2

DAFTAR ISI

Daftar Isi................................................................................................................................2
Kata Pengantar.......................................................................................................................3
Tata Tertib.............................................................................................................................4
Standart Operating Procedure (SOP) Praktikum Mikrobiologi...........................................5
Panduan Penyusunan Laporan...............................................................................................6
Acara I. Pengenalan Alat....................................................................................................9
Acara II. Sterilisasi..............................................................................................................11
Acara III. Dasar-dasar Teknik Mikrobiologi...................................................................13
A. Media dan Cara Pembuatan Media............................................................................13
B. Teknik Isolasi Mikroba.............................................................................................15
C. Teknik Pemurnian Kultur Mikroba...........................................................................18
Acara IV. Dasar Pewarnaan Mikroba : Pewarnaan Gram.............................................19
Acara V. Penghitungan Mikroba (Enumerasi)................................................................22
Acara VI. Identifikasi dan Determinasi Bakteri..............................................................24
A. Uji Biokimiawi...........................................................................................................24
B. Determinasi Bakteri....................................................................................................25
Acara VII. Morfologi Fungi..................................................................................................26
Acara VIII. Uji Potensi Senyawa Antibiotik Secara Difusi.............................................27
A. Difusi Sumuran...........................................................................................................27
B. Difusi Paper Disk.......................................................................................................28
Acara IX. Pengaruh Faktor lingkungan terhadap Mikroba...........................................29
Daftar Pustaka........................................................................................................................32

Panduan Praktikum Mikrobiologi UIN Walisongo

 Kata Pengantar

Alhamdulillah, puji syukur kehadirat Allah SWT atas berkat rahmat dan kasih sayang-
Nya juga Panduan Praktikum Mikrobiologi ini dapat diselesaikan dengan baik. Panduan
Praktikum Mikrobiologi ini disusun untuk membantu praktikan/ mahasiswa dalam
melaksanakan praktikum mata kuliah Mikrobiologi, sehingga dapat menguasai ketrampilan di
laboratorium secara maksimal sesuai dengan apa yang didapat selama mengikuti perkuliahan.
Penuntun praktikum mikrobiologi ini mencakup pengenalan alat-alat laboratorium pada
umumnya, sterilisasi alat, cara dasar dalam pembutan medium pertumbuhan, isolasi mikroba,
pengenalan morfologi mikroba, teknik pemindahan dan pemurnian mikroba, serta
penghitungan mikroba.
Kami sadari bahwa penyusunan buku ini belum sempurna, maka masukan yang
membangun dari pembaca sangat diharapkan demi perbaikan di masa mendatang. Semoga
buku ini bermanfaat bagi kita semua.

Penyusun
 UNITY OF SCIENCESS

Artinya : “yang kepunyaan-Nya-lah kerajaan langit dan bumi, dan Dia tidak
mempunyai anak, dan tidak ada sekutu bagiNya dalam kekuasaan(Nya), dan dia
telah menciptakan segala sesuatu, dan Dia menetapkan ukuran-ukurannya
dengan serapi-rapinya” ( Al-furqaan ayat 2).

Q.S Al Furqaan Ayat 2 tersebut menjelaskan tentang penciptaan mahluk hidup

dengan segala ukuran sesuai dengan kegiatan praktikum mata kuliah ini yang
menggunakan mahluk hidup berukuran kecil (mikro) disetiap acara praktikum.
 TATA TERTIB PRAKTIKUM

1. Praktikan (mahasiswa peserta praktikum) hadir 5 menit sebelum acara praktikum

berlangsung. Keterlambatan lebih dari dari 10 menit tidak diperkenankan mengikuti
pretest. Praktikan tidak diperkenankan mengikuti praktikum apabila keterlambatan lebih
dari 15 menit.
2. Praktikan diharuskan memakai jas praktikum berwarna putih yang bersih (sebelum
memasuki laboratorium),nametag (berisi nama lengkap dan NIM), alat pelindung berupa
sarung tangan (handscoon/ gloves lateks) dan masker. Pemakaian jas praktikum dan
masker juga diwajibkan saat melakukan pengamatan hasil di luar jam praktikum.
3. Setiap praktikan harus mempelajari dan memahami teori dan prosedur kerja sebelum
praktek berlangsung. Sebelum praktikum dimulai, praktikan wajib mengumpulkan bagan
alir cara kerja beserta tujuan nya, yang merupakan prasyarat mengikuti acara praktikum
pada hari itu. Praktikan yang tidak mengumpulkan bagan alir tidak diperbolehkan
mengikuti praktikum pada hari itu.
4. Praktikan duduk sesuai kelompoknya dan bekerja secara terencana, hati-hati dan teliti.
5. Setelah selesai praktikum, alat-alat maupun bahan yang digunakan harus dikembalikan
dalam kondisi bersih dan utuh. Semua praktikan bertanggung jawab terhadap kebersihan
dan keamanan ruang praktikum, serta alat-alat yang digunakan.
6. Tidak diperkenankan bermain ponsel selama praktikum berlangsung. Setiap kelompok
hanya diperkenankan menggunakan 1 ponsel untuk dokumentasi hasil.
7. Praktikan yang memecahkan, merusakkan dan atau menghilangkan alat diharuskan
melapor ke dosen/asisten jaga dan mengganti alat tersebut secepatnya. Praktikan yang
merusakkan, memecahkan atau menghilangkan alat diwajibkan menuliskan pada blangko
yang telah disediakan di lab di bawah pengawasan dosen/assisten koordinator.
8. Tidak ada inhal. Bagi praktikan yang berhalangan hadir karena alasan sakit atau tugas
prodi/fakultas/universitas diberi kesempatan untuk mengikuti praktikum golongan lainnya
(dengan catatan praktikum golongan lain belum berlangsung). Dengan terlebih dulu
meminta ijin kepada dosen dan asisten praktikum dengan membawa surat keterangan
sakit atau surat tugas dari prodi/fakultas/universitas.
9. Setelah selesai pelaksanaan dan pengamatan praktikum, praktikan wajib membuat
Tabulasi Data Hasil yang akan dikoreksi dan disahkan oleh asisten pendamping
kelompok yang bersangkutan.
10. Pengamatan praktikum yang dilakukan di luar jam praktikum harus didampingi oleh
assisten pendamping. Praktikan bisa membuat kesepakatan dengan assisten pendamping
sesuai kebutuhan dan waktu yang diperlukan.
11. Untuk mengikuti praktikum minggu berikutnya diharuskan sudah menyerahkan Laporan
Resmi dari acara praktikum minggu sebelumnya. Keterlambatan mengumpulkan laporan
praktikum akan dikenai pengurangan nilai -5 tiap jam nya. Bila lebih dari 1 x 24 jam
tidak mengumpulkan maka nilai laporan sama dengan NOL.
 SOP PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI

Setiap praktikan akan selalu berhubungan dengan mikroba selama menjalankan

Praktikum Mikrobiologi. Untuk mencegah hal-hal yang tidak diinginkan, setiap praktikan
diharuskan mentaati peraturan yang telah ditetapkan dan menjalankan petunjuk yang
diberikan assisten/dosen.
1. Tas dan benda-benda lain yang tidak diperlukan diletakkan pada tempat yang disediakan.
Jangan sekali-kali meletakkannya di atas meja laboratorium!
2. Sekalah meja laboratorium dengan desinfektan sebelum dan sesudah kegiatan
laboratorium. Bekerjalah secara aseptis.
3. Cucilah tangan anda dengan air dan sabun sebelum dan sesudah kegiatan laboratorium.
Lakukan hal yang sama bila anda meninggalkan laboratorium untuk ke toilet.
4. Jangan merokok, makan atau minum di ruang laboratorium.
5. Jauhkan tangan anda dari mulut, hidung, mata dan telinga selama anda bekerja di
laboratorium.
6. Perlakukan semua organisme yang anda tangani sebagai patogen atau mampu
menimbulkan penyakit. Kebanyakan biakan yang disediakan laboratorium tidak
berbahaya, tetapi beberapa di antaranya berbahaya.
7. Anda tidak diperkenankan membawa keluar biakan mikroba apa pun dari ruangan
mikroba/ruangan laboratorium tanpa seizin dosen atau asisten jaga.
8. Usahakan supaya mikroba yang anda tangani tidak tercecer dan tidak tercampur.
9. Bila biakan yang sedang anda pindahkan tercecer ke lantai atau di meja praktikum,
tuangkan desinfektan di atasnya, seka dengan kertas tissue/kapas dan buang di tempat
yang disediakan untuk bahan-bahan bukan kaca yang terkontaminasi.
10. Bila anda memecahkan tabung berisi mikroba, tuangkan desinfektan ke atasnya, sapu dan
buang di tempat tersedia untuk pecahan kaca atau tuangkan spiritus kemudian bakar.
11. Bila anda terkontaminasi atau terluka, hubungi assisten/dosen jaga.
12. Buanglah sampah-sampah yang tidak terkontaminasi di tempat yang disediakan.
13. Jarum inokulasi dan ose harus disterilkan dengan cara memijarkan seluruh panjang
kawatnya sebelum dan sesudah setiap penggunaan.
14. Apabila pipet yang sama perlu digunakan lebih dari 1 kali, jangan meletakkannya
langsung di atas meja di antara penggunaan, tetapi letakkanlah pada penyangga pipet.
15. Api pada pembakar bunsen harus dimatikan pada waktu tidak digunakan.
16. Jangan membuang biakan hidup di tempat cuci.
17. Kurangi bercakap-cakap selama praktikum, agar tidak merugikan pekerjaan.
18. Setiap pengerjaan praktikum dan pengamatan harus dicatat dengan cermat.
19. Setiap praktikan wajib membersihkan mikroskop dan alat-alat setelah digunakan, selain
itu praktikan diharuskan untuk membersihkan meja kerja, memeriksa nyala api dan listrik
dipadamkan, menutup kran air dan gas, mencuci tangan dengan desinfektan, menyapu
dan mengepel lantai laboratorium mematikan blower dan lampu kemudian melapor ke
assisten/dosen jaga. Tiap acara praktikum akan digilir petugas piket berdasar kelompok.
20. Cucilah jas laboratorium anda sehingga selalu bersih pada waktu anda datang kembali ke
laboratorium pada waktu berikutnya. Gunakanlah sarung tangan dan masker yang selalu
baru di setiap praktikum mikrobiologi.
 PANDUAN PENYUSUNAN LAPORAN PRAKTIKUM

1. Masing-masing praktikan diwajibkan membuat laporan lengkap ditulis tangan pada

kertas A4 yang mencakup:
a. Halaman judul, yang berisi acara praktikum dan identitas praktikan (nama dan
NIM).
b. Halaman isi yang berisi latar belakang, tujuan praktikum, alat dan bahan,
prosedur kerja, hasil pengamatan (berupa data yang telah diolah dan foto),
pembahasan, kesimpulan, daftar pustaka, dan lampiran (bisa berupa data
sementara, perhitungan kasar, dokumentasi pelengkap).
2. Tidak diperkenankan melakukan plagiarisme. Lakukan paraphrase untuk kutipan
pustaka pendukung. Praktikan dikatakan plagiasi antar praktikan apabila terdapat 2
buah kalimat berurutan yang sama persis. Praktikan yang melakukan plasgiasi akan
dipanggil oleh tim asisten dan dosen dengan kemungkinan terburuk nilai laporan
bersangkutan sama dengan NOL.

CONTOH FORMAT LAPORAN PRAKTIKUM :

JUDUL ACARA
A. LATAR BELAKANG (Bobot nilai 15). (diisi dengan alasan dan pentingnya
melakukan acara praktikum tersebut dengan didukung data penelitian lain dan teori
yang relevan. Penulisan pustaka data dan teori disertai sitasi)
B. TUJUAN : (Bobot nilai 5). (diisi tujuan mata acara praktikum)
C. ALAT DAN BAHAN (Bobot nilai 5). (diisi alat dan bahan yang digunakan pada
acara praktikum)
D. PROSEDUR KERJA (Bobot nilai 10). (diisi prosedur kerja dalam bentuk paragraf,
ditulis dengan kalimat pasif secara sistematis langkah-langkah penelitian dengan jelas
dan lengkap)
E. HASIL PENGAMATAN (Bobot nilai : 15) : (tulis hasil pengamatan,bisa dalam
bentuk gambar, kurva, tabel dsb. beserta keterangannya)
F. PEMBAHASAN (Bobot Nilai : 30). (pembahasan disesuaikan dengan data hasil
pengamatan disertai teori-teori atau data pendukung dari pustaka yang mendasari
materi mata acara praktikum tersebut. Pustaka yang diacu minimal dari 5 sumber, 4
berbahasa Indonesia dan 1 berbahasa asing berupa buku atau jurnal penelitian terkait
praktikum, tahun sumber pustaka di atas tahun 1998).
G. SIMPULAN (Bobot nilai : 10) (disesuaikan dengan tujuan)
H. DAFTAR PUSTAKA (Bobot nilai : 5): (tulis pustaka yang dijadikan acuan).
Contoh penulisan pustaka :
Daftar Pustaka hanya memuat pustaka yang diacu dan disusun menurut sistem
Harvard. Tata cara penulisan daftar pustaka diatur sebagai berikut:
1) Buku
Nama belakang penulis, singkatan Nama Depan., tahun terbit, Judul Buku, jilid,
edisi, Nama Penerbit, Kota, nomor halaman yang diacu (kecuali seluruh buku).
Contoh:
 a) Buku yang dikarang oleh satu orang
Block, J.H., 2004, Wilson and Gisvold’s Textbook of Organic Medicinal and
Pharmaceutical Chemistry, 11th ed., Lippincott Williams and Wilkins, Baltimore,
pp. 282, 289.
b) Buku yang dikarang oleh sampai 2 sampai 6 orang.
Williams, D.A. and Lemke, T.L., 2002, Foye‟s Principals of Medicinal Chemistry,
5th ed., Lippincot Williams and Wilkins, Philadelphia, pp. 869-870, 875-879.
e) Prosiding/Risalah pertama ilmiah
Widayati, A., dan Suhadi, R., 2004, Studi Kasus Penggunaan Antibiotika di Ruian
ICU Rumah Sakit X Yogyakarta Periode Januari-Juni 2004, Risalah Temu Ilmiah
Bidang Farmasi Klinis, Fakultas Farmasi UGM, Yogyakarta.
2) Artikel (Jurnal, Majalah dan lain-lain)
Nama belakang penulis, Singkatan Nama Depan., tahun terbit, Judul Makalah,
Nama Majalah Dengan Singkatan Resminya, Jilid atau volume (nomor penerbitan),
nomor halaman yang diacu.
Contoh:
a) Artikel disusun oleh satu penulis
Barnes, J., 2002, Herbal Therapeutic; Insomnia, The Pharmaceutical Journal, 269,
219-221.
b) Artikel disusun oleh 2-6 penulis
Tahir, I., Mudasir, Yulistia, I., and Mustofa, 2005, Quantitative Structure-Activity
Relationship Analysis (QSAR) of Vincadifformine Analogues as The
Antiplasmodial Compounds of The Chloroquinosensible Strain,Indo. J.Chem., 5
(3), 255-260.
3) Dokumen Lembaga Resmi
Contoh:
Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan RI, 1995,
Farmakope Indonesia, Jilid IV, Departemen Kesehatan Republik
Indonesia, Jilid IV, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta.

4) Terjemahan
Penulisan mengikuti cara penulisan daftar pustaka butir buku, menggunakan tahun
penerbitan asli.
Contoh:
Munson, J.W., 1991, Pharmaceutical Analysis Modern Method, diterjemahkan
oleh Harjana, Parwa B., Hal. 15, 33-34, Universitas Airlangga Press, Surabaya.
5) Skripsi, Tesis, dan Disertasi
Yuliana, 2005, Hubungan Kuantitatif Struktur dan Aktivitas Antimugen Senyawa
Turunan Benzalaseton Menggunakan Pendekatan Principal Component Analysis,
Tesis, 44, Universitas Gadjah Mada.
7) Laporan Penelitian
Harnita, A.N.I., 2005, Analisis Tiamin, Riboflavin dan Piridoksin dalam Beral
Bumipol 50 dari hasil Pertanian Organik dengan Metode High Perfomance
Liquid
 Chromatography, Laporan Penilitian, Fakultas Farmasi Universitas Sanata
Dharma, Yogyakarta.
8) Artikel elektronik (internet)
Dewi, R.M., 2002, Center for Research and Development of Disease
Control, NIHRD, www.digilib.litbang.depkes.go.id , diakses tanggal 25 april
2013.

I. LAMPIRAN (berisi fotocopy data sementara, perhitungan kasar dan dokumentasi

kegiatan jika diperlukan)

Contoh halaman judul laporan lengkap

LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI

Judul Acara

Disusun oleh: Nama lengkap / NIM

Kelompok Praktikum / Kelas Nama Asisten:

LABORATORIUM BIOKIMIA FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI UNIVERSITAS WALISONGO SEMARANG

2018
 ACARA I
PENGENALAN ALAT PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI

A. TUJUAN :
Mengenal bermacam-macam alat dan cara penggunaannya secara benar pada praktikum
mikrobiologi.

B. DASAR TEORI DAN:

Pengenalan alat-alat laboratorium yang digunakan dalam praktikum mikrobiologi perlu
dilakukan untuk keefektifan dan keselamatan kerja penelitian mikrobiologi. Pengetahuan
mengenai prinsip kerja dan prosedur penggunaan alat diharapkan dapat meminimalisir
kerusakan alat dan ketidaktepatan hasil praktikum maupun penelitian. Alat-alat yang
digunakan dalam praktikum mikrobiologi terdiri dari golongan alat gelas (glassware), alat
preparasi, alat bantu penglihatan, dan alat bantu penghitungan.
1. Alat gelas
a. Jarum ose/ loop/sengkelit digunakan untuk menanam mikroba dengan cara
goresan/streak.
b. Batang bengkok/spreader/batang Drigalsky digunakan untuk menanam mikroba
dengan cara sebar/pulasan/spread.
c. Jarum enten digunakan untuk mengambil mikroba berupa biakan jamur/fungi.
d. Jarum inokulasi/needle digunakan untuk menanam mikroba dengan cara tusukan.
e. Gelas Beaker: digunakan untuk pembuatan media dan pemanasan.
f. Erlenmeyer digunakan sebagai wadah media atau biakan kultur mikroba.
g. Pipet ukur & pompa/ filler pump, micropipette & microtip digunakan untuk
mengambil larutan secara akurat.
h. Tabung reaksi digunakan untuk sediaan kultur mikroba atau pengujian fisiologis
mikroba.
i. Gelas ukur digunakan untuk mengambil larutan dalam jumlah tertentu.
j. Cawan petri/ petridish: digunakan untuk
k. Alat-alat lain: mikropipet, pelobang sumuran (core borer), lampu bunsen, kaca
obyek, kaca obyek cekung, kaca penutup, gelas arloji/ timbang, filter bakteri,
tabung Durham.
2. Alat preparasi
a. Microbiological Safety Cabinet (MSC)/ Laminar Air Flow adalah ruang/lemari
tempat menanam mikroba
b. Autoklaf digunakan untuk sterilisasi alat/bahan/media tertentu dengan menggunakan
uap panas bertekanan (moist heat).
c. Inkubator digunakan untuk inkubasi media yang telah ditanami mikroba dengan
suhu tertentu dan untuk menyimpan bahan pemeriksaan di mana mikroba yang
terkandung akan mati bila disimpan dalam lemari es.
d. Lemari pendingin/refrigerator digunakan untuk menyimpan media steril yang siap
pakai agar isi dan mutu media tersebut tidak berubah, menyimpan untuk sementara
waktu bahan/spesimen yang belum sempat diperiksa agar tidak mengalami
 perubahan dan menyimpan cakram antibiotik/antibiotic disk yang belum dipakai
agar tidak mengalami perubahan.
e. Timbangan digital/ neraca tiga lengan digunakan untuk menakar bahan kering
secara akurat.
f. Shaker incubator : digunakan untuk tempat inkubasi mikroba yang membutuhkan
aerasi yang baik.
g. Vortex : digunakan untuk mengaduk atau mencampur suspense supaya homogen.
3. Alat bantu penglihatan
Mikroskop : digunakan untuk melihat morfologi mikroskopis sel mikroba dengan
berbagai perbesaran.
Lup : digunakan untuk membantu melihat morfologi makroskopis mikroba
4. Alat bantu penghitungan
a. Colony counter : digunakan untuk melihat dan menghitung jumlah koloni mikroba
di dalam cawan petri secara otomatis, juga untuk menghitung diameter koloni.
b. Hand counter : digunakan untuk membantu dalam penghitungan jumlah koloni
mikroba dalam cawan petri secara manual.
c. Petroff hausser chamber/ Haemasitometer : digunakan untuk melihat sel mikroba
dalam perhitungan langsung.

C. PROSEDUR KERJA:
1. Simulasi/demo alat dan penjelasan mengenai cara kerja dan fungsi alat.
2. Praktek penggunaan alat dengan benar sesuai dengan fungsinya.
3. Catat fungsi dan dokumentasikan gambar tiap alat yang didemonstrasikan.
 ACARA II
STERILISASI ALAT DAN BAHAN

A. TUJUAN :
Mempelajari macam-macam teknik sterilisasi

B. DASAR TEORI
Sterilisasi dalam mikrobiologi berarti suatu proses membebaskan tiap benda atau
substansi dari semua kehidupan dalam bentuk apapun. Sterilisasi perlu dilakukan untuk
mencegah kontaminasi mikroorganisme. Sterilisasi dapat dilakukan secara langsung
dengan bahan kimia, secara mekanik maupun fisik.
1. Sterilisasi kimiawi
Senyawa kimia yang biasanya digunakan untuk sterilisasi antara lain : alcohol 70%,
fenol, formalin, detergen dan karbol.
2. Sterilisasi mekanik
Sterilisasi mekanik dapat dilakukan pada bahan cair yang tidak tahan terhadap
pemanasan, seperti dengan penyaringan/ filtrasi melalui filter berpori sangat kecil.
Contohnya antara lain: membrane milipore, berkefeld filter, chamberland filter.
3. Sterilisasi fisik
Sterilisasi fisik umumnya digunakan untuk mensterilkan alat atau bahan yang tahan
pemanasan, tekanan, dan radiasi. Sterilisasi ini dapat dilakukan melalui:
a. Sterilisasi pemanasan kering
Yaitu dengan pemijaran menggunakan api spiritus Bunsen untuk alat seperti
ose, pinset, bibir tabung reaksi dan Erlenmeyer. Cara lain yang leboh efektif
yaitu dengan menggunakan oven dengan suhu 160o C – 175o C selama 1,5 – 2
jam untuk alat-alat laboratorium yang terbuat dari kaca seperti cawan petri,
tabung reaksi, Erlenmeyer dan tabung kaca.
b. Sterilisasi pemanasan basah
Sterilisasi ini berprinsip pada pemanasan dengan perebusan, tekanan uap
tinggi. Biasanya menggunakan alat yang disebut autoklaf yang dioperasikan
dengan suhu 121o C dengan tekanan 2 atm selama 15 menit untuk bahan dan
20 menit untuk alat. Pada kondisi tersebut mikroba berspora dapat
dimusnahkan. Selain itu juga dapat menggunakan teknik pasteurisasi dengan
perebusan berselang suhu 60o C selama 15 menit kemudian diturunkan
suhunya untuk kemudian dipanaskan kembali pada suhu 60o C.
c. Radiasi
Sterilisasi ini dilakukan dengan menggunakan sinar UV atau sinar Gamma.
Sterilisasi ini biasanya digunakan untuk mensterilisasi ruangan.

C. PROSEDUR KERJA :
1. Sterilisasi kering (menggunakan oven)
a. Alat-alat yang akan disterilkan dibungkus terlebih dahulu dengan kertas
atau alumunium foil.
b. Buka tutup oven, kemudian masukkan alat yang akan disterilisasi.
 c. Tutuplah oven dan hubungkan oven dengan arus listrik
d. Aturlah suhu sesuai yang dikehendaki dalam jangka waktu tertentu.
e. Biarkan suhu oven naik hingga suhu yang diinginkan dan hitung sebagai waktu
mulai sterilisasi.
f. Apabila sterilisasi telah selesai maka matikan oven dan putuskan aliran listrik.
g. Tunggu hingga oven dingin untuk mengambil alat yang disterilisasi.
2. Sterilisasi basah (menggunakan autoklaf)
a. Buka tutup autoklaf, isi penangas dengan aquades hingga batas air.
b. Masukkan bahan dan atau alat yang telah dibungkus untuk disterilisasi ke dalam
autoklaf.
c. Tutup autoklaf dan tutup kedua katup udara nya. Perhatikan cara menutup autoklaf
yang mengunakan sistem ulir sekrup yang harus diagonal dan benar-benar kencang
dalam pemasanganya. Kunci searah jarum jam.
d. Hubungkan autoklaf dengan sumber arus listrik.
e. Secara otomatis suhu autoklaf akan naik dan amati melalui indicator suhu apabila
suhu telah mencapai 121 o C dan tekanan 1,5 – 2 atm hitung 15 menit sebagai
waktu sterilisasi berlangsung. Stabilkan suhu tersebut dengan mencabut – pasang
saklar listrik secara berkala.
f. Apabila sterilisasi telah selesai maka putus arus listrik dan tunggu hingga suhu turun
atau buka “exhaust valve” untuk mengeluarkan uap air supaya tekanan turun cepat.
g. Jangan sekali-kali membuka tutup atau sekrup ulir sebelum mencapai suhu dan
tekanan NOL.
h. Apabila suhu dan tekanan sudah mencapai NOL maka bukalah sekrup ulir secara
diagonal berlawanan arah jarum jam.
i. Keluarkan alat dan bahan yang telah disetrilisasi dengan menggunakan lap
atau gloves kain. Buanglah akuades sisa sterlisisasi.
 ACARA III
DASAR - DASAR TEKNIK MIKROBIOLOGI

A. TUJUAN :
1. Mempelajari cara pembuatan media dan syarat-syarat yang dibutuhkan oleh suatu
media untuk pertumbuhan mikroba.
2. Mempelajari cara-cara pemindahan mikroba secara aseptis.
3. Mempelajari teknik-teknik isolasi dan penanaman mikroba.
4. Mengenal bermacam-macam mikroba di alam

B. DASAR TEORI DAN PROSEDUR KERJA :

1. Media dan Cara Pembuatan Media
Pembiakan mikroba di laboratorium memerlukan media yang berisi zat hara
serta lingkungan pertumbuhan yang sesuai bagi mikroba. Media adalah suatu bahan
yang digunakan untuk menumbuhkan mikroba yang terdiri atas campuran nutrisi atau
zat-zat makanan. Selain untuk menumbuhkan mikroba, media dapat juga digunakan
untuk isolasi, memperbanyak, pengujian sifat-sifat fisiologis dan perhitungan jumlah
mikroba (Lay, 1994; Jutono dkk, 1980). Syarat media yang baik untuk pertumbuhan
mikroba adalah lingkungan kehidupannya harus sesuai dengan lingkungan
pertumbuhan mikroba tersebut, yaitu : susunan makanannya (media harus
mengandung air untuk menjaga kelembaban dan untuk pertukaran zat/metabolisme,
juga mengandung sumber karbon, mineral, vitamin dan gas), tekanan osmose yaitu
harus isotonik, derajat keasaman/pH umumnya netral tapi ada juga yang alkali,
temperatur harus sesuai dan steril. Media harus mengandung semua kebutuhan untuk
pertumbuhan mikroba, yaitu: sumber energy (contoh: gula), sumber nitrogen, juga ion
inorganik essensial dan kebutuhan yang khusus, seperti vitamin (Jawetz dkk, 1996).
Berdasarkan komposisi kimianya, media dapat dibedakan menjadi media
sintetik yaitu media yang susunan kimianya diketahui dengan pasti, medium ini
biasanya digunakan untuk mempelajari kebutuhan makanan mikroba. Contohnya Mac
Conckey Agar dan Nutrient Agar. Media semi sintetik yaitu media yang terbuat dari
bahan kimia yang dicampur dengan bahan alami, contohnya media agar kentang
dekstrosa. Media non sintetik (kompleks) yaitu media yang susunan kimianya tidak
dapat diketahui dengan pasti, media ini digunakan untuk menumbuhkan dan
mempelajari taksonomi mikroba. Media ini biasanya terbuat dari bahan alami
contohnya tanah. Berdasarkan konsistensinya media dapat dibedakan menjadi : media
cair, media padat, dan media setengah padat (semisolid). Sedangkan berdasarkan
fungsinya dibedakan menjadi empat yaitu media umum, media selektif, media
diferensial, media pengaya (enrichment culture). (Joetono dkk, 1973; Jutono dkk,
1980; Jawetz dkk, 1996).
Alat dan bahan:
1) Media Nutrien Agar (NA) (Oxoid)
2) Media Nutrien Broth (NB) (Oxoid)
3) Aquades
4) Taoge
 5) Gula
6) Agar teknis
7) Timbangan
8) Panic
9) Gelas beaker
10) Cawan petri
11) Tabung reaksi
12) Batang pengaduk, spatula, pipet volume, erlenmeyer, penangas/elemen
pemanas

Cara kerja:
1) Pembuatan media Taoge Cair
a. Sebanyak 250 g taoge dibersihkan kemudian dimasak dengan 1 liter akuades
setelah mendidih dibiarkan selama 20 menit, setelah itu disaring dengan
menggunakan saringan dan diperoleh filtrat.
b. Ditambahkan gula sebanyak 60 g ke dalam filtrate dan dilakukan pemanasan
sampai gula larut.
c. Tambahkan akuades ke dalam filtrat sampau mencapai volume 1 liter
kemudian aduk sampai rata.
d. Media yang telah siap selanjutnya dimasukkan ke dalam tabung reaksi atau
Erlenmeyer sesuai kebutuhan.
e. Mulut tabung reaksi atau Erlenmeyer ditutup dengan sumbat kapas lalu
dibungkus dengan kertas atau alumuniium foil.
2) Pembuatan media Taoge Agar
a. Sebanyak 250 g taoge dibersihkan kemudian dimasak dengan 1 liter akuades
setelah mendidih dibiarkan selama 20 menit, setelah itu disaring dengan
menggunakan saringan dan diperoleh filtrat.
b. Ditambahkan gula sebanyak 60 g dan agar sebanyak 15 g ke dalam filtrat dan
dilakukan pemanasan sampai gula dan agar larut.
c. Tambahkan akuades ke dalam filtrat sampau mencapai volume 1 liter
kemudian aduk sampai rata.
d. Media yang telah siap selanjutnya dimasukkan ke dalam tabung reaksi atau
Erlenmeyer sesuai kebutuhan.
e. Mulut tabung reaksi atau Erlenmeyer ditutup dengan sumbat kapas lalu
dibungkus dengan kertas atau alumuniium foil.

2. Teknik-teknik Isolasi atau Penanaman Mikroba

Untuk menanam suatu mikroba perlu diperhatikan faktorfaktor nutrisi serta
kebutuhan akan oksigen (gas, O2 atau udara). Cara menumbuhkan mikroba yang
anaerob sangat berbeda dengan yang aerob. Mengisolasi suatu mikroba ialah
memisahkan mikroba tersebut dari lingkungannya di alam dan menumbuhkannya
sebagai biakan murni dalam medium buatan. Untuk isolasi harus diketahui cara-cara
menanam dan menumbuhkan mikroba pada medium biakan serta syarat-syarat lain
untuk pertumbuhannya (Jutono dkk, 1980). Mikroba jarang terdapat di alam dalam
keadaan murni. Kebanyakan merupakan campuran bermacam-macam spesies
mikroba. Macam-macam cara mengisolasi dan menanam mikroba adalah : 1).
Spread plate method (cara tebar/sebar), 2). Streak platemethod (cara gores), 3).
Pour plate method (cara tabur).
a. Spread PlateMethod (Cara Tebar/Sebar)
Teknik spread plate merupakan teknik isolasi mikroba dengan cara
menginokulasi kultur mikroba secara pulasan/sebaran di permukaan media agar
yang telah memadat. Metode ini dilakukan dengan mengencerkan biakan kultur
mikroba. Karena konsentrasi sel-sel mikroba pada umumnya tidak diketahui,
maka pengenceran perlu dilakukan beberapa tahap, sehingga sekurang-kurangnya
ada satu dari pengenceran itu yang mengandung koloni terpisah (30-300 koloni).
Koloni mikroba yang terpisah memungkinkan koloni tersebut dapat dihitung.
Alat dan bahan:
1. Spreader/batang bengkok/batang Drigalsky
2. Pipet volume, lampu bunsen
3. Media NA steril
4. Cawan petri
4. Kultur bakteri
5. Larutan pengencer (aquades atau NaCl fisiologis 0,9%)
Cara kerja:
1. Buatlah pengenceran 10-1 – 10-6 dari kultur murni bakteri dengan larutan
pengencer.
2. Ambil tabung reaksi yang mengandung kultur bakteri, buka dan bakar leher
tabung.
3. Pindahkan 0,1 ml kultur bakteri secara aseptis ke permukaan media NA
dalam cawan petri.
4. Bakar spreader yang sebelumnya telah dicelupkan dalam alkohol, biarkan
dingin.
5. Tebarkan/sebarkan kultur bakteri dengan spreader secarmerata dan biarkan
sampai permukaan agar mengering.
6. Setelah permukaan agar mengering, selanjutnya inkubasikan secara terbalik
selama 24 jam pada suhu kamar dan amati pertumbuhannya.
7. Bandingkan pertumbuhan dari tiap-tiap pengenceran dan bandingkan
pertumbuhannya dengan hasil teknik spread plate.
8. Catat hasil morfologi koloni hasil isolasi dalam tabel tabulasi hasil!

b. Pour PlateMethod (Cara Tabur)

Cara ini dasarnya ialah menginokulasi medium agar yang sedang mencair pada
temperatur 45-50oC dengan suspensi bahan yang mengandung mikroba, dan
menuangkannya ke dalam cawan petri steril. Setelah inkubasi akan terlihat
koloni-koloni yang tersebar di permukaan agar yang mungkin berasal dari 1 sel
bakteri, sehingga dapat diisolasi lebih lanjut (Jutono dkk, 1980).
Alat dan bahan:
1. Media NA steril
 2. Cawan petri steril
3. Kultur murni bakteri
4. Pipet volume, lampu bunsen
Cara kerja:
1. Dinginkan mediaNA dalam tabung reaksi sampai suhu ± 45- 50 0C (cirinya :
terasa hangat di kulit/tidak „kemranyas‟).
2. Buka tutup tabung yang mengandung kultur murni bakteri, dan bakar leher
botol.
3. Pindahkan 1 ml kultur murni bakteri ke dalam tabung reaksi yang
mengandung NA secara aseptis.
4. Bakar leher tabung di atas bunsen, dan tuangkan media NA yang telah
mengandung kultur murni bakteri ke dalam cawan petri.
5. Goyangkan perlahan-lahan untuk mencampur kultur bakteri dengan NA
sampai homogen. Penggoyangan petri jangan terlalu kuat. Pada saat
penuangan media, petri bisa diletakkan dalam radius maksimal 20 cm dari
sumber api (zona steril) (lihat Gambar 2).
6. Setelah agar memadat diinkubasi terbalik pada suhu kamar selama 24 jam.
Inkubasi terbalik dilakukan setelah agar memadat. Amati pertumbuhannya.
7. Catat hasil morfologi koloni hasil isolasi dalam tabel tabulasi hasil!

c. Streak PlateMethod (Cara Gores)

Cara gores umumnya digunakan untuk mengisolasi koloni mikroba pada cawan
agar sehingga didapatkan koloni terpisah dan merupakan biakan murni. Cara ini
dasarnya ialah menggoreskan suspensi bahan yang mengandung mikroba pada
permukaan medium agar yang sesuai pada cawan petri. Setelah inkubasi maka
pada bekas goresan akan tumbuh koloni-koloni terpisah yang mungkin berasal
dari 1 sel mikroba, sehingga dapat diisolasi lebih lanjut (Jutono dkk, 1980).
Penggoresan yang sempurna akan menghasilkan koloni yang terpisah. Bakteri
yang memiliki flagella seringkali membentuk koloni yang menyebar terutama
bila digunakan lempengan yang basah. Untuk mencegah hal itu harus digunakan
lempengan agar yang benar-benar kering permukaannya (Lay, 1994)
Alat dan bahan:
1. Media NA steril
2. Cawan petri
3. Kultur mikroba
4. Jarum ose
5. Lampu bunsen
Cara kerja:
1. Panaskan jarum ose hingga memijar di atas bunsen, kemudian dinginkan.
Gunakan ose yang telah dingin untuk menggores pada permukaan media agar
dalam cawan petri.
2. Ambil 1 ose kultur murni bakteri dan goreskan pada permukaan media agar
dimulai pada satu ujung. Perhatikan teknik penggoresan! Ose disentuhkan
 pada permukaan media agar dalam cawan petri, sewaktu menggores ose
dibiarkan meluncur di atas permukaan agar.
3. Setiap kali menggoreskan ose untuk kuadran berikutnya, pijarkan ose terlebih
dahulu dan biarkan dingin.
4. Inkubasikan secara terbalik pada suhu kamar selama 24 jam dan amati
pertumbuhannya.
5. Catat hasil morfologi koloni hasil isolasi dalam tabel tabulasi hasil!

Tabel 1 . Hasil pengamatan morfologi koloni

Sampel Koloni Gambar Karakteristik Krakteristik Pigmentasi Bentuk Elevasi Bentuk
ke- optik permukaan koloni tepian
Opaque Mengkilap
Translucent Tidak kilap
Transparent

Gambar 1. Bentuk-bentuk morfologi koloni

3. Teknik - Teknik Pemurnian dan Pemindahan Kultur Mikroba

Untuk membuat kultur murni dan mencegah tercemarnya biakan murni, perlu
dilakukan pemurnian dan teknik aseptik pada waktu memindahkan mikroba. Dalam
percobaan-percobaan ini akan dipelajari cara-cara memindahkan biakan murni
dengan cara aseptik.
Alat dan bahan:
1. Media NA miring dalam tabung reaksi
2. Media NA tegak dalam tabung reaksi
3. Media nutrien cair atau NB dalam tabung reaksi
4. Jarum inokulasi
5. Kultur bakteri
6. Lampu bunsen
7. Vortex mixer
Cara kerja:
1. Tandai koloni hasil isolasi yang aan dimurnikan.
2. Ambil koloni tersebut secara aseptis menggunakan jarum ose dan goreskan
secara zigzag pada permukaan media NA yang telah memadat dengan teknik
streak plate 4 kuadran.
3. Inkubasi pada suhu 36 selama 24 jam di dalam incubator.
4. Amati adanya satu koloni tunggal dalam kuadran ke-empat.
5. Pindahkan koloni tunggal terebut secara aseptis ke dalam media miring di dalam
tabung reaksi.
6. Beri label (tanggal percobaan, nama bakteri, teknik pemindahan dan
nama kelompok) dan simpan di dalam refrigerator.
 ACARA IV
PEWARNAAN SEL MIKROBA

A. TUJUAN
1. Memahami cara membuat pulasan mikroba
2. Memahami fungsi pewarnaan/ pengecatan sel mikroba.
3. Melihat bentuk sel, rangkaian sel, sifat gram (gram negatif dan gram positif) melalui
pengecatan Gram.

B. DASAR TEORI
Bakteri atau mikroba lainnya dapat dilihat dengan mikroskop cahaya tanpa
pewarnaan/pengecatan atau dengan pewarnaan/pengecatan.Pengamatan tanpa pengecatan
lebih sukar dan tidak dapat dipakai untuk melihat bagian-bagian sel dengan teliti karena
sel bakteri atau mikroba lainnya transparan atau semi transparan. Dengan pengecatan,
dapat dilihat struktur sel mikroba lebih seksama.Fungsi pengecatan adalah a).memberi
warna pada sel atau bagian-bagiannya sehingga member kontras dan tampak lebih jelas,
b). dapat untuk menunjukkan bagian-bagian struktur sel, c). membedakan mikroba satu
dengan yang lain,dan d). menentukan pH dan potensial oksidasi reduksi ekstraseluler dan
intraseluler (Jutono dkk., 1980). Pengecatan bakteri umumnya menggunakan lebih dari
satu tingkat pengecatan. Hasil pengecatan dipengaruhi oleh beberapa faktor, seperti :
fiksasi, substrat, dekolorisator dan sebagainya. Dalam pembuatan pulasan bakteri yang
siap diwarnai, perlu dilakukan fiksasi terlebih dahulu yang bertujuan antara lain : a).
mencegah mengkerutnya globula-globula protein sel, b). merubah afnitas cat, c).
mencegah terjadinya otolisis sel, d). dapat membunuh mikroba secara cepat dengan tidak
menyebabkan perubahan-perubahan bentuk atau strukturnya, e). melekatkan bakteri di
atas gelas benda dan f). membuat sel-sel lebih kuat/keras. Cara fiksasi yang paling banyak
digunakan dalam pengecatan bakteri adalah dengan membuat lapisan suspensi/pulasan
bakteri di atas gelas benda, kemudian dikeringanginkan dan dilalukan beberapa kali di
atas nyala lampu spiritus (Jutono dkk., 1980).
Teknik pewarnaan bakteri yang sering digunakan untuk membedakan bakteri sifat
Gram negated dengan Gram positif adalah Pewarnaan/ Pengecatan Gram. Pengecatan ini
dikembangkan pertama kali oleh Christian Gram (1884) dan termasuk pengecatan
differensial, karena dapat membedakan bakteri yang bersifat gram positif dan gram
negatif. Dari segi pewarnaan perbedaan antara bakteri Gram positif dan Gram
negatifdapat diamati dengan jelas. Bakteri Gram positif mengikat cat utama (crystal
violet) dengan kuat sehingga tidak dapat dilunturkan oleh cat peluntur dan tidak diwarnai
lagi oleh cat lawan (safranin), hal ini disebabkan karena sifat dinding sel dan
sitoplasmanya, yang mempunyai afinitas kuat terhadap kompleks crystal violet dan iodine
(jodium). Bakteri Gram negatif tidak mengikat cat utama secara kuat, sehingga dapat
dilunturkan oleh peluntur dan dapat diwarnai oleh cat lawan. Perbedaan sifat bakteri
Gram positif dan gram negatif tidak mutlak tegas dan spesifik, tetapi masih tergantung
pada beberapa faktor yang dapat menyebabkan variasi dalam pengecatan Gram.
C. PROSEDUR KERJA
1. Teknik preparasi pulasan
a. Alat dan bahan :
1. Gelas benda
2. Jarum ose
3. Lampu Bunsen
4. Label preparat
5. Aquades steril
6. Kultur murni bakteri
7. Penjepit gelas benda
b. Cara kerja :
1. Labellah gelas benda yang kering dan bersih. Sterilkan jarum ose dengan
memijarkannya pada nyala bunsen dan dinginkan.
2. Jika kultur dalam bentuk cair (suspensi), ambillah 1 ose penuh dan letakkan di
tengah-tengah gelas benda dan ratakan seluas ± 1 cm2
3. Jika kultur dalam medium padat, ambillah dengan jarum osesatu bagian kecil
kultur dan letakkan di tengah gelas benda yang sebelumnya telah diberi aquadest
steril dan ratakan
4. Biarkan kering dengan mengangin-anginkan gelas benda
5. Fiksasi pulasan bakteri dengan melewatkan di atas nyala bunsen (hati-hati,
jangan sampai terlalu kering/gosong), tergantung jenis pengecatannya.
6. Pulasan bakteri siap untuk diwarnai
2. Teknik Pengecatan Gram
Alat dan bahan:
1. Mikroskop cahaya
2. Crystal violet (Gram A)
3. Larutan iodine (Gram B)
4. Alkohol 96% (Gram C)
5. Safranin (Gram D)
6. Minyak immersi
7. Isolat murni bakteri
8. Gelas benda
9. Jarum ose.
Cara kerja:
1. Buatlah pulasan bakteri di atas objek gelas, keringkan dan fiksasi dengan api.
2. Teteskan cat crystal violet (Gram A) dan diamkan 30-60 detik.
3. Buanglah sisa cat dan cuci sisanya dengan air mengalir.
4. Teteskan larutan iodine (Gram B) dan diamkan selama 1 menit.
5. Cuci dengan air mengalir, kemudian di decolorisasi (di beri larutan peluntur)
dengan alkohol (Gram C) (kirakira 20 detik, hati-hati jangan sampai berlebihan
yang mengakibatkan kesalahan hasil).
6. Cuci dengan air mengalir, tambahkan larutan safranin (Gram D) selama 1-2 menit.
7. Cuci kembali dengan air mengalir, angin-anginkan dan amati di bawah mikroskop.
Apabila akan melakukan perbesaran kuat (1000x) gunakan minyak immersi.
8. Gambar hasil-hasil pengecatan bakteri dengan diberi keterangan mengenai warna
sel bakteri yang menunjukkan sifat gram dan bentuk sel.

Gambar 2. Bentuk-bentuk sel bakteri

 ACARA V
PENGHITUNGAN JUMLAH MIKROBA (ENUMERASI)

A. TUJUAN
1. Menghitung jumlah mikroba aerob yang terdapat dalam sampel.

B. DASAR TEORI
Jumlah mikroba pada suatu bahan dapat ditemukan dengan bermacam cara. Ada dua
cara perhitungan jumlah mikroba yaitu perhitungan secara langsung dan tidak langsung.
1. Perhitungan secara langsung
Cara ini dipakai untuk menentukan jumlah mikroba secara keseluruhan baik yang mati
maupun yang hidup. Beberapa teknik yang digunakan antara lain: counting chamber
menggunakan haemasitometer atau Petroff-hausser Bacteria Counter, filter membrane,
pengecatan dan pengamatan mikroskopik.
2. Perhitungan secara tidak langsung
Cara ini dapat dipakau untuk menentukan mikroba keseluruhan baik yang hidup
maupun yang mati, atau menghitung yang hidup saja tergantung teknik mana yang
digunakan. Teknik yang dipakai antara lain: menggunakan sentrifuge, berdasar
turbiditas/ kekeruhan, electronic counter, berdasar analisis kimia, berdasar berat
kering, Most Probable Number/ Jarak perhitungan terdekat, dan plate count.
Teknik plate count merupakan cara yang paling umum digunakan untuk perhitungan
jumlah mikroba. Dasarnya adalah membuat seri pengenceran bahan dengan kelipatan 10.
Dari masing-masing pengenceran diambil 1 ml dan dibuat taburan dalam cawan petri
(teknik pour plate) dengan medium agar yang sesuai. Setelah diinkubasi, koloni yang
tumbuh dihitung dari masing-masing pengenceran. Dari jumlah tiap pengenceran
kemudian dikalikan dengan faktor pengenceran ny, misal dari pengenceran 10-3 terdapat 45
bakteri maka tiap ml atau gram bahan mengandung 45.000 bakteri yang diberi satuan CFU
(colony forming unit). Pada perhitungan dengan teknik ini harus dipenuhi beberapa syarat
yaitu:
1. Jumlah koloni tiap cawan petri antara
2. Jumlah koloni bakteri tiap cawan petri antara 30-300 koloni atau mendekati 300.
3. Tidak ada spreader
4. Jika maka hasilnya dirata-rata. N1 adalah pengenceran lebih kecil. N2
pengenceran lebih besar.
5. Jika  dipakai jumlah pengenceran sebelumnya
6. Jika ada ulangan setelah memenuhi syarat maka hasilnya dirata-rata
7. Untuk fungi maka berlaku aturan berikut: Jumlah koloni tiap cawan petri antara
15-150 koloni atau mendekati 150.
8. Jika dominansi jamur gunakan jumlah yg rendah. Jika didominasi khamir gunakan
jumlah tertinggi
9. Jika ada ulangan maka hasilnya dirata-rata.
C. PROSEDUR
1. Alat dan Bahan :
a. Media Plate Count Agar (PCA) atau NA atau PDA
b. Akuades atau larutan fisiologis
c. Mikroba uji
d. Cawan petri
e. Pipet volume & filler
f. Colony Counter (alat hitung koloni)

2. Cara Kerja :
a. Beri tanda pada masing-masing cawan petri dengan label sesuai dengan tingkat
pengencerannya. Buatlah seri pengernceran 10-2 hingga 10-6.
b. Haluskan sampel misal tanah atau bahan makanan. Lalu timbang 1 gram atau ml
sampel secara aseptic.
c. Masukkan 1gram sampel tersebut secara aseptis ke dalam 99 ml aquades steril
(pengenceran 10-2) atau 9 ml (10-1) selanjutnya gojok baik-baik suspense hingga
homogeny.
d. Ambil secara aseptic 1 ml suspense dari pengenceran 10-1 tadi ke pengenceran 10-2.
Kemudian ambil 1 ml dari pengenceran 10-2 ke tabung berisi aquades 9 ml di seri
10-3. Dan seterusnya hingga pengenceran 10-6. Lebih baik lakukan secara duplo (1
kali ulangan).
e. Inokulasikan secara aseptic pengenceran 10-3 hingga 10-6 ke cawan petri steril
sebanyak 1 ml.
f. Tuangkan media NA atau PDA leleh ke dalam cawan petri dan homogenkan.
apabila media telah memadat, bungkus dan inkubasikan dalam incubator suhu 36oC
selama 24 jam.
g. Hitung koloni yang tumbuh di tiap cawan petri.
 ACARA VI
IDENTIFIKASI DAN DETERMINASI BAKTERI :
UJI BIOKIMIAWI

A. TUJUAN :
Mengidentifikasi dan mendeterminasi bakteri berdasarkan sifat-sifat biokimiawinya.

B. DASAR TEORI :
Mikroba tumbuh dan berkembang biak dengan menggunakan berbagai bahan yang
terdapat di lingkungannya. Nutrien yang terdapat di lingkungan sekelilingnya terdiri dari
molekul sederhana seperti H2S dan NH 4 + atau molekul organik yang kompleks seperti
protein dan polisakarida. Mikroba mengoksidasikan nutrien ini untuk memperoleh energi
dan prekursor untuk sintesis dinding sel, membran dan flagella. Penggunaan nutien
tergantung aktivitas metabolisme mikroba. Percobaan-percobaan dalam uji biokimiawi
mencakup berbagai uji untuk mengetahui aktivitas metabolisme mikroba. Pengamatan
aktivitas metabolisme diketahui dari kemampuan mikroba untuk menggunakan dan
menguraikan molekul kompleks, seperti zat pati, lemak, protein dan asam nukleat. Selain
itu pengamatan juga dilakukan pada molekul yang sederhana seperti asam amino dan
sakarida. Hasil dari berbagai uji ini digunakan untuk pencirian dan identifikasi mikroba
(Lay, 1994). Pada identifikasi bakteri mula-mula diamati morfologi sel individual secara
mikroskopik dan pertumbuhannya pada bermacammacam medium. Karena suatu bakteri
tidak dapat dideterminasi hanya berdasarkan sifat-sifat morfologinya saja, maka perlu
diteliti pula sifat-sifat biokimiawi dan faktor-faktor yang mempengaruhi
pertumbuhannya. Bakteri-bakteri yang morfologinya sama mungkin berbeda dalam
kebutuhan nutrisi dan persyaratan ekologi lainnya (temperatur, pH dsb) (Jutono dkk,
1980).

D. PROSEDUR KERJA :
Alat dan Bahan:
1. Isolat murni bakteri dalam NA miring dan NB (nutrien cair).
2. Reagen untuk test katalase : 10% atau 30% H2O2
3. Bahan untuk test sitrat : Simmons Citrate Agar yang mengandung indikator
Brom Thymol Blue-BTB
4. Media Nutrien Agar (NA)
5. Gelatin
6. Buku Panduan Determinasi Bakteri : Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology
(Holt et al., 2000)
7. Jarum ose
8. Pipet volume steril
Cara kerja:
1. Test Katalase
Letakkan 1-2 tetes 10 % atau 30% H2O2 pada gelas benda dan tambahkan 1 ose atau 2-3
tetes suspensi isolat murni bakteri. Amati, katalase positif ditandai oleh pembentukan
buih seketika. Bandingkan dengan kontrol (tanpa inokulasi bakteri).
2. Test Penggunaan Sitrat
Isolat murni bakteri diinokulasikan secara goresan zig zag menggunakan ose dan secara
tusukan menggunakan jarum inokulasi pada media Simmons Citrat Agar miring,
kemudian diinkubasi pada suhu kamar selama 24 jam. Perhatikan perubahan warna
dengan melihat perubahan warna dari hijau menjadi biru. Bandingkan dengan kontrol.
3. Test Hidrolisis Gelatin
Dengan cara tusukan, inokulasikan isolat murni bakteri pada media yang mengandung
gelatin sedalam ¾ bagian dari lapisan permukaan. Inkubasikan selama 24 jam pada suhu
kamar. Pada saat pengamatan, masukkan tabung perlakuan dan kontrol (media tanpa
inokulasi bakteri) dalam almari es selama 30 menit. Positif berarti terjadi pencairan.
4. Test H2S dan Fermentasi Gula-gula
Dengan menggunakan media TSIA, inokulasikan isolat murni bakteri secara goresan
menggunakan jarum ose dan secara tusukan menggunakan jarum inokulasi. Inkubasikan
selama 24 jam Pembentukan H2S ditunjukkan dengan terbentuknya endapan warna hitam.
Perubahan warna media TSIA dari merah menjadi kuning menunjukkan adanya
fermentasi gula (glukosa, sukrosa, laktosa). Amati juga apakah terbentuk gas yang
ditandai dengan pecahnya media atau terangkatnya media ke atas. Bandingkan dengan
control (media tanpa inokulasi bakteri).

II. DETERMINASI BAKTERI

Pada pengujian yang lengkap untuk determinasi bakteri, hasil-hasil pengujian dimasukkan
dalam daftar pengamatan yang disebut Descriptive Chart. Untuk determinasi bakteri
digunakan buku panduan determninasi bakteri Bergey’s Manual of Determinative
Bacteriology (Holt et al, 2000; Karakter-karakter hasil pengujian (meliputi : morfologi sel
individual dan uji biokimiawi), masing-masing digambar, ditabulasikan dan dicocokkan
dengan buku panduan determinasi bakteri yang memuat deskripsi bakteri yang telah
dikenal sehingga dapat dideterminasi identitas bakteri pada tingkat genus.
 ACARA VII
MORFOLOGI FUNGI

A. TUJUAN
1. Mengetahui bentuk sel Fungi dari berbagai sampel.

B. DASAR TEORI
Fungi merupakan salah satu kingdom yang meliputi khamir (yeast), mold/ kapang,
dan mushroom atau jamur makroskopis. Perbedaan morfologi makroskopis dan
mikroskopis kelompok fungi salah satunya adalah dengan sifat sel nya yang uniselular dan
multiseluler. Jamur benang memiliki massa berbentuk benang atau filament mulitiseluler
yang disebut hifa. Langkah awal identifikasi jamur benang adalah oengamatan
mikroskopis pada morfologi hifa: bersekat atau tidak, bercabang atau tidak, stolon atau
rhizoid, bentuk spora.
Yeast merupakan fungsi uniseluler yang bereproduksi secara aseksual dengan
budding atau cell fission. Mushroom merupakan fungi anggota Agaricales
(Basidiomycetes) yang dapat dilihat langsung dan memiliki badan buah.
Untuk pengamatan morfologi mikroskopis fungi biasanya dengan pembuatan preparat
menggunakan pewarnaan laktofenol atau methylene blue. Penggunaan pewarnaan ini
selain untuk mempermudah pengamatan sel juga untuk mengcegah penguapan dan
pengkerutan sel.

C. PROSEDUR
1. Alat dan Bahan :
a. Media Potato Dextrose Agar (PDA)
b. Aquades steril
c. Sampel uji (daun/ cabai berjamur, roti berjamur, nasi berjamur, akar anggrek)
d. Jarum inokulasi
2. Cara Kerja :
a. Teteskan pewarna methylene blue atau latofenol blue pada gelas benda
b. Tambahkan gliserol untuk menjaga viskositas sel yang nantinya akan diamati
c. Ambil sampel jamur dari bahan
d. Letakkan di gelas benda yang berisi pewarna
e. Tutup dengan gelas penutup dengan hati-hati. Usahakan tidak ada gelembung udara.
f. Amati di bawah mikroskop mulai dari perbesaran lemah.
g. Catat dan gambar sel hifa dan spora yang teramati.
 ACARA VIII
UJI POTENSI SENYAWA ANTIBIOTIK
SECARA DIFUSI SUMURAN DAN DIFUSI PAPER
DISK

A. TUJUAN :
1. Mengetahui ada tidaknya potensi antibakteri dari suatu senyawa antibiotic secara difusi
sumuran dan difusi paper disk.

B. DASAR TEORI :
Uji potensi antimikroba dapat dilakukan dengan 2 macam metode, yaitu metode difusi
dan metode dilusi. Cara pengujian potensi (daya atau kekuatan) senyawa antimikroba ada
bermacammacam, tergantung pada sifat dan bentuk sediaan senyawa antimikroba. Pada
umumnya digunakan cara pengenceran, cylinder diffusion plate method, paper disk
diffusion method dan agar dillution plate method. Prinsip kerja metode difusi adalah
terdifusinya senyawa antimikroba (misalnya antibiotik) ke dalam media padat di mana
mikroba uji (misalnya bakteri patogen) telah diinokulasikan. Metode difusi dapat
dilakukan secara paper disk dan secara sumuran. Pada metode difusi secara paper disk,
kertas disk yang mengandung antibiotik diletakkan di atas permukaan media agar yang
telah ditanam mikroba uji, setelah itu hasilnya dibaca. Penghambatan pertumbuhan
mikroba oleh antibiotik terlihat sebagai zona jernih di sekitar pertumbuhan mikroba.
Metode difusi secara sumuran dilakukan dengan membuat sumuran dengan diameter
tertentu pada media agar yang telah ditanami mikroba uji. Sumuran dibuat tegak lurus
terhadap permukaan media. Antibiotik diinokulasikan ke dalam sumuran ini dan
diinkubasikan, setelah itu hasilnya dibaca seperti pada difusi secara paper disk. Luasnya
zona jernih merupakan petunjuk kepekaan mikroba terhadap antibiotik. Selain itu, luasnya
zona jernih juga berkaitan dengan kecepatan berdifusi antibiotik dalam media (Lay, 1994;
Jawetz dkk, 1986).

C. PROSEDUR KERJA :
Alat dan Bahan :
a. Alat gelas : petridish steril, tabung reaksi, erlenmeyer, pipet ukur, gelas ukur
b. Mikropipet, pelobang gabus no. 4, jangka sorong/penggaris, jarum ose, spidol, kertas
label, vortex mixer, spreader.
c. Senyawa uji berupa antibiotik (misalnya Amoxycilllin sirup kering) dengan
variasi konsentrasi : 25; 12,5; 6,25 dan 3,125 mg/ml
d. Kultur murni bakteri uji dalam media NB umur 24 jam
e. Media nutrien agar (NA)
g. Nutrient Broth (NB) untuk pembuatan suspensi bakteri uji
h. Aquadest steril sebagai pelarut senyawa uji
i. Alkohol 70 %
Cara kerja :
a. Buatlah berbagai variasi konsentrasi senyawa uji. Pada praktikum ini dibuat 4
variasi konsentrasi senyawa uji (konsentrasi 25; 12,5; 6,25 dan 3,125 mg/ml
(Perhatikan cara pembuatan konsentrasi senyawa uji!)
b. Siapkan kultur murni bakteri uji
c. Siapkan beberapa petri berisi 20 ml media nutrient agar (NA)
d. Untuk teknik sumuran, inokulasikan kultur cair murni bakteri uji ke permukaan
media di cawan petri. Setelah meresap dan kering kemudian buatlah lubang
diameter 0,5 cm dengan pelubang agar/ core borer.
e. Kemudian masukkan senyawa uji (antibiotic) ke dalam lubang tandai berbagai
varian konsentrasi di bawah petri menggunakan spidol atau label.
f. Untuk teknik paper disk diffusion lakukan dengan merendam terlebih dahulu paper
disk diameter 0,5 cm ke dalam berbagai varian konsentrasi sanyawa uji selama 1
menit.
g. Kemudian inokulasikan bakteri secara spread plate pada cawan petri.
h. Letakkan paper disk berbagai konsentrasi pada permukaan media.
i. Inkubasikan selama 24 jam. Amati keberadaan zona jernih dan hitung diameternya.
 ACARA IX
PENGARUH FAKTOR LINGKUNGAN TERHADAP MIKROBA

A. TUJUAN
Mengetahui pengaruh suhu, pH, Oksigen, dan ion logam terhadap pertumbuhan mikroba.

B. DASAR TEORI :
Pertumbuhan dan aktivitas mikroba dapat dikendalikan dengan berbagai cara baik
secara fisik, kimia maupun biologi. Faktor pengendalian pertumbuhan mikroba meliputi
faktor abiotic dan biotik. Faktor abiotic adalah faktor yang berasal dari lingkungan luar
seperti pH, suhu, kelembapan, tekanan osmosis, tegangan muka, toleransi logam berat dan
sinar UV. Sedangkan faktor biotik adalah adanya asosiasi dengan mikroba lain baik dalam
bentuk simbiosis, sinergisme, kompetisi dan sebagainya. Adanya perubahan lingkugnan
akan berpengaruh terhadap morofologi maupun fisiologi mikroba bahkan ada yang
menjadi resisten terhadap lingkungan baru.
Faktor suhu, pH dan kebutuhan Oksigen merupakan faktor fisik penting yang
berpengaruh pada kultivasi pertumbuhan mikroba karena berkaitan dengan peranannya
dalam melakukan aktivitas metabolism. Suhu berpengaruh pada kinerja enzim. Berdasar
kesesuaian dengan suhu mikroba dapat digolongkan menjadi tiga yaitu mikroba psikrofil,
mesofil, dan thermofil. Golongan psikrofil mampu tumbuh pada kisaran suhu 5 s.d 22 oC
dengan suhu optimal yaitu 15oC. Golongan mesofil 10 s.d 47oC dengan suhu optimal 30-
45 oC. Golongan termofil mampu tumbuh pada kisaran suhu 40 s.d 85oC dengan suhu
optimal yaitu 60oC.
Sedangkan berdasarkan kesesuaian pH mikroba digolongkan menjadi tiga yaitu
alkalifil, neutrofil, dan acidofil. Golongan acidofil tumbuh pada pH 1-5 dengan pH
optimum 3, Neutrofil mampu tumbuh pada pH 6-8 dengan pH optimum 7, Alkalifil
mampu tumbuh pada pH 8-12 dengan pH optimum 10. Salah satu faktor pengendali lain
yaitu pengaruh logam berat. Banyak jenis logam berat yang bersifat toksik terhadap
mikroba, karena ion logam seperti Ag+, Hg2+, Cu2+, dan Pb+ dapat bereaksi dengan gugul
sulfhidril yang penting di dalam sel mikroba. Bahkan dapat menyebabkan kerusakan
konfirmasi protein dan DNA dan berakhir pada kematian sel mikroba. Pada kadar rendah
beberapa ion logam bersifat esensial bagi pertumbuhan sel namun kadar tinggi justru
menjadi toksik. Daya bunuh logam pada kadar yang sangat rendah terhadap mikroba
disebut daya oligodinamik. Ada beberapa mikroba yang tahan terhadap adanya ion logam
dengan cara memodifikasinya menjadi bentuk yang tidak toksik.
Sinar ultraviolet merupakan pengendali pertumbuhan yang menyebabkan lethal pada
sel mikroba yang terpajan dengan panjang gelombang antara 210 nm – 300 nm. hal ini
disebabkan sinar UV mempunyai daya ionisasi tinggi terhadap semua senyawa kimia
sehingga menyebabkan perubahan genetic atau mutasi pada mikroba.
C. PROSEDUR KERJA :
1. Pengaruh faktor penyinaran UV
Alat dan bahan:
a. Kultur murni
b. Petridish steril
c. Spatel dirgalsky
d. Media NA
e. Mikropipet
f. Yellowtip
g. Lampu UV

Cara kerja:
a. Ambil 0,1 ml kultur cair dan inokulasikan ke dalam petridish berisi media
NA yang telah memadat. Ratakan dengan spatel.
b. Beri label petridish masing-masing dengan keterangan penyinaran 5 menit dan
30 menit.
c. Paparkan petridish berisi kultur dengan sinar UV selama 5 menit dan 30
menit dengan tutup petridish yang dibuka.
d. Setelah penyinaran selesai tutup kembali petridish dan inkubasi selama 24 jam.
e. Amati pengaruh penyinaran terkait banyaknya koloni yang tumbuh.

2. Pengaruh faktor suhu

Alat dan bahan:
a. Kultur murni
b. Tabung reaksi berisi NB
c. Mikropipet
d. Yellowtip
e. Incubator suhu 37oC, refrigerator suhu 4oC, dan oven suhu 55oC.

Cara kerja:
a. Ambil 0,1 ml kultur cair dan inokulasikan ke dalam tabung reaksi berisi media NB
b. Beri label petridish masing-masing dengan keterangan penyimpanan
inkubasi suhu 37oC, 4oC, dan 55oC.
c. Inkubasi masing-masing tabung reaksi berdasar kebutuhan suhunya yaitu 37oC di
inkubator, suhu 4oC di refrigerator, dan suhu 55oC di oven, selama 24 jam.
d. Amati kekeruhan tiap tabung reaksi.

3. Pengaruh faktor pH
Alat dan bahan:
a. Kultur murni
b. Tabung reaksi berisi NB
c. Mikropipet
d. Ose
e. NaOH dan HCl
 Cara kerja:
a. Siapkan media cair NB dengan variasi pH masing-masing 3, 7, dan 9.
b. Ambil 0,1 ml kultur cair dan inokulasikan ke dalam masing-masing tabung reaksi.
c. Inkubasi pada suhu 36oC di inkubator, selama 24 jam.
d. Amati kekeruhan tiap tabung reaksi.

4. Pengaruh faktor logam

Alat dan bahan:
a. Kultur murni
b. Petridish steril
c. Pinset steril
d. Spatel dirgalsky
e. Media NA
f. Mikropipet/ pipet ukur steril
g. Bunsen spirtus

Cara kerja :
a. Siapkan kultur bakteri usia 24 jam yang akan diuji.
b. Inokulasikan secara aseptis 1 ml suspense bakteri secara spread plate ke dalam
cawan petri steril, tuang NA kemudian tunggu sampai memadat. Kemudian
letakkan uang koin tembaga di permukaan agar bagian tengah.
c. Inkubasi 24 jam kemudian amati adanya zona jernih yang menandakan adanya
daya oligodinamik ion tembaga terhadap bakteri. Ukur zona jernih yang terbentuk.
d. Catat semua data pada tabel hasil.
 DAFTAR PUSTAKA

Atlas, R. M., 1997, Principles of Microbiology, Wm. C. Brown Publishers. Iowa

Holt, et.al, 2000, Bergeys Manual of Determinative Bacteriology, Ninth Ed., Lippincott
Williams and Wilkins Philadelphia, USA.

Jawetz, and Melnick, 1996, Mikrobiologi Kedokteran, EGC, Jakarta

Jutono, J. Soedarsono, S. Hartadi, S. Kabirun S., Suhadi D., 1980, Pedoman Praktikum
Mikrobiologi Umum, Departemen Mikrobiologi, Fakultas Pertanian UGM, Yogyakarta

Lay, B., 1994, Analisis Mikroba di Laboratorium, PT Raja Grafindo Persada, Jakarta

Madigan, M.T., J.M. Martinko, and J. Parker, Brock, 2000, Biology of Microorganisms,
9th ed, Prentice Hall International Inc.,Upper Saddle River, New York

Madigan, M.T., J.M. Martinko, P.V. Dunlap and D.P. Clark, 2009, Brock Biology and
Microorganisms, 12th ed, Pearson Benjamin Cummings, San Fransisco

Pelczar, M.J., 1988, Dasar-dasar Mikrobiologi, UI Press, Jakarta.

Prescott, L.M., Habley, J.P., and Klein, D.A., 1999, Microbiology, Fourth ed., Mc Graw-
Hill, New York

Tim dosen Mikrobiologi, 2014, Panduan Praktikum Mikrobiologi, Laboratorium

Mikrobiologi, Fakultas Sains dan Teknologi UIN SUnan Kalijaga, Yogyakarta.

Tim dosen Mikrobiologi, 2016, Panduan Praktikum Mikrobiologi, Laboratorium

Mikrobiologi, Fakultas Farmasi USD, Yogyakarta.