave?

11
 MODUL 3
PEMBUATAN MEDIUM

Medium pertumbuhan bakteri merupakan elemen penting dalam praktik mikrobiologi

yang harus Anda ketahui karena dengan menggunakan media pertumbuhan maka dapat
dipelajari aktivitas mikroba yang tumbuh di situ. Aktivitas mikroba akan mengakibatkan
perubahan pada media pertumbuhan yang digunakan sehingga dapat dipelajari. Bahan-bahan
media dapat berupa bahan-bahan yang sudah jadi, bahan-bahan asli, atau bahan alami. Pada
dasarnya bahan-bahan untuk pembuatan media dapat dikelompokkan menjadi tiga kelompok,
yaitu bahan dasar, nutrisi, dan bahan tambahan.
A. Jenis – Jenis Medium
 Medium berdasarkan bentuk fisik
1. Medium padat
Medium padat dapat dibuat dari agar dengan konsentrasi 1 – 2% w/v agar digunakan karena
tidak mudah terdegradasi oleh bakteri, mencair pada suhu 98ºC dan memadat pada suhu 44ºC
contoh : nutrient agar
2. Medium cair
Medium ini dibuat tanpa menambah agar sehingga bentuk cair (broth) contohnya : nutrient
broth dan lactose broth
 Medium berdasarkan kegunaannya
1. Medium umum medium ini dapat ditumbuhi berbagai jenis mikroorganisme contoh :
nutrient agar (NA), potato dextrose agar (PDA) dll.
2. Medium selektif komposisi medium ini dibuat untuk menumbuhkan jenis
mikroorganisme tertentu saja misalnya : salmonella shigella agar (SSA).
3. Medium diferensial medium ini dapat membedakan jenis mikroorganisme yang satu
dengan yang lain khususnya secara visual perbedaan ini timbul akibat reaksi kimia
dalam medium dengan jenis bakteri tertentu misalnya : eosin methylen blue agar
(EMBA) dan Chomagar chromogenic agar (CCA)
4. Medium pengkayaan (enrichment medium) medium ini berguna untuk memperbanyak
jumlah biakan mikroorganisme yang diinginkan misalnya : malt ekstrak agar (MEA)
dan blood tellurite agar

12
 Komposisi medium dapat berupa bahan-bahan alami seperti sari buah, susu atau daging saja,
bahan alami ini dapat ditambahkan bahan kimia lain atau agar menjadi medium semi alamiah
seperti : tauge ekstrak agar (TEA), saat ini sudah banyak medium yang mengandung komposisi
kimia lengkap dan jumlahnya sudah ditentukan sehingga mudah dibuat dan digunakan seperti :
Czapek dox agar (CDA).

B. Pembuatan Medium Secara Umum

Medium biasanya dibuat dengan cara melarutkan semua bahan dalam air suling, larutkan
hingga sempurna, jika perlu diberi pengadukan, pemanasan dan disaring. Setelah itu tempatkan
medium pada wadah berpenutup, penutup wadah berupa sumbat kapas harus disiapkan sebelum
mulai membuat medium, wadah dapat berupa tabung reaksi atau labu Erlenmeyer.

Volume medium disesuaikan dengan kebutuhan 5 ml untuk agar miring (dalam tabung
reaksi) atau 10 – 20 ml untuk agar plate sebelum diautoklaf satukan semua tabung berisi medium
tersebut tutup bagian atasnya dengan Koran dan diikat kuat hal ini dilakukan untuk mencegah
lepasnya penutup kapas saat berada dalam autoklaf bertekanan tinggi.

Untuk pembuatan medium miring segera setelah medium dikeluarkan dari autoklaf letakkan
tabung – tabung tersebut pada posisi miring dengan derajat kemiringan yang diinginkan dan
dibiarkan mengeras.

Medium agar tegak yang telah mengeras bila akan digunakan harus dipanaskan dulu supaya
mencair, pemanasan harus menggunakan pemanas air tidak boleh langsung diatas api.

Alat dan bahan :

 Labu Erlenmeyer 500 ml  Pipet tetes

 Batang pengaduk  Medium EMBA
 Tabung reaksi kosong  Medium NA
 Timbangan  Medium PDA
 Pemanas  Sumbat kapas
 Labu ukur
 Corong kaca

13
Cara kerja :

1. Timbanglah masing-masing medium sesuai dengan volume yang akan dibuat sesuai
dengan gram dalam liter masing – masing medium
2. Tempatkan air suling volume tertentu dalam Erlenmeyer lalu tambahkan medium
yang telah ditimbang sebelumnya aduk sampai larut sempurna (bila perlu panaskan
diatas penangas atau hot plate dan magnet stirer)
3. Masukan larutan medium tersebut dalam masing – masing tabung reaksi EMBA,
NA, PDA sebanyak 10-12 ml untuk medium plate dan 5 ml untuk medium miring
4. Beri label nama medium dan tanggal pembuatan
5. Tutup setiap tabung reaksi dengan sumbat kapas satukan semua tabung dalam satu
wadah tahan panas tutup bagian atas dengan alumunium foil lalu ikat dengan tali.
6. Sterilisasi medium mengunakan autoklaf pada suhu 121ºC selama 15 menit

C. PERTANYAAN-PERTANYAAN DISKUSI :
a) Jelaskan bahan-bahan dasar yang biasa digunakan dalam media pertumbuhan!
b) Mengapa agar-agar dipakai sebagai bahan dasar dalam media pertumbuhan
mikroba?
c) Media berdasarkan sifat fisik dibagi menjadi berapa macam? Sebut dan jelaskan!
d) Sebutkan beberapa contoh media yang tergolong non-sintetis!
e) Apa yang dimaksud dengan media selektif?

14
 MODUL 4

ISOLASI MIKROORGANISME

Dalam kehidupan sehari-hari kita selalu berhubungan dengan mikroorganisme baik

kapang, khamir, maupun bakteri. Mikroorganisme dilingkungan mana saja pada umumnya
terdapat dalam populasi campuran untuk memudahkan mempelajari jenis dan sifat serta untuk
mengidentifikasi spesies tertentu maka mikroorganisme tersebut harus diisolasi dari
lingkungannya dan dipelihara pada medium yang sesuai untuk pertumbuhannya.

Isolasi adalah suatu cara untuk memisahkan mikroorganisme tertentu dari

lingkungannya sehingga diperoleh biakan yang tidak tercampur dengan jenis yang lainnya
biakan yang tidak tercampur dengan jenis lainnya disebut biakan murni

Mengapa diperlukan biakan murni? Karena semua metode yang digunakan untuk
mempelajari dan mengidentifikasi mikroorganisme termasuk dalam mempelajari ciri-ciri
morfologi, fisiologi maupun serologi memerlukan suatu populasi yang terdiri dari satu macam
mikroorganisme saja.

A. Memindahkan Biakan
Seperti yang kita ketahui mikroorganisme terdapat dimana-mana oleh karna itu harus
sangat berhati-hati dalam bekerja dibidang mikrobiologi untuk mencegah masuknya
mikroorganisme yang tidak dikehendaki kedalam biakan murni mikroorganisme luar yang
tidak dikehendaki dapat masuk melalui kontak langsung dengan permukaan atau tangan yang
tercemar tersentuhnya media atau permukaan tabung bagian dalam oleh benda yang belum
disterilkan ataupun melalui aliran udara untuk mencegah tercemarnya biakan murni
perludigunakan teknik aseptik yang sekaligus dapat melindungi diri dari infeksi diri dan orang-
orang disekeliling dari pencemaran di laboratorium dengan demikian kecelakaan laboratorium
tidak mudah terjadi.
Cara memindahkan biakan :
Untuk memindahkan biakan dilakukan langkah-langkah sebagai berikut
1. Bersihkan meja kerja dari debu kemudian sterilkan dengan alkohol 70%
2. Lingkungan kerja harus tenang dan bebas angin nafas sedapat mungkin dihembuskan
menjauhi tabung biakan yang akan dibiakan
3. Periksa kembali peralatan dan bahan yang dibutuhkan apakah sudah siap

15
4. Lakukan langkah-langkah berikut ini:
a. Pegang kedua tabung (yang berisi biakan mikroorganisme dan berisi medium baru)
dengan tangan kiri dan jarum inokulasi dengan tangan kanan
b. Panaskan jarum inokulasi sampai berpijar/membara dinginkan dalam alkohol 70% dan
kemudian lewatkan kembali di atas nyala api
c. Buka sumbat kapas kedua tabung dengan menggunakan tangan kanan (lihat demonstrasi
asisten) panaskan mulut kedua tabung diatas nyala api
d. Pindahkan biakan dengan cara mengambil sedikit dari permukaan tabung yang berisi
biakan mikroorganisme dan langsung sentuhkan ke permukaan tabung yang berisi
medium baru.
e. Panaskan kembali mulut kedua tabung seperti pada saat membuka tutup kembali dengan
sumbat kapas, bakar jarum inokulasi sampai berpijar/membara dan letakan ditempatnya.

Alat dan bahan

 Beberapa tabung medium NA miring

 1 biakan murni kapang/khamir
 1 biakan murni bakteri
 Alkohol 70% dan pembakar spiritus
 Jarum inokulasi (ose dan tanam tajam)

Cara kerja :

1. Panaskan jarum tajam diatas api sampai berpijar/membara dinginkan dalam alkohol 70%
dan panaskan kembali sebentar diatas nyala api dengan jarum ini ambil sedikit biakan
kapang dan letakan diatas permukaan medium kira-kira pada jarak 1/3 dari panjang
permukaan medium
2. Bakar ose sampai berpijar/membara dinginkan dalam alkohol 70% dan bakar kembali
diatas api dengan ose ambil sedikit biakan khamir gesekan ujung ose yang telah
mengandung khamir secara zig zag ditas permukaan medium mulai dari ujung bagian
bawah sampai kebagian atas.
3. Lakukan cara kerja nomer 2 untuk memindahkan biakan bakteri
4. Inkubasikan semua tabung biakan selama 24 - 48 jam dan amati pertumbuhan yang
terjadi

16
B. Isolasi Mikroorganisme dari Udara
Bahan dan alat :
 Beberapa tabung medium nutrient agar (NA)
 3 cawan petri
 Alkohol 70% dan pembakar spiritus
 Jarum inokulasi

Cara kerja :

1. Tuangkan medium NA yang sudah disterilisasikan ke dalam cawan petri, tunggu hingga
agar mengeras
2. Bukalah cawan petri yang berisi medium NA di dua tempat yang berbeda misalnya: satu
dilaboratorium, satu ditempat yang banyak dilewati orang dan satu lagi ditempat yang
banyak angin (misal dibawah exhaust fan)
3. Inkubasikan semua cawan petri selama 24 – 48 jam amati perubahan yang terjadi
4. Pindahkan koloni-koloni yang tumbuh terpisah dalam cawan petri ke medium yang sesuai
(konsultasikan dengan asisten)
5. Inkubasikan tabung-tabung tersebut selama 48 jam dan amati pertumbuhan yang terjadi

C. Isolasi Mikroorganisme dari Substrat Cair

1. Cara sebar (spread method)

Bahan dan alat :

 1 cawan petri steril yang berisi medium NA

 Bahan cair yang akan diperiksa
 Pipet steril
 Jarum inokulasi yang dibengkokkan
 Beberapa tabung yang berisi medium miring NA dan PDA
 Jarum inokulasi
 Alkohol 70% dan pembakar spiritus

Cara kerja :

17
1. Teteskan 0.1 ml cairan yang akan diperiksa menggunakan mikro pipet diatas permukaan
medium dalam cawan petri.
2. Dengan menggunakan jarum inokulasi yang dibengkokkan tetesan tersebut disebar seluas
mungkin diatas permukaan medium menggunakan batang spreader.
3. Inkubasikan didalam inkubator selama 24 – 48 jam.
4. Pindahkan koloni-koloni yang tumbuh didalam tabung yang berisi medium yang sesuai

2. Cara tuang (pour-plate method)

Alat dan bahan :
 1 buah tabung medium NA tegak
 Bahan cair yang akan diperiksa
 1 buah cawan petri steril
 Beberapa tabung berisi medium miring NA dan PDA
 Penangas air
 Jarum ose
 Alkohol 70% dan pembakar spiritus

Cara kerja :

1. Cairkan medium dalam penangas air angkat dan turunkan suhunya sampai mencapai 38 -
40ºC.
2. Masukan beberapa 0.1 ml cairan yang akan diperiksa menggunakan mikropipet ke dalam
cawan petri kosong secara aseptik
3. Tuangkan medium NA kedalam cawan petri yang telah terisi oleh 0.1 ml cairan yang akan
diperiksa secara aseptik dalam permukaan agar dalam cawan petri dengan membuat
gerakan memutar. Membentuk angka delapan dan biarkan medium mengeras.
4. Inkubasikan selama 24 – 48 jamdalam posisi terbalik.
5. Pindahkan koloni-koloni yang tumbuh kedalam medium yang sesuai

D. Isolasi Mikroorganisme dari Substrat Padat

1. Cara tabur (spread method)

Alat dan bahan :

18
 Bahan padat yang akan diperiksa (makanan)
 Beberapa cawan petri steril yang berisi medium NA
 Mortar dan penumbuknya
 Spatel atau pisau laboratorium
 Alkohol 70% dan pembakar spiritus

Cara kerja :

1. Gerus bahan yang akan diperiksa dalam mortar yang sebelumnya disteril dengan alkohol
70%
2. Bersihkan spatel sterilkan dengan alkohol 70% dan lewatkan diatas nyala api
3. Ambil sedikit bahan padat yang telah digerus dan ditaburkan secara merata diatas
permukaan medium dalam cawan petri.
4. Inkubasikan selama 24 – 48 jam dalam posisi normal
5. Pindahkan koloni-koloni yang tumbuh kedalam tabung yang berisi medium yang sesuai.

2. Cara suspense

Alat dan bahan :

 Bahan padat yang akan diperiksa

 Mortar dan penumbuknya
 Labu Erlenmeyer yang berisi akuades steril
 Tabung yang berisi medium NA tegak
 Beberapa cawan petri steril
 Penangas air
 Jarum ose
 Alkohol 70% dan pembakar spiritus

Cara kerja :

1. Cairkan medium dalam penangas air angkat dan dinginkan sampai suhunya mencapai 38
- 40ºC
2. Ambil sedikit bahan padat dan masukan kedalam akuades steril kemudian kocok hingga
homogen

19
3. Ambil suspensi dengan jarum ose dan masukan kedalam medium yang sudah mencair
sebanyak 0.1 ml, tuangkan secara aseptik kedalam cawan petri steril (boleh menggunakan
salah satu cara pour plate/spread)
4. Inkubasikan cawan petri selam 24 – 48 jam dalam posisi terbalik
5. Amati pertumbuhan yang terjadi.

E. Isolasi Mikroorganisme dari Organ Tubuh

Bahan dan alat :
 Beberapa cawan petri steril berisi medium NA (beri nomer 1 dsb)
 Spatel atau pinset tumpul
 1 pisau laboratorium
 Alkohol 70% dan pembakar spiritus

Cara kerja :

1. Ambil sedikit potongan kuku dengan menggunakan gunting kuku dan letakan diatas
permukaan medium cawan petri nomer 1
2. Ambil beberapa helai rambut kepala dan letakakan diatas permukaan medium cawan petri
nomer II, dengan menggunakan pinset tumpul yang telah dibersihkan dengan alkohol 70%
3. Sentuhkan jari anda pada permukaan medium pada cawan petri nomer III
4. Inkubasikan semua cawan petri selama 24 – 48 jam amati perubahan yang terjadi.

F. Pertanyaan-pertanyaan diskusi :

a) Mengapa pada waktu inkubasi cawan petri harus diletakkan terbalik?

b) Jelaskan prinsip dasar dan tujuan teknik isolasi mikroba secara streak plate, pour
plate dan spread plate!
c) Apa yang dimaksud dengan kultur murni/biakan murni?
d) Jelaskan teknik – teknik penggoresan bakteri!
e) Bagaimana teknik penggoresan yang benar pada teknik isolasi secara streak plate
agar supaya didapatkan koloni bakteri terpisah?

20
 MODUL 5

PENGUJIAN BAKTERI E. COLI

MENGGUNAKAN METODE ANGKA LEMPENG TOTAL (ALT)

Angka Lempeng Total (ALT) adalah pertumbuhan bakteri mesofil aerob setelah sampel
diinkubasi dalam perbenihan yang cocok selama 24-48 jam pada suhu 37°C (SNI, 1992).
Metode kuantitatif ALT digunakan untuk mengetahui jumlah mikroba yang ada pada suatu
sampel.

Prinsip Kerja :

Pertumbuhan koloni bakteri aerob mesofil setelah cuplikan diinokulasikan pada lempeng agar
dengan cara tuang dan diinkubasi pada suhu yang sesuai. Pengujian dilakukan secara duplo.
Setelah inkubasi, dipilih cawan petri dari satu pengenceran yang menunjukkan jumlah koloni
antara 30-300 koloni. Hasil akhir dapat diamati jumlah koloni (cfu) per ml/gr. Jumlah koloni
rata-rata dari kedua cawan dihitung lalu dikalikan dengan faktor pengencerannya.

Alat dan Bahan :

a. EMBA (Eosin Methylene Blue Agar)
b. Aquadest steril
c. Sampel uji
d. Pipet volume
e. mikropipet
f. Colony Counter (alat hitung koloni)

Cara Kerja :

1. Cacah sampel dalam pembungkus lalu timbang sampel sebanyak 10 gr kedalam larutan
pengencer dalam erlenyemer yang berisi aquadest steril sebanyak 90 ml untuk
pengenceran 10-1, sehingga menggunakan perbandingan 1 : 9. Setelah itu homogenkan
dan selalu bekerja didekat pembakar spirtus.
2. Ambil 1 ml larutan dari pengenceran 10-1 dan masukan kedalam tabung reaksi
pengenceran 10-2 yang berisi 9 ml aquadest steril menggunakan mikropipet, lalu
homogenkan
3. Ambil 1 ml larutan dari pengenceran 10-2 dan masukan kedalam tabung reaksi
pengenceran 10-3 yang berisi 9 ml aquadest steril menggunakan mikropipet, lalu
homogenkan

21
 4. Ambil 1 ml larutan dari pengenceran 10-3 dan masukan kedalam tabung reaksi
pengenceran 10-4 yang berisi 9 ml aquadest steril menggunakan mikropipet, lalu
homogenkan
5. Lalu ambil masing 0.1 ml dari masing – masing pengenceran untuk ditanam dengan
metode spread plate pada media EMBA, lalu diinkubasi pada 37oC selama 1x24 jam.
6. Amatilah apa yang terjadi. Warna koloni pada media EMBA akan berwarna hijau
metalik
7. Hitung jumlah koloni dengan rentang 30-300, lalu lakukanlah perhitungan
menggunakan rumus :
Jumlah koloni
��� =
Faktor pengenceran X sampel yang ditimbang

Pertanyaan – Pertanyaan Diskusi :

a) Interpretasikan hasil percobaan yang telah Anda lakukan dan simpulkan apakah sampel
makanan yang telah Anda analisis mengandung jumlah mikroba melebihi batas yang
ditetapkan atau tidak! Jelaskan! (berdasarkan Peraturan Pemerintah/Keputusan Kepala
Badan POM RI tentang persyaratan cemaran mikrobia pada makanan)
b) Bagaimana cara perhitungan koloni untuk mendapatkan nilai ALT?

22
 MODUL 6
AKTIVITAS BIOKIMIA

Mikroorganisme seperti juga makhluk hidup lain memerlukan energi untuk

kelangsungan hidupnya, energ dapat diperoleh dari lingkungan sekitarnya dalam bentuk
senyawa kimia tertentu yang dapat diurai oleh mikroorganisme tersebut, kemampuan
mikroorganisme untuk mengurai senyawa tertentu dan mensinsetis senyawa baru merupakan
sifat khas masing-masing mikroorganisme semua aktivitas metabolisme tersebut berlangsung
dengan bantuan enzim tertentu reaksi metobolisme tersebut berbeda untuk setiap
mikroorganisme sehingga hal ini dapat digunakan untuk mengidentifikasi mikroorganisme.

1. Uji Indol

Asam amino diperoleh sebagai hasil hidrolisis protein, pepton, dan peptide, triptofan
merupakan asam amino yang penting untuk mengetahui jenis bakteri tertentu karena bakteri
tertentu seperti E.coli dapat menghidrolisis asam amino triptofan menjadi indol dan asam dan
asam piruvat, adanya indol dapat diketahui dengan menggunakan reagen kovac: uji positif
ditunjukan oleh terbentuknya lapisan berwarna merah diatas biakan.

Alat dan bahan :

 Beberapa tabung medium cair tripton

 Reagen kovac
 Biakan E.coli dan proteus vulgaris
 Jarum ose

Cara kerja :

1. Inokulasikan E.coli kedalam medium cair tripton

2. Inkubasikan selama 24-48 jam pada suhu 30-35ºC
3. Amati terjadinya indol dengan menambahkan beberapa tetes larutan reagen kovac
kedalam setiap tabung
4. Kocoklah perlahan-lahan dan biarkan tabung dalam posisi tegak supaya larutan
terkumpul dipermukaan medium

23
5. Amati terbentuknya indol yang ditandai dengan terbentuknya warna merah tua pada
lapisan permukaan bandingkan dengan tabung medium yang tidak diinokulasikan biakan
bakteri.

2. Uji Methyl Red

Kemampuan bakteri dalam memproduksi dan memelihara kestabilan asam dari proses akhir
fermentasi glukosa. Methy Red merupakan indikator pH, yang menunjukan indikator merah
berarti pH asam yang diproduksi itu sekitar 4.4.

Alat dan bahan :

 Biakan E.coli
 Media MRVP (media Methyl Red-Voges Proskauer)
 Jarum ose

Cara kerja :

1. Inokulasikan E.coli masing-masing kedalam medium MRVP

2. Inkubasikan selam 24-48 jam pada suhu 37ºC
3. Tambahkan 5 tetes methyl red ke dalam media tersebut, lalu kocoklah hati - hati
4. Amati pertumbuhan dan perubahan warna yang terjadi bandingkan dengan tabung
medium yang tidak diinokulasikan.

3. Uji VOGES PROSKAUER (VP)

VP berguna dalam mendeteksi adanya butylene glycol yang diproduksi bakteri. Acetyl-methyl
carbinol (acetoin) adalah produksi lanjutan dari butylene glycol. Dalam tes ini reagen yang
dipakai adalah KOH 40% dan alpha-naphthol. Setelah diinkubasi maka acetoin akan terbentuk
dan akan dioksidasi oleh udara oksigen dan KOH menjadi diacetyl. Diacetyl kemudian akan
bereaksi dengan guanidine yang merupakan komponen peptone, yang ketika ditambahkan
alpha-naphthol akan terbentuk warna merah.

Alat dan bahan :

 Biakan E.coli
 Media MRVP (media Methyl Red-Voges Proskauer)

24
 Jarum ose

Cara kerja :

5. Inokulasikan E.coli masing-masing kedalam medium MRVP

6. Inkubasikan selam 24-48 jam pada suhu 37ºC
7. Tambahkan 0,6 ml alpa-nafthol kemudian dikocol, setelah itu tambahkan 0,2 ml KOH
40% ke dalam media tersebut
8. Amati pertumbuhan dan perubahan warna yang terjadi bandingkan dengan tabung
medium yang tidak diinokulasikan.

4. Uji Penggunaan Sitrat

Beberapa jenis bakteri dapat menggunakan senyawa sitrat sebagai sumber karbon (C) bagi
pertumbuhannya kemampuan ini merupakan sifat yang perlu diamati dalam identifikasi
bakteri.

Alat dan bahan :

 Biakan bacilus subtilis dan E.coli

 Beberapa tabung medium miring simmons citrate agar
 Jarum ose

Cara kerja :

1. Inokulasikan E.coli masing-masing kedalam medium simmons citrate agar

2. Inkubasikan selam 24-48 jam pada suhu 37ºC
3. Amati pertumbuhan dan perubahan warna yang terjadi bandingkan dengan tabung
medium yang tidak diinokulasikan.

5. Uji Katalase

Kebanyakan bakteri aerobic dan anaerobic fakultatif yang menggunakan oksigen menghasilkan
hidrogen peroksida yang bersifat toksik (racun) bagi sistem-sistem enzim bakteri tersebut,
namun bakteri tersebut dapat tetap hidup dengan dihasilkannya enzim katalase yang dapat
mengubah peroksida menjadi air dan oksigen.

Alat dan bahan :

25
 Biakan E.coli yang berumur 24 jam
 Larutan H2O2 3%
 Gelas obyek
 Jarum ose

Cara kerja :

1. Bersihkan gelas obyek teteskan beberapa tetes larutan H2O2 3% di atas gelas objek
tersebut
2. Ambil sedikit biakan B.subtilis dengan ose letakan didalam tetesan H2O2
3. Lakukan hal yang sama untuk biakan E.coli
4. Amati adanya gelembung-gelembung O2 didalam tetesan H2O2

Pertanyaan – Pertanyaan Diskusi :

a) Apa fungsi dari dari masing – masing uji biokimiawi dalam pengujian mikrobiologi?
b) Jelaskan reaksi biokimiawi dalam uji yang telah dilakukan dalam praktikum!

26
 MODUL 7

PEWARNAAN MIKROBIOLOGI

Pengamatan dan pengenalan morfologi mikroorganisme sangat dibutuhkan untuk

mengidentifikasi jenis mikroorganisme tersebut, morfologi mikroskopik mikroorganisme akan
lebih mudah dalam kondisi tidak bergerak (fixed) dan berwarna, kapang umumnya diwarnai
dengan larutan laktofenol blue sedangkan bakteri membutuhkan beberapa larutan yang
disesuaikan dengan tuuan pengamatan pewarna bakteri lazim disebut pengecatan sebelum
diwarnai kita harus membuat dahulu preparatolesan bakteri

Ada beberapa macam pengecatan yaitu :

 Pengecat negatif : pengecat dilakukan untuk mewarnai latar belakang preparat sedangkan
bakteri itu sendiri tidak terwarnai.
 Pengecatan sederhana : pengecatan dilakukan dengan memakai satu macam larutan cat,
sel bakteri akan berwarna sesuai dengan jenis cat yang di pakai.
 Pengecetan deferensial : pengecatan dilakukan dengan berbagai macam larutan cat, hasil
dari pengecatan deferensial mengelompokan bakteri kedalam kelompok-kelompok
tertentu.

A. Pembuatan Olesan Bakteri

Alat dan bahan :

 Biakan murni bakteri (E. Coli, Staphylococcus Aureus)

 Aquadest steril
 Jarum ose
 Gelas obyek
 Alkohol 70%
 Pembakar spiritus

Cara kerja :

1. Bersihkan gelas obyek dengan alkohol 70% sampai bebas lemak

2. Ambil beberapa ose akuades steril dan letakan di atas permukaan gelas obyek.

27
3. Ambil sedikit biakan bakteri dan letakan dalam tetesan akuades ratakan campuran
tersebut sampai seluas 1 cm²
4. Biarkan mengering dengan sendirinya
5. Fiksasi dengan cara melewatkan gelas obyek diatas nyala api spiritus 3 – 4 kali

B. Pengecatan Sederhana

Alat dan bahan :

 Biakan murni (E. Coli, Staphylococcus Aureus)

 Akuades steril
 Larutan Kristal violet
 Gelas obyek
 Jarum ose
 Alkohol 70%
 Pembakar spiritus

Cara kerja :

1. Buat preparat olesan bakteri

2. Teteskan larutan Kristal violet diatas preparat oles tersebut sebanyak 1 – 2 tetes biakan 1
– 2 menit.
3. Cuci dengan air mengalir sampai sisa cat tercuci habis lalu keringkan dengan hati-hati
memakai kertas hisap.
4. Amati dibawah mikroskop dengan menggunakan pembesar 1000x menggunakan minyak
imersi.
5. Gambar dan catat apa yang diamati.

C. Pengecatan Gram

Alat dan bahan :

 Biakan murni (E. Coli, Staphylococcus Aureus)

 Gelas obyek
 Akuades steril
 Larutan hucker’s Crystal violet (Gram A)

28
 Larutan mordan lugol’s lodine (Gram B)
 Larutan aseton (Gram C)
 Larutan Alkohol (Gram D)
 Larutan safranin (Gram E)
 Jarum ose
 Alkohol 70%
 Pembakar spiritus

Cara kerja :

1. Buat preparat olesan bakteri

2. Teteskan larutan Gram A sebanyak 2-3 tetes pada olesan bakteri diamkan selama 1 menit.
3. Cuci dengan air mengalir lalu keringkan dengan kertas hisap secara hati-hati
4. Teteskan larutan Gram B biarkan 1 menit lalu bilas kemudian keringkan dengan kertas
hisap.
5. Teteskan larutan Gram C biarkan 30 detik lalu bilas, setelah itu teteskan Gram D biarkan
30 detik lalu bilas dan keringkan dan keringkan.
6. Teteskan dengan larutan Gram E biarkan 30 detik, bilas kemudian keringkan.
7. Amati dibawah mikroskop dengan perbesaran 1000x menggunakan minyak imersi dan
gambarkan.

D. Pengecatan Negatif

Alat dan bahan :

 Biakan (E. Coli, Staphylococcus Aureus)

 Gelas obyek
 Larutan nigrosin/tinta cina
 Jarum ose
 Alkohol 70%
 Pembakar spiritus

Cara kerja :

1. Bersihkan gelas obyek dengan alkohol 70% sampai bebas lemak

2. Tetskan larutan nigrosin diatas gelas obyek

29
3. Ambil sedikit biakan bakteri dengan jarum ose dan letakan dalam tetesan larutan nigrosin
tersebut.
4. Letakan ujung gelas obyek lain diatas larutan tersebut dengan kemiringan 45º lalu dorong
perlahan agr merata.
5. Biarkan preparat mongering.
6. Amati dibawah mikroskop dengan perbesaran 1000x menggunakan minyak imersi
7. Gambar dan catatlah hasil pengamatannya.

E. Pewarnaan Kapang

Alat dan bahan :

 Biakan Rhizopus sp.

 Gelas obyek dan kaca penutup
 Larutan lakiofenol blue
 Jarum ose dan jarum tanam tajam
 Alkohol 70%
 Pembakar spiritus

Cara kerja :

1. Bersihkan gelas obyek dengan alkohol 70% sampai bebas lemak

2. Teteskan larutan lactophenol blue diatas gelas obyek
3. Ambil sedikit biakan kapang dengan jarum tajam dan letakan dalam tetesan larutan
laktofenol blue tersebut dan uraikan menggunakan jarum tanam tajam secara hati-hati
usahakan seluruh miselium basah terkena laktofenol
4. Tutuplah dengan kaca penutup sedemikian rupa sehingga tidak terdapat gelembung udara
dalam preparat bersihkan kelebihan laktofenol dengan kertas hisap.
5. Amati dibawah mikroskop dengan perbesaran obyektif 10x dan 45x
6. Gambar dan catatlah hasil pengamatan

Pertanyaan – Pertanyaan Diskusi :

a) Mengapa untuk identifikasi bakteri pengecatan gram perlu dilakukan?

b) Pengamatan apa saja yang bisa digunakan sebagai parameter untuk mengidentifikasi dan
mendeterminasi bakteri tak dikenal?
c) Jelaskan mekanisme reaksi biokimiawi yang Anda uji dalam praktikum ini!

30
 DAFTAR PUSTAKA

Benson, H.J. (1973). Microbiological Applications, A Laboratory Manual in General

Microbiology. 2nd ed. lowa: W.M.C. Brown Co. Publ. Dubuque.

Brooks G. F, et al. (2005). Jawetz, Melnick & Adelberg’s. Medical Microbiology. Twenty
Second. Ed. Penerbit Salemba Medika. Jakarta.

Diliello, L.R. (1982). Methods in Food and Dairy Microbiology. Connecticut: Avi Publ. Co.
Inc. Westport.

Fardiaz, S. (1994). Analisis Mikrobiologi Pangan. Jakarta: Raja Grafindo Persada.

Frazier, W.C.; Merth, E.H.; and Deibel, R.H. (1968). Laboratory Manual for Food
Microbiology. 4th ed. Minneapolis: Burgess Publ. Co.

SNI, 1992, Cara Uji Cemaran Mikroba, SNI 01-2897-1992, Jakarta, pp. 4, 36

31