MODUL PRAKTIKUM

MIKROBIOLOGI DAN IMUNOLOGI

Disusun oleh:
apt. Ginanjar Putri Nastiti, M. Farm
Meilina Ratna Dianti, S. Kep., Ns., M. Kep
Fidia Rizkiah Inayatilah, SST., M. Keb
Riza Ambar Sari, M. Farm

PROGRAM STUDI FARMASI

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN
UIN MAULANA MALIK IBRAHIM MALANG
2023

Buku Petunjuk Praktikum Mikrobiologi & Imunologi

 NAMA :

NIM :

KELAS :

KELOMPOK :

NO HP :

Buku Petunjuk Praktikum Mikrobiologi & Imunologi

 KATA PENGANTAR

Alhamdulillah, puji syukur dipanjatkan kehadirat Allah SWT, karena atas rahmat dan
hidayah-Nya modul praktikum mikrobiologi & parasitologi ini dapat diselesaikan. Modul
praktikum mikrobiologi & imunologi ini disusun dengan harapan dapat membantu para
mahasiswa (praktikan) untuk lebih mudah mempelajari mikrobiologi & imunologi serta
sekaligus dapat berguna sebagai pedoman dalam melaksanakan praktikum mikrobiologi &
imunologi. Materi-materi praktikum di dalam modul praktikum ini disusun dengan
memperhatikan fasilitas yang tersedia di dalam laboratorium juga pengetahuan dan
keterampilan dalam bidang mikrobiologi & imunologi yang perlu dikuasai oleh tiap mahasiswa
(praktikan). Materi-materi praktikum dalam modul praktikum ini meliputi pengenalan terhadap
alat-alat pengujian, cara pembuatan media, teknik isolasi mikroba secara umum dan teknik-
teknik yang berhubungan dengan mikroba & bakteri serta uji potensi senyawa antimikroba
dengan beberapa teknik yang dilengkapi dengan gambar sehingga memudahkan mahasiswa
(praktikan). Semoga buku petunjuk praktikum mikrobiologi ini bermanfaat bagi pemakai dan
pembaca.

Semoga buku petunjuk praktikum mikrobiologi ini bermanfaat bagi pemakai dan
pembaca.

Surabaya, Agustus 202

Tim Penyusun

Buku Petunjuk Praktikum Mikrobiologi & Imunologi

 TATA TERTIB PRAKTIKUM
MIKROBIOLOGI & IMUNOLOGI

1. Praktikan diharuskan telah memakai jas praktikum berwarna putih yang bersih (sebelum
memasuki laboratorium),nametag (Nama praktikan),alat pelindung berupa sarung
tangan (handscoon), dan masker (pada saat pengambilan dan penimbangan media,
inokulasi mikroba, isolasi mikroba dan perlakuan yang berhubungan dengan mikroba.
Pemakaian jas praktikum dan masker juga diwajibkan saat melakukan pengamatan hasil
di luar jam praktikum untuk menghindari kontaminasi dari bahan kimia maupun bakteri.
2. Praktikan (mahasiswa peserta praktikum) wajib hadir 5 menit sebelum acara praktikum
berlangsung. Keterlambatan lebih dari dari 5 menit tidak diperkenankan mengikuti
pretest. Praktikan tidak diperkenankan mengikuti praktikum apabila keterlambatan
lebih dari 15 menit
3. Setiap praktikan harus mempelajari dan memahami teori dan prosedur kerja sebelum
praktek berlangsung. Sebelum praktikum dimulai, praktikan wajib mengumpulkan
laporan sementara yang merupakan prasyarat mengikuti acara praktikum pada hari itu.
Praktikan yang tidak mengumpulkan laporan sementara, tidak diperbolehkan mengikuti
praktikum pada hari itu.
4. Semua praktikan wajib bertanggung jawab terhadap kebersihan dan keamanan ruang
praktikum, serta alat-alat yang digunakan.

5. Dilarang keras makan, merokok dan minum di dalam laboratorium

6. Praktikan yang memecahkan, merusakkan dan atau menghilangkan alat diharuskan
melapor ke dosen/asisten jaga dan mengganti alat tersebut secepatnya. Praktikan yang
merusakkan, memecahkan atau menghilangkan alat diwajibkan menuliskan pada
blangko yang telah disediakan di lab di bawah pengawasan dosen/assisten koordinator.
7. Praktikan diharuskan menjaga kemurnian bahan-bahan yang dipakai dan menjauhkan
segala macam kontaminan yang dapat mengganggu kevalidan hasil praktikum.

8. Dilarang membuang sisa atau bahan habis pakai dan pewarna sisa disembarang tempat.
Bahan-bahan tersebut harus dibuang di tempat khusus yang disediakan berdasarkan
golongan jenis sampah.

9. Laporkan segera jika terjadi kecelakaan kerja seperti kebakaran, biakan yang tumpah,
ada yang tertelan dll kepada asisten laboratorium atau pembimbing praktikum.

Buku Petunjuk Praktikum Mikrobiologi & Imunologi

 10. Tidak ada inhal. Bagi praktikan yang berhalangan hadir karena alasan sakit atau tugas
prodi/fakultas/universitas diberi kesempatan untuk mengikuti praktikum golongan
lainnya (dengan catatan praktikum golongan lain belum berlangsung). Praktikan terlebih
dulu meminta ijin kepada koordinator praktikum dengan membawa surat keterangan
sakit atau surat tugas dari prodi/fakultas/universitas kemudian koordinator praktikum
memberikan surat ijin mengikuti praktikum golongan lain.
11. Setelah selesai pelaksanaan dan pengamatan praktikum, praktikan wajib membuat Data
sementara dalam laporan sementara yang akan dikoreksi oleh asisten pendamping
kelompok yang bersangkutan. Data sementara yang sudah disetujui asisten bisa
langsung dibawa pulang untuk dibuat Laporan Resmi mata acara praktikum pada hari
itu. Pengamatan dilakukan sesuai kebutuhan dan waktu yang telah ditentukan.
12. Pengamatan praktikum yang dilakukan di luar jam praktikum harus didampingi oleh
assisten pendamping kelompok yang bersangkutan.
13. Untuk mengikuti praktikum minggu berikutnya diharuskan sudah menyerahkan Laporan
Resmi dari acara praktikum minggu sebelumnya. Bila pada saat itu tidak menyerahkan
laporan, nilai laporan sama dengan NOL.
14. Bila praktikan berhalangan dan tidak dapat mengikuti acara praktikum yang
menyebabkan nilai-nilainya kosong, maka nilai akhir adalah seluruh nilai yang ada dan
kemudian dikonversi berdasar standar nilai yang telah ditetapkan.

Buku Petunjuk Praktikum Mikrobiologi & Imunologi

 DAFTAR ISI

Halaman
Kata Pengantar …………………………………………………………………………………….. i

Tata Tertib Praktikum …………………………………………………………………………………….. ii

Daftar Isi …………………………………………………………………………………….. iii

Materi I Briefing Praktikum & Pengenalan Alat

Materi II Sterilisasi Alat

Materi III Media dan Cara Pembuatan Media

Materi IV Teknik Isolasi Mikroba

Materi V Pembuatan Pulasan Bakteri

Materi VI Identikasi dan determinasi bakteri

Materi VII Uji Potensi Senyawa Antimikroba secara Difusi Sumuran

Materi VIII UAP

Buku Petunjuk Praktikum Mikrobiologi & Imunologi

 PANDUAN PENYUSUNAN LAPORAN PRAKTIKUM

1. Masing-masing praktikan diwajibkan membuat dan membawa laporan

sementara praktikum yang mencakup : acara praktikum, tujuan dan skema kerja.
Laporan sementara ini menjadi syarat praktikan mengikuti praktikum pada hari
itu. Data dan hasil pengamatan praktikum pada hari itu. Data dan hasil
pengamatan praktikum juga ditulis dan/atau digambar dalam laporan sementara
sementara yang telah disetujui oleh asisten pendamping prkatikum.

2. Laporan sementara ditulis tangan

3. Setelah pengamatan hasil, laporan sementara digunakan sebagai acuan

pembuatan laporan resmi. Laporan resmi diketik pada kertas A4 dengan batas
tepi 2 cm (atas, bawah, kanan dan kiri) yang mencakup:

a. Halaman judul, yang berisi acara praktikum dan identitas praktikan (nama
dan NIM).

b. Halaman isi yang berisi acara dan topik, tujuan praktikum, tinjuan pustaka,
alat dan bahan, skema kerja, hasil pengamatan (berupa data yang telah
diolah dan (foto), pembahasan, kesimpulan, daftar pustaka, jawaban
pertanyaan dan lampiran (fotocopy pustaka yang digunakan).

4. Laporan resmi diketik dan dibuat secara berkelompok (kelompok kecil).

5. Mencontoh atau mengkopi laporan milik orang lain/praktikan lain tidak

diperkenankan. Praktikan yang mengkopi laporan milik orang lain otomatis
mendapatkan nilai NOL.

Buku Petunjuk Praktikum Mikrobiologi & Imunologi

 MATERI I
BRIEFING & PENGENALAN ALAT

Kompetensi:

Mahasiswa mengetahui tujuan praktikum dan materi yang akan disampaikan

Mahasiswa mengenal dan mengetahui nama dan fungsi alat-alat yang umum digunakan pada
praktikum mikrobiologi & parasitologi.

Pendahuluan

Praktikum mikrobiologi & parasitologi merupakan praktikum yang berhubungan dengan

mikroba dan bakteri sehingga memerlukan beberapa alat yang mendukung pelaksanaannya
seperti autoclave, mikroskop, cawan petri, dll. Berikut beberapa alat – alat mikrobiologi yang
perlu dikenal:

1. Mikroskop Keterangan:
1. Lensa okuler, untuk memperbesar bayangan yang dibentuk lensa
objektif.
2. Revolving (pemutar lensa objektif), untuk memutar lensa objektif
sehingga mengubah pembesaran.
3. Tabung pengamatan/tabung okuler
4. Stage (meja badan), tempat meletakkan specimen.
5. Kondensor, untuk mengumpulkan cahaya agar tertuju ke lensa
objektif.
6. Lensa objektif, untuk memperbesar specimen
7. Brightness adjustmen knob (pengatur kekuatan lampu), untuk
memperbesar dan memperkecil cahaya lampu.
8. Tombol On-Off
9. Diopter adjustment ring (cincin pengatur diopter)
10. Interpupillar distance adjustment knob (pengatur jarak interpupilar)
11. Specimen holder (penjepit specimen)
12. Coarse focus knob (sekrup fokus kasar)
Untuk menaik turunkan meja benda secara kasar dan cepat
(mencari fokus)
13. Vertical feed knob (sekrup pengatur vertikal), untuk menaikkan atau
menurunkan object glass.
14. Horizontal feed knob (sekrup pengatur horisontal), untuk
menggeser ke kanan-kiri object glass.
15. Coarse focus knob (sekrup fokus kasar), menaik-turunkan meja
benda secara kasar dan cepat (untuk mencari fokus).
16. Fine focus knob ( sekrup fokus halus), menaik-turunkan meja benda
secara halus dan lambat.
17. Observation tube securing knob (sekrup pengencang tabung okuler)
18. Condensor adjustment knob (sekrup pengatur condenser) untuk
menaik turunkan kondensor.

Buku Petunjuk Praktikum Mikrobiologi & Imunologi

 2. Autoclave

Autoclave adalah alat untuk mensterilkan berbagai macam alat dan bahan yang digunakan
dalam mikrobiologi, menggunakan uap air panas bertekanan. Tekanan yang digunakan pada
umumnya 1,5 atm- 2 atm dengan suhu 121oC dan lama sterilisasi yang dilakukan biasanya 15-20
menit.

Cara penggunaan:

1. Sebelum melakukan sterilisasi cek dahulu banyaknya air dalam autoclave, jika air dari batas
yang ditentukan, maka dapat ditambah air sampai batas tersebut. Gunakan air hasil
destilasi/steril untuk menghindari terbentuknya kerak dan karat.

2. Masukkan alat dan bahan

3. Tutup dengan rapat lalu kencangkan baut pengaman agar tidak ada uap yang keluar dari bibir
autoclave dan nyalakan.

4. Tunggu sampai air mendidih sehingga uapnya memenuhi seluruh bagian autoclave, klep
pengaman ditutup (dikencangkan) dan tunggu sampai selesai. Penghitungan waktu 15-20 menit
dimulai sejak tekanan mencapai 1,5-2 atm dan nyalakan timer.

5. Jika alarm tanda selesai berbunyi, maka tunggu tekanan turun hingga sama dengan tekanan
udara di lingkungan (jarum pada preisure gauge/penunjuk tekanan menunjuk ke angka nol).
Kemudian klep-klep pengaman dibuka dan keluarkan isinya dengan hati-hati.

Buku Petunjuk Praktikum Mikrobiologi & Imunologi

 3. Neraca analitik

Neraca analitik adalah alat yang digunakan untuk

mengukur berat atau menimbang suatu zat yang
umumnya diletakkan dalam laboratorium. Neraca
atau timbangan ini memiliki tingkat ketelitian yang
cukup tinggi dan dapat menimbang zat atau benda
hingga 0,0001 g atau 0,1 mg. Prinsip kerjanya dengan
menggunakan sumber tegangan listrik yaitu stavolt
dan dilakukan peneraan terlebih dahulu sebelum
digunakan. Cara penggunaannya lebih mudah
dibandingkan dengan timbangan manual yaitu dengan meletakkan bahan atau zat yang
akan diukur pada neraca lalu dilihat angka yang tertera pada layar, angka itu merupakan
berat dari bahan yang ditimbang.

Pada praktikum mikrobiologi dan parasitologi, alat ini digunakan untuk menimbang
bahan yang akan digunakan pada pembuatan media untuk bakteri, jamur atau media
tanam kultur jaringan dan mikrobiologi dalam praktikum dengan tingkat ketelitian yang
tinggi. Komposisi penyusun media yang tidak tepat akan berpengaruh terhadap
konsentrasi zat dalam media sehingga dapat menyebabkan terjadinya kekeliruan dalam
hasil praktikum.

Batasan neraca analitik.

Alat ini memiliki batas maksimal yaitu 1 mg, jika melewati batas tersebut maka ketelitian
perhitungan akan berkurang, tidak dapat menggunakan sumber tegangan listrik yang
besar, sehingga harus menggunakan stavolt. Jika tidak, maka benang dibawah pen akan
putus, harga yang mahal.

Buku Petunjuk Praktikum Mikrobiologi & Imunologi

 4. Cawan petri (petri disc) dan tabung reaksi (test tube)

a. Cawan petri b. Tabung reaksi

Cawan petri berfungsi untuk membiakkan (kultivasi) mikroba. Medium dapat dituang ke
cawan bagian bawah dan cawan bagian atas sebagai penutup. Cawan petri tersedia dalam
berbagai macam uuran, diameter cawan yang biasa berdiameter 15 cm dapat
menampung media sebanyak 15-20ml, sedangkan cawan berdiameter 9cm kira-kira cukup
diisi media sebanyak 10 ml.

Tabung reaksi dalam praktikum mikrobiologi dan parasitologi, digunakan untuk uji-uji
biokimiawi dan tempat penumbuhan mikroba. Tabung reaksi dapat disisi media padat
maupun cair. Tutup tabung reaksi dapat berupa kapas, tutup metal, tutup plastic atau
aluminium foil. Media padat yang dimasukkan ke tabung reaksi dapat diatur menjadi 2
bentuk menurut fungsinya, yaitu media agar tegak (deep tube agar) dan agar miring
(slants agar). Untuk membuat agar miring, perlu diperhatikan tentang kemiringan media yaitu
luas permukaan yang kontak dengan udara tidak terlalu sempit atau tidak terlalu lebar dan hindari
jarak media yang terlalu dekat dengan mulut tabung karena memperbesar resiko kontaminasi.

Buku Petunjuk Praktikum Mikrobiologi & Imunologi

 5. Lampu Bunsen (pembakar spiritus) dan pH indikator universal

a. Bunsen b. pH indikator universal

Salah satu alat yang berfungsi untuk menciptakan kondisi steril adalah Bunsen (a). Api
yang menyala dapat membuat aliran udara karena oksigen dikonsumsi dari bawah dan
diharapkan kontaminan ikut terbakar dalam pola aliran udara tersebut. Untuk sterilisasi
jarum Ose atau yang lain, bagian api yang paling cocok untuk memijarkannya adalah
bagian api yang berwarna biru (paling panas). Lampu Bunsen dapat menggunakan bahan
bakar gas, alkohol, spiritus.

PH indikator universal (b) berguna untuk mengetahui pH suatu larutan. Hal ini sangat
penting dalam pembuatan media karena pH pada medium berpengaruh terhadap
pertumbuhan mikroba. KertaspH indicator dicelupkan sampai tidak ada perubahan warna
kemudian strip warna dicocokkan dengan skala warna acuan.

Buku Petunjuk Praktikum Mikrobiologi & Imunologi

 6. MIkropipet dan tip

Mikropipet adalah alat untuk memindahkan/mengambil

cairan yang bervolume cukup kecil, biasanya kurang dari
1000 µl. Banyak pilihan kapasitas dalam mikropipet,
misalnya mikropipet yang dapat diatur volume
pengambilannya (adjustable volume pipette) antara 1 µl
sampai 20 µl, atau mikropipet yang tidak bias diatur
volumenya, hanya tersedia satu pilihan volume (fixed
volume pipette) misalnya mikropipet 5 µl dalam penggunaannya mikropipet memerlukan
tip.

Cara Pemakaian:
1. Sebelum digunakan, thumb knob sebaiknya ditekan berkali-kali untuk memastikan
lancarnya mikropipet.
2. Masukkan tip bersih ke dalam nozzle/ ujung mikropipet.
3. Tekan thumb knob sampai hambatan pertama / first stop, jangan ditekan lebih ke dalam
lagi.
4. Masukkan tip ke dalam cairan sedalam 3-4mm.
5. Tahan pipet dalam posisi vertical kemudian lepasakan tekanan dari thumb knob maka
cairan akan masuk ke tip.
6. Pindahkan ujung tip ke tempat penampung yang diinginkan.
7. Tekan thumb knob sampai hambatan kedua atau tekan semaksimal mungkin maka semua
cairan akan keluar dari ujung tip.
8. Jika ingin melepas tip putar thumb knob searah jarum jam dan ditekan maka tip akan
terdorong keluar dengan sendirinya, atau menggunakan alat tambahan yang berfungsi
mendorong tip keluar.

Buku Petunjuk Praktikum Mikrobiologi & Imunologi

 MATERI II
STERILISASI ALAT, BAHAN DAN MEDIA

KOMPETENSI
Mahasiswa dapat menyiapkan dan melakukan berbagai macam prosedur sterilisasi alat-alat dan
bahan yang digunakan dalam pemeriksaan secara mikrobiologi
Mahasiswa dapat menyiapkan dan membuat media baik padat maupun cair yang berhubungan
dengan pekerjaan mikrobiologi

PENDAHULUAN
Sterilisasi merupakan suatu proses menghilangkan mikroorganisme hidup. Proses sterilisasi
umumnya merupakan tahap akhir pengolahan sediaan atau produk yang harus terbebas dari
mikroba. Sterilisasi dapat dilakukan dengan menggunakan uap air, panas kering, gas, radiasi ion,
dan dengan cara penyaringan. Sterilisasi dengan cara panas merupakan fungsi dari kombinasi
waktu dan suhu yang digunakan. Bila suhu dinaikkan, waktu yang diperlukan menjadi lebih
pendek. Konstituen penting dari jasad hidup seperti protein dan asam nukleat akan
didenaturasi sesuai dengan kecepatan naiknya suhu di atas 50oC. Sterilisasi panas dan lembab
menggunakan uap air jenuh dengan tekanan Proses sterilisasi ini dilakukan pada suhu 121oC
selama 15 menit menggunakan autoklaf. Cara ini digunakan untuk alat dan sediaan berikut :
a. Larutan atau suspensi dengan pembawa air.
b. Kain pembalut untuk bedah. Dianjurkan dilakukan pada suhu 134oC selama 3 menit.
c. Penutup dari karet atau plastik. Bila disterilkan terpisah dari wadahnya.
d. Instrumen dari logam. Pemanasan segera diperlukan untuk melindungi terjadinya
engkaratan.
e. Aparatus dari Gelas dan Wadahnya. Bila tidak dapat dengan cara pemanasan kering, seperti
bagian yang terbuat dari karet.
f. Alat gelas lainnya seperti gelas Erlemeyer, gelas piala, pipet (ukur, volume) gelas ukur, labu
tentukur, cawan Petri. Sebelumnya harus dibungkus dengan kertas perkamen atau alufoil,
sedangkan labu Erlemeyer dan labu ukur atau labu tentukur harus ditutup dengan kapas
berlemak dan dilapisi alufoil. Untuk jenis pipet dapat disimpan dalam tabung logam tembaga
atau logam tahan karat yang bertutup.
g. Media untuk Pekerjaan Mikrobiologi
Setelah dilarutkan dalam air dan diatur pHnya, dimasukkan dalam labu Erlemeyer yang sesuai,
ditutup dengan kapas berlemak dan aluminium foil baru dilakukan sterilisasi.

Buku Petunjuk Praktikum Mikrobiologi & Imunologi

Sterilisasi panas kering digunakan oven dengan suhu 170oC selama 1 jam. Cara ini digunakan
terutama untuk mensterilkan :
a. Alat gelas - perlu dilakukan pencucian dengan air yang tidak mengandung pirogen.
b. Peralatan porselin dan logam.
c. Minyak dan Lemak - termasuk injeksi dengan pembawa minyak.
d. Sediaan Serbuk - termasuk produk alami seperti talkum, yang mungkin mengandung spora
yang resisten. Pemanasan yang tinggi akan menghancurkan pirogen.

ALAT DAN BAHAN

Pipet ukur/volume, Erlenmeyer, tabung reaksi, cawan petri, botol media, gelas ukur, batang
pengaduk, spatel
- Autoklaf, Oven, Timbangan
- Alumunium foil, kapas berlemak, tali kasur, kertas label dan gunting, kertas timbang, lap
tangan, tisu, kaki tiga, kassa asbes, Bunsen
- Media Nutrien Agar, Media Nutrien Broth, dan NaCl

Buku Petunjuk Praktikum Mikrobiologi & Imunologi

PROSEDUR
PERCOBAAN PERSIAPAN DAN STERILISASI ALAT
1. Alat-alat yang akan disterilisasi dicuci bersih terlebih dahulu dan dikeringkan.
2. Tutup alat-alat yang mempunyai mulut seperti : tabung reaksi, Erlenmeyer, botol media,
gelas ukur, labu takar, dan pipet dengan kapas berlemak. Caranya adalah sebagai berikut :
ambil sepotong kapas, lipat kedua ujungnya sehingga berbentuk segiempat (besarnya
segiempat tergantung pada besarnya mulut alat). Gulung kapas sehingga berbentuk silinder
yang cukup padat dan dapat masuk ke dalam mulut alat (2/3 bagian kapas berada di dalam
mulut alat). Khusus untuk pipet, tutup kapas ini dimasukkan ke dalam mulut pipet dengan
sebatang kawat dan kapas yang terurai keluar dari bagian mulut pipet dihilangkan dengan cara
melewatkan mulut pipet melalui nyala api bunsen.
3. Sebelum disterilisasi, kapas penutup tabung, labu takar, Erlenmeyer, dan botol media ditutup
lagi dengan alumunium foil atau bahan lain yang sesuai. Demikian pula alat-alat yang
permukaannya harus steril seperti pipet, dibungkus satu persatu atau dapat ditempatkan dalam
tabung penyimpan pipet. Sedangkan untuk cawan petri, dibungkus seluruhnya dengan
alumunium foil.
4. Alat-alat gelas dan alat lain yang tidak presisi disterilisasi dengan menggunakan oven pada
suhu 1700C selama 1 jam, sedangkan alat-alat yang presisi disterilisasi menggunakan autoklaf
pada suhu 1210C selama 15-20 menit. Apabila alat-alat tersebut telah disterilisasi
menggunakan autoklaf, keringkan pada oven pengering dengan suhu 700C selama 30 menit,
untuk menghilangkan uap air yang mungkin masih tersisa pada alat. Simpan alat-alat tersebut
untuk digunakan pada praktikum selanjutnya dan jangan lupa diberi etiket supaya tidak
tertukar.

PEMBUATAN & STERILISASI MEDIA SERTA LARUTAN PENGENCER

1. Tiap kelompok, menimbang Nutrien Agar, Nutrien Broth, dan NaCl untuk pembuatan 50 mL.
Catatan : Nutrien Agar = 28 gram untuk 1000 mL, Nutrien Broth = 8 gram untuk 1000 mL, dan
NaCl fisiologis adalah 0,9% b/v.
2. Masukkan masing-masing media yang telah ditimbang ke dalam Erlenmeyer yang sudah
diberi tanda sesuai dengan nama media tersebut.
3. Tambahkan akuades 50 mL, lalu panaskan di atas nyala api bunsen sambil diaduk sampai
larutan tidak keruh lagi/jernih (awal larutan akan mendidih).
4. Tuangkan dalam botol media, lalu tutup dengan kapas dan alumunium foil serta ikat dengan
benang kasur. Setiap wadah media harus diberi etiket. 5. Contoh :

Buku Petunjuk Praktikum Mikrobiologi & Imunologi

6. Sterilisasi media yang telah dibuat dalam autoklaf pada suhu 1210C selama 15-20 menit.
(Catatan : Prosedur penggunaan autoklaf harus dikuasai sebelum menggunakan alat tersebut)
7. Setelah steril, biarkan dahulu pada suhu kamar sampai suhunya sama dengan suhu kamar,
kemudian masukkan ke dalam lemari pendingin untuk disimpan. Media dan larutan pengencer
ini, akan dipergunakan pada praktikum selanjutnya.
8. Amati apakah media dan larutan pengencer tersebut tetap steril (tetap jernih) atau telah
terkontaminasi (menjadi keruh) selama penyimpanan. Pengamatan dilakukan selama satu
minggu.

Buku Petunjuk Praktikum Mikrobiologi & Imunologi

 MATERI III
MEDIA DAN CARA PEMBUATAN MEDIA

Kompetensi: Mahasiswa mengetahui komposisi media dan cara membuat media Potato
Dextrose Agar (PDA), Potato Dekstrosa, Nutrien Agar (NA)

Pendahuluan
Media pertumbuhan mikroba adalah suatu bahan yang mengandung komponen atau nutrisi
yang diperlukan mikroba untuk pertumbuhannya. Mikroba memanfaatkan nutrisi media berupa
molekul-molekul kecil yang dirakit untuk menyusun komponen sel. Dengan media
pertumbuhan dapat dilakukan isolasi mikroba menjadi kultur murni. Media harus mengandung
unsur-unsur yang diperlukan untuk metabolisme sel yaitu berupa unsur makro seperti C, H, O,
N, P; unsur mikro seperti Fe, Mg, juga mengandung sumber karbon, protein dan vitamin.
Sumber karbon dan energi yang diperoleh antara lain dari karbohidrat, lemak, protein dan asam
organik. Sumber nitrogen mencakup asam amino, protein atau senyawa bernitrogen lain,
vitamin.

Selain itu, media tumbuh mikroba juga dibedakan berdasar sifat fisik yaitu media padat,
setengah padat dan cair. Media padat yaitu media yang mengandung agar 15% sehingga
setelah dingin media menjadi padat, media setengah padat yaitu media yang mengandung agar
0,3-0,4% sehingga menjadi sedikit kenyal, media cair yaitu media yang tidak mengandung agar,
contohnya adalah NB (Nutrient Broth), LB (Lactose Broth). Media tumbuh mikroba juga
dibedakan menjadi media sintesis yaitu media yang komposisinya diketahui jenis dan
takarannya secara pasti, misalnya Glucose Agar, Mac Conkey Agar. Media semi sintesis yaitu
media yang sebagian komposisinya diketahui secara pasti, misanya PDA. Media non sintesis
yaitu media komposisinya tidak dapat diketahui secara pasti dan biasanya langsung diekstrak
dari bahan dasarnya, misalnya Tomato Juice Agar.

Buku Petunjuk Praktikum Mikrobiologi & Imunologi

Pembuatan Media
Media Potato Dekstrosa Agar (PDA)
Bahan : 250 g kentang (potato), 20 g dekstrosa, 15-18g agar agar, 1000ml aquades, label
Alat : Gelas beker, erlenmeyer, timbangan analitik, autoclave
Cara membuat:
1. Kupas kentang dan iris menjadi bentuk dadu kecil-kecil dan timbang sebanyak 250 g.
2. Tuang 1000ml aquades ke gelas beker selanjutnya masukkan irisan kentang dan rebus
sampai lunak.
3. Saring ekstrak menggunakan kertas saring/saringan dan tamping menggunakan gelas
beaker.
4. Tambahkan aquades sampai volume mencapai 1000ml kembali
5. Masukkan 15 g agar-agar, aduk dan larutkan sampai homogeny.
6. Tambahkan 20g dektrosa, aduk dan larutkan sampai homogeny lagi.
7. Atur pH nya menjadi 6-7 dengan menambahkan larutan HCl 1N dan ukur dengan pH
indikator universal.
8. Tuang media ke Erlenmeyer dan sterilkan menggunakan autoclave.

Media Nutrien Agar (NA)

Bahan: 20 g nutrient agar, 1000 ml aquades, label
Alat : gelas Beaker, Erlenmeyer, timbangan analitik, autoclave
Cara membuat :
1. Tmbang 23 g NA, larutkan dalam 1000 ml aquades dan aduk sampai homogen,
2. Tuang ke Erlenmeyer dan atur pHnya menjadi 6-7 dengan menambahkan larutan HCl 1 N atau
NaOH 1 N dan ukur dengan pH indikator universal.
3. Sterilkan mediua menggunakan autoclave.

Buku Petunjuk Praktikum Mikrobiologi & Imunologi

 MATERI IV
TEKNIK ISOLASI MIKROBA

Kompetensi: mahasiswa dapat memisahkan mikroba dari biakan campuran sehingga diperoleh
biakan murni

Pendahuluan

Di alam populasi mikroba tidak terpisah sendiri menurut jenisnya, tetapi terdiri dari campuran berbagai
jenis. Di dalam laboratorium, populasi mikroba dapat diisolasi dari sumber / habitat seperti udara,
tanah, air, makanan dan lainnya. Hasil isolasi umumnya merupakan biakan mikroba campuran dan perlu
dimurnikan untuk memperoleh biakan murni yang terdiri dari satu jenis yang dapat dipelajari morfologi,
sifat fisiologi dan biokimiawinya. Isolasi dapat dilakukan menggunakan beberapa teknik berikut :

1. Teknik Pengenceran Bertingkat

Tujuan dari pengenceran bertingkat yaitu memperkecil atau mengurangi jumlah

mikroba yang tersuspensi dalam cairan.
1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml
1g

9 ml 9 ml 9 ml 9 ml 9 ml 9 ml 9 ml 9 ml

Penentuan besarnya atau banyaknya tingkat pengenceran tergantung kepada perkiraan jumlah
mikroba dalam sampel. Digunakan perbandingan 1 : 9 untuk sampel dari pengenceran pertama
dan selanjutnya, sehingga pengenceran berikutnya mengandung 1/10 sel mikroba dari
pengenceran sebelumnya. Cara kerjanya sebagai berikut :

Sampel yang mengandung bakteri dimasukan ke dalam tabung pengenceran pertama (1/10 atau
10-1 ) secara aseptis (dari preparasi suspensi). Perbandingan berat sampel dengan volume
tabung pertama adalah 1 : 9. Setelah sampel masuk lalu dilarutkan dengan mengocoknya

Buku Petunjuk Praktikum Mikrobiologi & Imunologi

 sampai homogen. Pengocokan dilakukan dengan cara membenturkan tabung ke telapak tangan
sampai homogen. Diambil 1 ml dari tabung 10-1 dengan mikropipet kemudian dipindahkan ke
tabung 10-2 secara aseptis kemudian dikocok dengan membenturkan tabung ke telapak tangan
sampai homogen. Pemindahan dilanjutkan hingga tabung pengenceran terakhir dengan cara
yang sama, hal yang perlu diingat bahwa tip mikropipet yang digunakan harus selalu diganti.

2. Teknik Penanaman

a. Teknik penanaman dari suspensi

Teknik penanaman ini merupakan lanjutan dari pengenceran bertingkat dan umumnya
digunakan untuk isolasi bakteri. Pengambilan suspensi dapat diambil dari pengenceran
mana saja tapi biasanya untuk tujuan isolasi (mendapatkan koloni tunggal) diambil beberapa
tabung pengenceran terakhir.

a.1. Spread Plate (agar tabor ulas)

Tehnik ini adalah teknik menanam dengan menyebarkan suspensi (terutama bakteri) di
permukaan media untuk memperoleh biakan murni. Adapun cara kerjanya sebagai berikut :
ambil 0,1 ml suspensi menggunakan mikropipet kemudian teteskan di atas permukaan
media yang telah memadat. Batang L diambil kemudian disemprot alkohol dan dibakar
diatas bunsen beberapa saat, kemudian didinginkan dan ditunggu beberapa detik. Suspensi
diratakan menggunakan batang L pada permukaan media supaya tetesan suspensi merata,
penyebaran akan lebih efektif bila cawan ikut diputar (b). Hal yang perlu diingat bahwa
batang L yang terlalu panas menyebabkan sel mikroba mati karena panas.

a b

a.2. Pour Plate (agar tuang)

Teknik ini memerlukan agar yang belum padat (±45oC) untuk dituang bersama suspensi
(terutama bakteri) ke dalam cawan petri kemudian dihomogenkan dan dibiarkan memadat.
Hal ini akan menyebarkan pertumbuhan bakteri di permukaan dan di dalam agar media
sehingga terdapat sel yang tumbuh. Adapun prosedur kerja yang dilakukan sebagai berikut :

Buku Petunjuk Praktikum Mikrobiologi & Imunologi

 Siapkan cawan steril, suspensi yang akan ditanam dan media padat yang masih cair
(±45oC).Teteskan 1 ml secara aseptis suspensi sel ke dalam cawan kosong (a).

a b

b. Teknik pembuatan goresan bakteri

Teknik goresan ini mempunyai banyak variasi dan tujuannya untuk memperoleh biakan
murni dari biakan campuran dan memperoleh koloni tunggal (terutama bakteri). Adapun
beberapa teknik goresan ini sebagai berikut:

b.1. Goresan Sinambung

Cara kerja: Sentuhkan inoculum loop pada koloni dan gores secara kontinyu sampai
setengah permukaan agar.

Jangan pijarkan loop, lalu putar cawan 180oC lanjutkan goresan sampai habis.

b.2. Goresan T

Cara kerja: bagi cawan menjadi 3 bagian menggunakan spidol marker. Inokulasi daerah 1
dengan streak zig-zag. Panaskan jarum inokulan dan tunggu dingin, kemudian lanjutkan
streak zig-zag pada daerah 2. Cawan diputar untuk memperoleh goresan yang sempurna.

2 3

Lakukan hal yang sama pada daerah 3

Buku Petunjuk Praktikum Mikrobiologi & Imunologi

 b.3. Goresan Kuadran (steak kuadran)

Cara kerja: hamper sama dengan goresan T, namun berpola goresan yang berbeda yaitu
dibagi empat. Daerah 1 merupakan goresan awal sehingga masih mengandung banyak sel
mikroba. Goresan selanjutnya dipotongkan atau disilangkan dari goresan pertama sehingga
jumlah semakin sedikit dan akhirnya terpisah-pisah menjadi koloni tunggal.

1 2

4 3

3. Isolasi Mikroba

Sebelum melakukan isolasi dilakukan pengambilan sampel dengan cara berikut:

I. Sampel dari udara
Buka cawan petri yang telah berisi media PDA dan letakkan di kebun selama 5 menit.
Tutup dan bungkus serta beli label. Inkubasikan pada suhu kamar/ruang.
II. Sampel dari tanah
Jika mikroorganisme yang diinginkan kemungkinan berada di dalam tanah, maka cara
pengambilannya bias di sekitar rhzosfer (perakaran) yaitu dekat permukaan sampai
ujung perakaran tanaman dengan kedalaman ± 10 cm.
III. Sampel air kolam
Pengambilan sampel air bergantung kepada keadaan air. Jika berasal dari air sungai
yang mengalir maka botol dicelupkan miring dengana bibir botol melawan arus air (a).
Bila pengambilan sampel dilakukan pada air yang tenang, botol dapat dicelupkan
menggunakan tali (b), jika ingin mengambil sampel dari air keran maka kran
diaseptiskan menggunakan api Bunsen beberapa saat, air dialirkan beberapa saat
kemudian ditampung di dalam botol (c).

Buku Petunjuk Praktikum Mikrobiologi & Imunologi

 Bahan : mikroba hasil penangkapan mikroba dari udara, sampel dari tanah, sampel dari air
kolam, media PDA (dalam cawan petri), alkohol 70%, spiritus.
Alat : LAF, jarum Ose, lampu bunsen
I. Hasil Penangkapan dari udara
Cara kerja:
1. Siapkan media PDA dalam cawan Petri dengan menuang / plating 10 ml media ke
cawan Petri, diamkan media memadat dan ulang dua (2) kali.
2. Pisahkan koloni jamur dan bakteri menggunakan tehnik aseptik di dalam LAF. Untuk
koloni jamur, ambil 1 loop koloni menggunakan jarum Ose, inokulasikan pada media
PDA baru, inkubasikan selama 3-5 hari pada suhu kamar (280C). Untuk koloni
bakteri, ambil 1 loop koloni menggunakan jarum Ose, inokulasikan pada media NA
menggunakan teknik goresan / streak, inkubasikan selama 24 jam pada suhu kamar
(280C). Pada teknik goresan, pengambilan koloni dilakukan 1 kali dan selanjutnya
setiap akan menggores jarum Ose diaseptiskan hingga pijar pada lampu Bunsen,
didinginkn sejenak dengan tujuan mikroba yang menempel pada jarum Ose tidak
mati.
II. Sampel dari tanah dan air kolam
Cara kerja:
1. Siapkan media PDA dalam cawan Petri dengan menuang / plating 10 ml media ke
cawan Petri, diamkan media memadat dan ulang masing-masing dua (2) kali untuk
isolasi mikroba dari tanah dan dua (2) kali untuk isolasi mikroba dari air.
2. Timbang 1 g tanah dan ambil 1 ml air kemudian lakukan pengenceran bertingkat
sebagai berikut:
1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml
1g

9 ml 9 ml 9 ml 9 ml 9 ml 9 ml 9 ml 9 ml

3. Masukkan sampel tanah ke dalam tabung pengenceran (1/10 atau 10-1) secara
aseptis. Perbandingan berat sampel dengan volume tabung pertama adalah 1:9.

Buku Petunjuk Praktikum Mikrobiologi & Imunologi

 4. Larutkan dengan mengocoknya sampai homogeny. Pengocokan dilakukan dengan
cara membenturkan tabung ke telapak tangan sampai homogeny. Ambil 1 ml dari
tabung 10-1 dengan mikropipet kemudian dipindahkan ke tabung 10-2 secara aseptis
kemudian dikocok dengan membenturkan tabung ke telapak tangan sampai
homogen. Pemindahan dilanjutkan hingga tabung pengenceran terakhir dengan
cara yang sama.
5. Ambil 1 ml suspensi dari tabung 10-6 , 10-7 , 10-8 , inokulasikan pada media PDA
menggunakan tehnik spread plate (agar tabur ulas) yaitu ambil 0,1 ml suspensi
menggunakan mikropipet kemudian teteskan di atas permukaan media yang telah
memadat.
6. Ambil batang L kemudian disemprot alkohol dan dibakar di atas bunsen beberapa
saat, kemudian didinginkan dan ditunggu beberapa detik.
7. Ratakan suspensi menggunakan batang L pada permukaan media supaya tetesan
suspensi merata, penyebaran akan lebih efektif bila cawan ikut diputar.
8. Inkubasikan pada suhu kamar (280C). Amati jenis mikroba yang tumbuh dengan
memberi tanda (+) pada jenis mikroba yang tumbuh.

Buku Petunjuk Praktikum Mikrobiologi & Imunologi

 MATERI V
PEMBUATAN PULASAN BAKTERI

Bakteri atau mikroba lainnya dapat dilihat dengan mikroskop cahaya tanpa
pewarnaan/pengecatan atau dengan pewarnaan/pengecatan.Pengamatan tanpa pengecatan lebih sukar
dan tidak dapat dipakai untuk melihat bagian-bagian sel dengan teliti karena sel bakteri atau mikroba
lainnya transparan atau semi transparan.Dengan pengecatan, dapat dilihat struktur sel mikroba lebih
seksama.Fungsi pengecatan adalah a).memberi warna pada sel atau bagian-bagiannya sehingga member
kontras dan tampak lebih jelas, b). dapat untuk menunjukkan bagian-bagian struktur sel, c).
membedakan mikroba satu dengan yang lain,dan d). menentukan pH dan potensial oksidasi reduksi
ekstraseluler dan intraseluler (Jutono dkk., 1980).
Pengecatan bakteri umumnya menggunakan lebih dari satu tingkat pengecatan. Hasil
pengecatan dipengaruhi oleh beberapa faktor, seperti : fiksasi, substrat, dekolorisator dan sebagainya.
Dalam pembuatan pulasan bakteri yang siap diwarnai, perlu dilakukan fiksasi terlebih dahulu yang
bertujuan antara lain : a). mencegah mengkerutnya globula-globula protein sel, b). merubah afnitas cat,
c). mencegah terjadinya otolisis sel, d). dapat membunuh mikroba secara cepat dengan tidak
menyebabkan perubahan-perubahan bentuk atau strukturnya, e). melekatkan bakteri di atas gelas
benda dan f). membuat sel-sel lebih kuat/keras.
Cara fiksasi yang paling banyak digunakan dalam pengecatan bakteri adalah dengan membuat
lapisan suspensi/pulasan bakteri di atas gelas benda, kemudian dikeringanginkan dan dilalukan
beberapa kali di atas nyala lampu spiritus (Jutono dkk., 1980).
Alat dan bahan:
1. Gelas benda
2. Jarum Ose
3. Lampu Bunsen
4. Label preparat
5. Aquades steril
6. Kultur murni bakteri
7. Penjepit gelas benda

Buku Petunjuk Praktikum Mikrobiologi & Imunologi

Cara kerja :
1. Labellah gelas benda yang kering dan bersih. Sterilkan jarum ose dengan memijarkannya pada
nyala bunsen dan dinginkan.
2. Jika kultur dalam bentuk cair (suspensi), ambillah 1 ose penuh dan letakkan di tengah-tengah
gelas benda dan ratakan seluas ± 1 cm2
3. Jika kultur dalam medium padat, ambillah dengan jarum ose satu bagian kecil kultur dan
letakkan di tengah gelas benda yang sebelumnya telah diberi aquadest steril dan ratakan

Dalam bentuk cair (liquida) Dalam bentuk padat (solida)

4. Biarkan kering dengan mengangin-anginkan gelas benda
5. Fiksasi pulasan bakteri dengan melewatkan di atas nyala bunsen (hati-hati, jangan sampai terlalu
kering/gosong), tergantung jenis pengecatannya.

6. Pulasan bakteri siap untuk diwarnai.

Buku Petunjuk Praktikum Mikrobiologi & Imunologi

 MATERI VI
IDENTIFIKASI DAN DETERMINASI BAKTERI:
PENGECATAN GRAM

I. PENGECATAN GRAM

A. TUJUAN: Melihat bentuk sel, rangkaian sel, sifat gram (gram negatif dan gram positif)

B. DASAR TEORI

Pengecatan ini dikembangkan pertama kali oleh Christian Gram (1884) dan termasuk
pengecatan differensial, karena dapat membedakan bakteri yang bersifat gram positif dan gram
negatif.

Dari segi pewarnaan perbedaan antara bakteri Gram positif dan Gram negatifdapat
diamati dengan jelas. Bakteri Gram positif mengikat cat utama (crystal violet) dengan kuat
sehingga tidak dapat dilunturkan oleh cat peluntur dan tidak diwarnai lagi oleh cat lawan
(safranin), hal ini disebabkan karena sifat dinding sel dan sitoplasmanya, yang mempunyai
afinitas kuat terhadap kompleks crystal violet dan iodine (jodium). Bakteri Gram negatif tidak
mengikat cat utama secara kuat, sehingga dapat dilunturkan oleh peluntur dan dapat diwarnai
oleh cat lawan.

Perbedaan sifat bakteri Gram positif dan gram negatif tidak mutlak tegas dan spesifik,
tetapi masih tergantung pada beberapa faktor yang dapat menyebabkan variasi dalam
pengecatan Gram.

C. PROSEDUR KERJA

Alat dan bahan:

1. Mikroskop cahaya
2. Crystal violet (Gram A)
3. Larutan Iodine (GramB)
4. Alkohol 96% (GramC)
5. Safranin (Gram D)

Buku Petunjuk Praktikum Mikrobiologi & Imunologi

 6. MinyakImmersi
7. Isolat murni bakteri tanah
8. Gelas benda
9. Jarum Ose

Cara kerja:
1. Buatlah pulasan bakteri di atas objek gelas, keringkan dan fiksasi dengan api.
2. Teteskan cat crystal violet (Gram A) dan diamkan 30-60 detik.

3. Buanglah sisa cat dan cuci sisanya dengan air mengalir.

4. Teteskan larutan iodine (Gram B) dan diamkan selama 1-2 menit.

5. Cuci dengan air mengalir, kemudian di decolorisasi (diberi laritan peluntur) dengan alkohol
(Gram C) (kira-kira 20 detik,hati-hati jangan sampai berlebihan yang mengakibatkan kesalahan
hasil).

6. Cuci kembali dengan air mengalir, tambahkan larutan safranin (Gram D) selama 10-20 detik.

7. Cuci kembali dengan air mengalir, angin-anginkan dan amati di bawah mikroskop dengan
perbesaran kuat (1000x) menggunakan minyak immersi.

8. Gambar hasil-hasil pengecatan bakteri dengan diberi keterangan mengenai warna sel bakteri
yang menunjukkan sifat gram dan bentuk sel.

Buku Petunjuk Praktikum Mikrobiologi & Imunologi

 MATERI VII
UJI POTENSI SENYAWA ANTIBIOTIK SECARA DIFUSI SUMURAN

A. TUJUAN:
Mengetahui Mengetahui ada tidaknya potensi antibakteri dari suatu senyawa antimikroba,
misalnya antibiotik, secara difusi sumuran dan difusi paper disk.

B.DASARTEORI:
Ujipotensi antimikroba dapat dilakukan dengan 2 macammetode,yaitu Difusi dan Dilusi.
Cara pengujian potensi (daya atau kekuatan ) senyawa amnntimikroba ada bermacam-
macam,tergantung pada sifat danbentuksediaan senyawa antimikroba.Pada umumnya
digunakancara pengenceran, cylinder diffusion plate method,paper diskdiffusion method dan
agar dilution plate method.
Pada metode difusi secara paper disk, kertas disk yang mengandung antibiotik
diletakkan di atas permukaan media agar yang telah ditanam mikroba uji, setelah itu hasilnya
dibaca. Penghambatan pertumbuhan mikroba oleh antibiotik terlihat sebagai zona jernih di
sekitar pertumbuhan mikroba. Metode difusi secara sumuran dilakukan dengan membuat
sumuran dengan diameter tertentu pada media agar yang telah ditanami mikroba uji. Sumuran
dibuat tegak lurus terhadap permukaan media. Antibiotik diinokulasikan ke dalam sumuran ini
dan diinkubasikan, setelah itu hasilnya dibaca seperti pada difusi secara paper disk. Luasnya
zona jernih merupakan petunjuk kepekaan mikroba terhadap antibiotik.
Selain itu, luasnya zona jernih juga berkaitan dengan kecepatan berdifusi antibiotik
dalam media (Lay, 1994; Jawetz dkk, 1986)

Buku Petunjuk Praktikum Mikrobiologi & Imunologi

C. PROSEDUR KERJA
1. Uji Potensi Senyawa Antibniotik secara Difusi Sumuran
Alat dan Bahan
1. Alat gelas: petridisk steril,tabung reaksi, erlenmeyer,pipet ukur,pipettetes, gelasukur.
2. Mikropipet,pelobang gabus no.4, jangka sorong/penggaris, jarum ose, spidol, kertas
label, vortex mixer, spreader.
3. Senyawa uji berupa antibiotik (misalnya Amoxycillin sirup kering) dengan variasi
konsentrasi: 25; 12,5; 6,25 dan 3,125mg/ml
4. Kulktur murni bakteri uji dalam media NB umur 24 jam.
5. Media nutrien agar (NA)
6. Deret larutan standar Mac Farlan
7. Nutrient Broth (NB) untukpembuiatan suspensi baktertiuji
8. Aquadest sterilsebagai pelarut senyawauji
9. Alkohol 70%.

Cara kerja:
a. Preparasi Senyawa Uji
Preparasi senyawa uji dilakukan sesuai petunjuk dalam kemasan, kemudian buatlah berbagai
variasi konsentrasi senyawa uji. Pada praktikum ini dibuat 4 variasi konsentrasi senyawa uji
(konsentrasi 25; 12,5; 6,25 dan 3,125 mg/ml (Perhatikan cara pembuatan konsentrasi senyawa
uji!) .
b. Preparasi Mikroba Uji
1. Siapkan kultur murni bakteri uji
2. Siapkan deret larutan standart Mac Farland
3. Buat sebanyak 2 tabung @10ml suspensi bakteriuji menggunakan media BPW dan
setarakan kekeruhannya dengan larutan standar Mac Farland II (konsentrasi mikroba
6.108 CFU/ml)
c. Pengujian potensi antibiotik secara difusi sumuran
1) Siapkan beberapa petri berisi 20ml media nutrient agar (NA) 15ml NA dan5 ml NA steril

Buku Petunjuk Praktikum Mikrobiologi & Imunologi

 2) Pembuatan kontrol kontaminasi media
a). Buka petri berisi 20 media NA, secara aseptis buatlah sumuran pada petri 1) dengan
pelobang gabus no. 4. Ambil bulatan NA pada sumur yang dibuat dengan jarum ose
secara hati-hati sehingga NA di sekelilingnya tidak tergores/rusak. Masukkan bulatan NA
tersebut dalam beker glass berisi alkohol.
b). Beri label pada dasar petri: Kelompokprakt/tgl/perlakuan.
3) Pembuatan kontrol pertumbuhan bakteri uji secara double layer
a. Tuang 5ml NA steril ke dalam caawan petri steril, biarkan memadat sebagai base layer
agar.
b. Ambil 1 ml suspensi bakteri uji, inokulasikan ke dalam 15 ml media NA secara pour
plate, kemudian tuangkan secara merata sebagai seed layer agar di atas base layer agar,
biarkan memadat
c. Buat 1 sumuran dengan menggunakan pelubang gabus No. 4. Pembuatan sumuran
dilakukan sampai dasar seed layer agar dan tidak menembus base layer agar yang
berfungsi sebagai dasar sumuran.
d. Berilabel pada dasar petri: Kelompok prakt/tgl/perlakuan
4) Pembuatan kontrol negatif dan pengujian potensi antibiotik secara difusi sumuran.
a. Buatlah media base layer dan seed layer agar (seperti pada tahap3). Bagian dasar
petri dibuat garis dengan spidol untuk membaginya menjadi 4.
b. Buat sumuran pada bagian tengah ke-4 bidang petri tersebut dengan cara yang sama
dengan no. 3).
c. Dengan menggunakan mikropipet,pada masing-masing sumuran tersebut
diinokulasikan 50µlsenyawa uji dengan kontrol negatif/pelarut dan 4 variasi konsentrasi
senyawa uji.
d. Beri label pada dasar petri secara benar.
e.Inkubasikan selama 24 jam. Perhatian: inkubasi tidak dilakukan secaraterbalik! Amati
zona keruh dan jernih di setiap petri.
f. Amati,gambar pertumbuhannya. Ukur diameter zona jernih di sekitar sumuran
dengan janmgka sorong/penggaris. Hitung diameteer zona hambat yg terbentuk.

Buku Petunjuk Praktikum Mikrobiologi & Imunologi

Catatan:
Langkah a dikerjakan untuk 1 golongan praktikum (dikerjakan oleh praktikan meja I untuk
dipakai I golonganpraktikum).
Langkah b dikerjakan per meja
Langkah c no. 2,3,4: Kelompok praktikum 1 mengerjakan 2 & 4
Kelompok praktikum 2 mengerjakan 3 & 4
Kelompok praktikum 3 mengerjakan 2 & 4
Kelompok praktikum 4 mengerjakan 3 & 4
Kelompok praktikum 5 mengerjakan 2 & 4
Kelompok praktikum 6 mengerjakan 3 & 4

c. Pengujian Potensi Antibiotik secara Difusi Paper Disk

Alat dan Bahan:
a. Alat-alat: petridisk, pinset, pipet volume steril
b. Kultur murni bakteri uji dalammedia NB umur 24jam
c. Disk antibiotik (paper disk yang mengandung antibiotik penisilin/ampisilin) sebagai
kontrol positif
d. Disk blank
e. Senyawa uji berupa antibiotik (misalnya Amoxycillinsirup kering) dengan variasi
konsnetrasi: 25; 12,5; 6,25 dan 3,125 mg/ml
f. Media Nutrient Agar (NA)
g. Deret laruitan standar Mac Farland
h. Buffered Pepton Water (BPW) untukpembuatan suspensi bakteriuji
i. Aquadeststerilsebagaipelarut senyawa uji
j. Alkohol 70%

Buku Petunjuk Praktikum Mikrobiologi & Imunologi

Cara Kerja:
a. Preparasi Mikroba Uji
1) Siapkan kultur murni bakteri uji.
2) Siapkan deret larutan standard Mac Farland
3) Buat 10 ml suspensi bakteri uji menggunakan media BPW dan setarakan kekeruhannya
dengan larutan standar Mac farland II (konsentrasi mikroba 6.108 CFU/ml).
b. Pengujian potensi antibiotik secaradifusi paper disk
1) Pembuatan kontrol kontaminasi media
a) Siapkan 20 ml media a NA dan tuang secara aseptis ke dalam petri steril, biarkan
memadat
b) Berilabel pada dasar petri: Kelompok prakt/tgl/perlakuan
2) Pembuatan kontrol pertumbuhan bakteri uji
a) Ambil 0,2 ml suspensi bakteri uji, inokulasikan ke petri berisi media NA secara
spread plate (harus merata seluruh permukaan media) dan biarkan permukaan agar
mengering.
b) Berilabel pada dasar petri: Kelompok prakt/tgl/perlakuan/ nama bakteri uji
3) Pengujian potensi antibiotik secara difusi paperdisk
a) Siapkan petri berisi 20ml media nutrien agar (NA)
b) Ambil 0,2 ml suspensi bakteri uji, inokulasikan ke media NA secara merata dengan
cara spread plate dan biarkan permukaan agar mengering.
c) Secara aseptik,letakkan 1 disk antibiotik (disk yang mengandung penisilin/ampisilin)
dan 4 disk blank (yang mengandung berbagai konsentrasi senyawa uji antibiotik
sebanyak 20 µl), serta 1 disk blank kontrol negatif (disk yang mengandung pelarut)
pada permukaan media NA.

Buku Petunjuk Praktikum Mikrobiologi & Imunologi

 d) Setiap paper disk diinokulasikan dengan jarak tertentu secara teratur, agar supaya
tidak terjadi overlapping zona hambat yang terbentuk.
e) Beri label pada dasar petri secara benar
f) Inkubasikan selama 24 jam. Amati zona keruh dan jernih di setiap petri
g) Amati, gambar pertumbuhannya dan ukur diameter zona jernih yang terbentuk di
sekitar paper disk dengan jangka sorong/penggaris.

Buku Petunjuk Praktikum Mikrobiologi & Imunologi

 DAFTAR PUSTAKA

Anonim, 1992, Cara Uji Cemaran Mikroba, SNI (Standar Nasional Indonesia), SNI 01-2897-
1992, Badan Pengawasan Obat dan Makanan, Jakarta
Anonim, 1994, Keputusan Menteri Kesehatan RI No. 661/MenKes/SK/VII/1994 Tentang
Persyaratan Obat Tradisional, Jakarta
Anonim, 2000, Parameter Standar Umum Ekstrak Tanaman Obat, Cetakan Pertama,
Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Direktorat Jenderal POM, Direktorat
Pengawasan Obat Tradisional, Jakarta
Anonim, 2006, Metode Analisis PPOMN (MA Suplemen 2000 Revisi 2006), Mikrobiologi, Pusat
Pengujian Obat dan Makanan Nasional, Jakarta Atlas, R. M., 1997, Principles of
Microbiology, Wm. C. Brown Publishers. Iow

Buku Petunjuk Praktikum Mikrobiologi & Imunologi