PEDOMAN PRAKTIKUM

MIKROBIOLOGI PANGAN

DISUSUN OLEH:
SUHARMAN, S.TP., M.Sc.

UNIVERSITAS PGRI

YOGYAKARTA

2022/2023
 KATA PENGANTAR

Buku petunjuk praktikum mikrobiologi pangan ini disusun dalam rangka sebagai
salah satu acuan yang digunakan dalam praktikum mikrobiologi pangan. Praktikum
mikrobiologi pangan diselenggararakan untuk mendukung matakuliah mikrobiologi panga.
Dalam buku petunjuk praktikum ini akan dipraktekkan mengenai :

1. Pengenalan Alat dan Sterilisasi

2. Metode aseptis
3. Teknik Isolasi dan Enumerasi Mikroorganisme
4. Identifikasi morfologi mikroorganisme
5. Pengecatan gram bakteri
6. Uji E.coli Metode MPN

Dengan disusunnya buku petunjuk praktikum ini, diharapkan dapat memudahkan

para mahasiswa dalam pelaksanaan praktikum mikrobiologi pangan sehingga tujuan dari
kompetensi matakuliah dapat tercapai.

Demi kesempurnaan dan kelengkapan buku petunjuk praktikum mikrobiologi

pangan ini, kritik dan saran yang bersifat membangun akan sangat diharapkan, sehingga
penerbitanberikutnya segala kekurangan yang ada dapat diperbaiki.

Yogyakarta, 30 Januari 2022

Suharman, S.TP., M.Sc

 PERATURAN PRAKTIKUM

Peserta praktikum

Peserta yang mengikuti praktikum disebut praktikan, praktikan yang berhak dan wajib
mengikuti semua kegiatan praktikum adalah para mahasiswa yang mengikuti dan mengisi
KRS online pada matakuliah mikrobiologi pangan semester IV.

Tata tertib praktikum

1. Praktikan harus mengikuti seluruh materi praktikum sesuai dengan ketentuan yang ada
pada buku petunjuk praktikum mikrobiologi pangan
2. Ijin berhalangan hadir harus menunjukkan surat keterangan baik sakit (dari dokter)
atau tugas dari institusi (universitas/fakultas).
3. Dalam laboratorium, praktikan tidak diperbolehkan membawa makanan, minuman,
maupun merokok dalam laboratorium.
4. Setiap memasuki laboratorium diwajibkan untuk memakai jas laboratorium, sarung
tangan ataupun alat pelindung diri lainnya.
5. Bagi mahasiswa yang terlambat hadir 15 menit tidak diperkenankan masuk mengikuti
acara praktikum saat itu dan harus mengganti sendiri dilain waktu.
6. Seluruh praktikan wajib menjaga kebersihan laboratorium, dan meletakkan kembali
semua peralatan atau bahan yang digunakan selama praktikum serta membuang
sampah ataupun bahan sisa pakai yang tidak digunakan kembali ke tempat yang sudah
dipersiapkan.
7. Menjaga ketenangan dan kedisiplinan selama praktikum

Alat-alat

1. Sebelum praktikum berlangsung, seluruh praktikan harus mengecek semua alat-alat

yang akan atau selesai digunakan
2. Setelah selesai praktikum, seluruh peralatan harus dikembalikan dalam kondisi bersih
dan tertata rapi pada tempatnya.
3. Bila ada kerusakan alat akibat kelalaian mahasiswa, maka praktikan diwajibkan
mengganti berupa alat yang sama.
Penilaian Praktikum

Nilai praktikum diambil dari beberapa komponen sebagai berikut :

- 20 % post/pre test
- 10 % kehadiran dan kedisiplinan
- 40 % nilai laporan praktikum
- 30 % nilai ujian akhir praktikum / responsi

Nilai akhir praktikum merupakan rata-rata gabungan dari semua komponen.

Laporan

1. Setiap satuan acara praktikum berakhir, praktikan diwajibkan mengumpulkan

laporan sesuai dengan ketentuan yang ditetapkan dan dikumpulkan paling lambat
satu minggu setelah satuan acara tersebut berakhir.
2. Laporan tulis komputer sesuai dengan format yang telah ditentukan.
3. Bentuk penulisan laporan :
- Cover (judul materi praktikum, logo UPY, nama praktikan, nama prodi, fakultas,
tahun ajaran)
- Isi laporan meliputi :
- Bab I. Pendahuluan : latar belakang, Tujuan praktikum
- Bab II. Tinjauan pustaka : berisi pustaka menegenai topik yang akan
dipraktikumkan
- Bab III. Metode Praktikum : berisi alat dan bahan, pelaksanaan praktikum,
metode praktikum, dan diagram alir praktikum
- Bab IV. Hasil dan pembahasan : hasil praktikum dibuat tabel dan/atau grafik,
pembahasan setiap data yang ada dan dibandingkan dengan literatur terbaru.
- Bab V. Kesimpulan dan saran
- Daftar Pustaka
- Dokumentasi praktikum dan lampiran (jika ada)
 ACARA 1
PENGENALAN ALAT DAN STERILISASI

A. Latar Belakang
Kajian bidang peternakan memiliki berbagai aspek yang dapat dikaji. Salah satunya
adalah dalam bidang mikrobiologi, dimana dalam proses melakukan pekerjaannya harus
dilakukan secara aseptik. Bekerja secara aseptik adalah prinsip yang paling utama dalam
aktivitas pengamatan yang berhubungan dengan mikrobia. Kesterilan ruangan, pengguna,
alat, dan bahan-bahan mutlak dibutuhkan karena mikrobia tersebut berukuran sangat kecil,
tidak kasat mata, mudah tersebar, dapat hidup dimana saja sehingga dibutuhkan suatu
keadaan yang benar-benar steril. Hal tersebut dilakaukan guna mengurangi terjadinya
kontaminasi. Steril sendiri merupakan syarat mutlak keberhasilan kerja dalam
laboratorium mikrobiologi. Teknik-teknik tertentu diperlukan agar sterilisasi dapat
dilakukan secara sempurna, dalam arti tidak ada mikroorganisme lain yang
mengkontaminasi media.
Sterilisasi dalam mikrobiologi merupakan suatu proses untuk mematikan semua
organisme yang terdapat pada atau di dalam suatu benda. Sebagai contoh, hal-hal yang
dilakukan ketika pertama kalinya melakukan pemindahan biakan bakteri secara aseptik,
sesungguhnya hal tersebut telah menggunakan salah satu cara sterilisasi, yaitu dengan cara
pembakaran (Hadioetomo, 1985).Artinya, pada bahan atau peralatan yang akan digunakan
harus bebas dari mikroorganisme yang tidak diingikan yang dapat merusak media atau
koloni suatu mikroorganisme yang ditumbuhkan. Setelah mengetahui dan memahami
pentingnya bekerja secara aseptik, perlu diketahui pula peralatan laboratorium dan bahan
yang merupakan unsur penting yang harus ada dalam praktek mikrobiologi. Peralatan
laboratorium dan bahan yang umum digunakan antara lain :
1) Laminar air flow (LAF)
Alat yang berfungsi sebagai ruangan untuk pengerjaan secara eseptis. Prinsip peng-
aseptisan suatu ruangan berdasarkan aliran udara keluar dengankontaminasi udara
dapat diminimalkan.

Gambar 1. Laminar Air Flow (LAF)

 Gambar 2. Cara bekerja menggunakan Laminar Air Flow (LAF)

2) Mikroskop
Alat bantu yang digunakan untuk melihat benda-benda atau jasad renik
yangtidak dapat terlihat secara kasat mata.

Gambar 3. Mikroskop
3) Autoklaf
Alat yang hampir mirip dengan panci atau dandang, alat ini berfungsi untuk
sterilisasi alat dan bahan yang akan digunakan untuk pekerjaan mikrobiologi.
4) Kompor Listrik
Alat yang digunakan untuk memanaskan media atau bahan lain yang akan
digunakan dalam praktek mikrobiologi.

Gambar 5. Kompor listrik

5) Magnetic Stirer
Alat yang berfungsi menghomogenkan suatu larutan dengan pengadukan.

Gambar 6. Magnetic stirer

Gambar 7. Penggunaan magnetic stirrer dalam menghomogenkan larutan

6) Timbangan Analitik
Alat yang berfungsi untuk menimbang bahan yang akan digunakan dalam
praktikum dengan tingkat ketelitian yang tinggi.

Gambar 8. Timbangan analitik

7) Jarum Ose
Alat yang digunakan untuk menginokulasi mikroba yang akan
dipindahkan kemedium lain dan untuk mengambil media yang padat.

Gambar 9. Jarum ose

8) Cawan Petri ( Petri Dish )
Alat untuk meletakkan media tanam mikroba.

9) Vortex
Alat yang berfungsi untuk menghomogenkan suspensi sampel.

Gambar 12. Vortex

10) Rak Tabung Reaksi
Alat yang berfungsi untuk meletakkan tabung reaksi.

11) Tabung Reaksi Gambar 13.Rak tabung reaksi

 Alat ntuk meletakkan sampel atau larutan.

Gambar 14.Tabung reaksi Gambar 15.Tabung reaksi tutup ulir

12) Colony Counter

Alat yang berfungsi untuk menghitung jumlah koloni yang tumbuh
dalamcawan petri.

Gambar 16. Colony counter

13) Mikro pipet

Alat yang berfungsi untuk memindahkan cairan yang bervolume cukup kecil,
biasanya kurang dari 1000 µl.

Gambar 17. Mikro pipet

14) Pipet Tetes
Alat untuk mengambil larutan dalam ukuran yang sedikit (kurang teliti
pengukurannya dalam bentuk tetes). Ukuran pipet tets beragam , ada yang

berukuran kecil dan pendek, ada pula yang berukuran besar dan panjang.

Gambar 18. Pipet tetes

15) Pipet Seukuran
Alat yang digunakan untuk mengambil cairan dalam jumlah tertentu
secaratepat, bagian tengahnya menggelembung.

Gambar 19.Pipet seukuran

16) Pipet Berukuran atau Pipet Volume
Berupa pipa kurus dengan skala di sepanjang dindingnya. Berguna
untuk mengukur dan memindahkan larutan dengan volume tertentu

secara tepat.
17) Pipet Filler atau Rubber Bulb
Alat untuk menyedot larutan yang dapat dipasang pada pangkal pipet ukur.

Gambar 21. Pipet filler atau rubber bulb

18) Inkubator
Alat yang berfungsi untuk menumbuhkan mikroorganisme
yangingin ditumbuhkan (untuk menginkubasi).

Gambar 22. Inkubator

19) Mortar atau Pestle
Terbuat dari porselen, kaca atau batu granit yang dapat digunakan untuk
menghancurkan dan mencampurkan padatan kimia.

Gambar 23. Mortar atau pestle

20) Spatula
Berupa sendok panjang dengan ujung atasnya datar, terbuat dari
stainlesssteelatau alumunium. Fungsi dari spatula antara lain :
a. Untuk mengambil bahan kimia yang berbentuk padatan
b. Dipakai untuk mengaduk larutan

21) Batang Pengaduk

Terbuat dari kaca tahan panas, digunakan untuk mengaduk cairan di
dalamgelas kimia.

Gambar 25.Batang pengaduk

22) Batang Penyebar ( Bacterial Cell Spreader )
Alat yang digunakan untukmenyebarkanbiakanbakteriyang terdapat
padawadah pembiakan .

Gambar 26. Batang penyebar ( bacterial cell spreader)

23) Bunsen
Alat yang berfungsi untuk sterilisasi dengan pemanasan.

Gambar 28. Bunsen

24) Beaker Glass
Alat yang digunakan ntuk meletakkan dan mengukur suatu larutan.

Gambar 29. Beaker Glass

25) Gelas Ukur

Sebagai alat ukur volume cairan yang tidak memerlukan ketelitian yangtinggi.

26) Erlenmeyer
Alat yang digunakan untuk meletakkan larutan atau untuk meletakkan

bahanyang akan dicampurkan dalam bentuk cair.

Gambar 31. Erlenmeyer

27) Botol Cuci
Berupa botol tinggi bertutup yang terbuat dari plastik. Berfungsi sebagai
tempat menyimpan aquades. Cara menggunakannya dengan menekan badan
botol sampai airnya keluar.

Gambar 32. Botol cuci

28) Sentrifuge ( Centrifuge )
Berfungsi untuk mengendapkan dan memisahkan padatan dari larutan,
Efektifdalam menghilangkan partikel tersuspensi yang terlalu kecil untuk
disaring.

Gambar 33. Sentrifuse

29) Kaca Benda dan Kaca Penutup ( Object Glass dan Cover Glass)
Kaca benda berguna untuk meletakkan objek pengamatan mikroskopik. Kaca
penutup berguna untuk menutup objek pengamatan mikroskopis yang akan
diamati.
30) Indikator Kertas pH Universal
Merupakan campuran dari bermacam-macam indikator yang dapatmenunjukkan pH
suatu larutan dari perubahan warnanya.

Selain beberapa alat laboratorium di atas, diperlukan juga pengetahuan mengenai

bahan- bahan yang biasanya digunakan dalam kerja mikrobiologi , antara lain :
1) Alumunium Foildan Kapas
Untuk menutup bagian mulut alat-alat yang berupa kaca, untuk membungkus
sampel bahan. Biasanya untuk alat seperti tabung reaksi (yang berisi cairan
atau media), ditambahkan kapas terlebih dahulu sebelum dilakukan sterilisasi.

2) Karet
Untuk mengikat erat tutup gelas kaca agar tidak terkontaminasi. Bisa juga
digunakan untuk mengikat alumunium foil pada alat yang akan disterilisasi.

Gambar 37. Karet

3) Kertas Sampul Coklat
Untuk membungkus cawan petri, pipet atau alat lain yang akan disterilisasi.

Gambar 38. Kertas sampul coklat

4) Alkohol 70%
Untuk sterilisasi dan kerja aseptis.

5) Spirtus Gambar 39. Alkohol 70%

Untuk pengisi api
bunsen.

Gambar 40. Spirtus

6) Aquades
Untuk pelarut media dan alkohol.

Gambar 41. Aquades

7) Nutrient Agar (NA)
Media yang digunakan untuk media pertumbuhan bakteri.

Gambar 42. Nutrient Agar (NA)

8) Potato Dextrose Agar (PDA)

Media yang digunakan untuk media pertumbuhan jamur.

Gambar 43. Potato Dextrose Agar (PDA)

Sterilisasi
Sterilisasi merupakan suatu proses untuk mematikan semua organisme yang
teradapat pada suatu benda. Proses sterilisasi dapat dibedakan menjadi 3 macam, yaitu
penggunaan panas (pemijaran dan udara panas); penyaringan; penggunaan bahan kimia
(etilena oksida, asam perasetat, formaldehida dan glutaraldehida alkalin) (Hadioetomo,
1993). Sterilisasi merupakan hal yang penting dalm melakukan aktivitas laboratorium
terutama yang melibatkan mikrobia. Karena pada umumnya percobaan yang dilakukan
menggunakan kultur murni. Seandainya sterilisasi tidak dikerjakan maka mikroba
kantaminan akan tumbuh dan hasil yang seharusnya diperoleh dari percobaan
menggunakan kultur murni akan menimpang.
Sterilisasi yang umum dilakukan dapat berupa:
a. Sterilisasi secara fisik (pemanasan, penggunaan sinar gelombang pendek yang dapat
dilakukan selama senyawa kimia yang akan disterilkan tidak akan berubah atau terurai
akibat temperatur atau tekanan tinggi). Dengan udara panas, dipergunakan alat
“bejana/ruang panas” (oven dengan temperatur 170oC – 180oC dan waktu yang digunakan
adalah 2 jam yang umumnya untuk peralatan gelas).
b. Sterilisasi secara kimia (misalnya dengan penggunaan disinfektan, larutan alkohol,
larutan formalin).
c. Sterilisasi secara mekanik, digunakan untuk beberapa bahan yang akibat pemanasan
tinggi atau tekanan tinggi akan mengalami perubahan, misalnya adalah dengan
saringan/filter. Sistem kerja filter, seperti pada saringan lain adalah melakukan seleksi
terhadap partikel-partikel yang lewat (dalam hal ini adalah mikroba) (Suriawiria, 2005).
B. Tujuan
Tujuan dari praktikum ini adalah benar.
1) Mengenal dan mengetahui macam-macam alat dan bahan dalam pemeriksaan
mikrobiologi,
2) Mengetahui cara menggunakan alat-alat laboratorium dalam pemeriksaan
mikrobiologi,
3) Mempelajari cara menyiapkan alat dan bahan dalam pemeriksaan
mikrobiologi,
4) Mengetahui metode aseptis yang harus dilakukan saatmelakukan
pemeriksaan mikrobiologi, dan
5) agar praktikan mampu mempraktekkan sterilisasi alat maupun media sesuai
dengan metode yang
C. Alat dan Bahan
1) Mikroskop + object &cover glass 14) Pipet seukuran
2) Autoklaf 15) Pipet beukuran / pipet volume
3) Kompor listrik 16) Pipet filler / rubber bulb
4) Magnetic stirrer 17) Inkubator
5) Timbangan analitik 18) Mortar / pestle
6) Jarum ose 19) Spatula& batang pengaduk
7) Cawan petri 20) Indikator kertas pH
8) Vortex 21) Batang penyebar
9) Rak tabung reaksi 22) Bunsen
10) Tabung reaksi 23) Beaker glass
11) Colony counter 24) Gelas ukur
12) Mikro pipet 25) Erlenmeyer
13) Pipet tetes 26) Botol cuci

Bahan
1) Aluminium foil 4) Aquades
2) Karet dan kertas sampul coklat 5) MRSA
3) Alkohol 70% , spirtus 6) Potato Dextrose Agar (PDA)

D. Prosedur Kerja
Bekerja dengan Teknik Aseptis
a. Rapihkan meja dari alat-alat dan bahan yang masih ada di atasnya,
b. Lakukan penyemprotan sekitar meja kerja dengan alkohol 70% beberapa
kali sampai merata,
c. Semprotkan meja dan tangan dengan alkohol 70% (semprotkan ke tangan
dan usapkan ke seluruh permukaan tangan),
d. Gunakan sarung tangan (gloves) (jika tangan sudah kering dari alkohol),
e. Letakkan alat dan bahan yang diperlukan di atas meja yang sudah
disterilkan,
f. Semprotkan semua permukaan alat dengan alkohol 70%,
g. Letakkan pembakar bunsen, nyalakan dan tunggu beberapa saat,
h. Apabila tidak menggunakan gloves, sebelum memulai melakukan
pekerjaan, semprotkan kembali alkohol 70% ke tangan dan usapkan ke
seluruh permukaan tangan, dan
i. Mulailah melakukan pekerjaan.

Rapihkan meja kerja dari alat-alat

Lakukan penyemprotan sekitar

yang ada di meja kerja dengan alkohol 70%
atasnya.

Semprot
Semprot tangan Letakkan alat dan bahan
meja dengan yang diperlukan di atas meja
alkohol

5 6

Semprotkan semua 7
permukaan alat
dengan alkohol 70%,
 Letakkan pembakar
Bunsen ,nyalakan , dan
diamkan beberapa saat.

Apabila tidak menggunakan

gloves,sebelum memulai
melakukan
Persiapan alat dan bahan sterilisasi :
1. Buatlah penutup dari kapas (cotton plug) dan tutupkan pada tabung reaksi (penutup
kapas yang baik adalah yang keras, padat, panjangnya cutup dan tidak mudah
menyebar).
2. Buatlah penutup kapas untuk Erlenmeyer karena penutup kapas ini besar sebaiknya
dibungkus dengan kain kasa. Tutupkan penutup kapas ini pada Erlenmeyer (tutup
kapas harus keras dan padat).
3. Bungkuslah cawan Petri dengan kertas yang telah disediakan.
4. Masukkan kapas pada pangkal pipet (tempat untuk mengisap) dan selanjutnya
bungkuslah pipet dengan kertas.
5. Sterilkan alat-alat gelas tersebut di atas dengan oven atau autoklaf Sterilisasi dengan
autoklaf

Prosedur sterilisasi
Sterilisasi autoklaf
1. lsi autoklaf dengan air sampai dekat angsang (dasar yang berlubang- lubang tempat
me1etakkan bahan yang disterilkan).
2. Bahan-bahan yang akan disterilkan dimasukkan. Media yang disterilkan dalam Erlenmeyer
atau tabung reaksi harus ditutup rapat dengan kapas dan aluminium foil.
3. Tutup autoklaf dan kencangkan ulir penutupnya.
4. Buka kran pengeluaran uap air.
5. Stel waktu yang diinginkan untuk sterilisasi (15 menit).
6. Tekan tombol untuk menghidupkan.
7. Jika uap air sudah mulai keluar, tutuplah kran pengeluaran uap air.
8. Tekanan uap dalam autoklaf akan naik sampai 2 atm, dan suhunya akan mencapai 121°C.
9. Jika waktu sterilisasi sudah dicapai, tekanan dalam autoklaf akan turun perlahan, dan tunggu
sampai tekanan menunjukkan angka nol, atau ditunggu sampai agak dingin.
10. Buka autoklaf hati-hati dan keluarkan bahan yang telah disterilkan tersebut. Simpan dan
pisahkan tempatnya dengan bahan-bahan yang belum disterilkan.

Sterilisasi dengan oven

Alat-alat yang terbuat dari kaca, misalnya Erlenmeyer, tabung reaksi, pipet, cawan petri sebelum
dipakai perlu disterilkan dengan oven.
1. Tutuplah erat-erat erlenmeyer dan tabung reaksi dengan kapas. Pipet dikelompokkan menurut
volumenya, dan masukkan dalam wadah yang tersedia atau dibungkus dengan kertas payung
atau aluminium aluminium foil. Demikian pula untuk cawan Petri.
2. Masukkan ke dalam oven
3. Tutup oven dengan benar
4. Atur tombol pengatur suhu sesuai dengan suhu yang diinginkan (170-180oC) selama 2 jam
5. Setelah sterilisasi, tunggu sampai suhu dalam oven mendekati suhu ruang, kemudian
bukalah oven hati-hati.
6. Keluarkan alat-alat yang sudah steril dan pisahkan tempatnya dengan alat-alat lain
yang belum steril.
 ACARA II.

METODE ASEPTIS

A. Metode Aseptis

Teknik aseptis sangat penting dalam pengerjaan mikrobiologi yang memerlukan ketelitian
dan keakuratan disamping kesterilan yang harus selalu dijaga agar terbebas dari kontaminan yang
dapat mencemari. Populasi mikroba di alam sekitar kita sangat besar dan komplek. Beratus-ratus
spesies berbagai mikroba biasanya menghuni bermacam-macam bagian tubuh kita, termasuk mulut,
saluran pencernaan, dan kulit. Sekali bersin terdapat beribu-ribu mikroorganisme sehingga
diperlukan teknik yang dapat meminimalisirnya seperti pengisolasian (Pelczar & Chan, 1986).
Salah satu teknik dasar dalam analisa mikrobiologi adalah teknik transfer aseptis (suatu
metode atau teknik di dalam memindahkan atau mentransfer kultur bakteria dari satu tempat ke
tempat lain secara aseptis agar tidak terjadi kontaminasi oleh mikroba lain ke dalam kultur). Teknik
ini sangat esensial dan kunci keberhasilan prosedur mikrobial yang harus diketahui oleh seorang yang
hendak melakukan analisis mikrobiologi. Pengambilan sampel harus dilakukan secara statistik agar
tidak bias, jadi secara acak (random sampling). Selain itu, digunakan teknik aseptis selama
pengambilan sampel agar tidak terjadi pencemaran. Alat-alat yang digunakan harus steril. Bahan
makanan cair diambil dengan pipet steril, makanan padat menggunakan pisau, garpu, sendok atau
penjepit yang steril (Afrianti, 2004).
Metode aseptis
Beberapa hal yang perlu diperhatikan dalam metode aseptis adalah :
1. Jangan digunakan ose yang belum steril untuk menyentuh kultur. Ini untuk mencegah
terjadinya kontaminasi yang dibawa oleh ose.
2. Mulut tabung harus dipanasi baik pada saat ose dimasukkan atau saat dikeluarkan dari
tabung. Pemanasan pertama ditujukan untuk mencegah masuknya udara luar yang membawa
partikel debu masuk ke dalam tabung, sedang pemanasan kedua ditujukan untuk membakar
sel-sel yang jatuh atau menempel pada mulut tabung saat ose dimasukkan atau ditarik.
3. Tabung terbuka harus dalam waktu yang sesingkat-singkatnya.
4. Jangan menempatkan tutup pada permukaan area pekerjaan atau menyentuhnya. Tutup dijaga
agar tidak bersinggungan dengan tempat-tempat sebagai sumber kontaminan.
5. Ose yang telah digunakan harus disterilkan untuk mencegah kontaminasi meja bekerja
dengan kultur yang sedang digunakan.
B. Tujuan
Praktikum ini bertujuan untuk mengembangkan keterampilan memindahkan kultur secara
aseptis.
C. Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan ialah Ose bermata dan ose jarum.
Bahan-bahan yang digunakan ialah Kultur bakteri, media MRSA, PCA , PDA dan Spirtus.
D. Prosedur Kerja
Memindahkan kultur dari tabung ke tabung
1. Siapkan tabung reaksi dan ose yang akan digunakan
2. Pegang ose seperti saat memegang pensil
3. Pijarkan ose diatas api spirtus sampai merah membara
4. Biarkan ose dingin sebelum menyentuh kultur yang akan dipindah
5. Buka tutup kapas pada tabung reaksi tempat kultur yang akan dipindah dengan jari kelingking
6. Bakar mulut tabung dengan api spirtus, kemudian masukan ose dan ambil satu ose kultur yang
tumbuh ditabung
7. Bakar mulut tabung sekali lagi dan tutup dengan kapas, selanjutnya diletakan kembali pad
arak
8. Ambil tabung yang baru, buka tutupnya dan bakar mulutnya diatas api, masukan ose tempat
kultur menempel dan goreskan pada media baru
9. Bakar kembali mulut tabung, tutup dengan kapas dan letakan kembali
10. Panaskan ose setelah selesai dipakai atau sebelum diletakan kembali
11. Inkubasi tabung reaksi yang sudah diinokulasikan
Memindahkan kultur dari tabung ke cawan petri
1. Pijarkan ose diatas api spirtus sampai merah membara
2. Biarkan ose dingin sebelum menyentuh kultur yang akan dipindah
3. Bakar mulut tabung dengan api spirtus, kemudian masukan ose dan ambil satu ose kultur yang
tumbuh ditabung
4. Bakar mulut tabung sekali lagi dan tutup dengan kapas, selanjutnya diletakan kembali pada
rak
5. Buka cawan petri tempat kultur yang akan dipindah dengan tangan kiri
6. Goreskan ose pada media agar dan tutup kembali cawan petri
7. Inkubasi cawan petri pada inkubator
Memindahkan kultur cair dari tabung ke Erlenmeyer
1. Pegang tabung reaksi tempat kultur cair dengan tangan kanan dan buka tutup kapasnya
dengan menjepitnya pada jari kelingking tangan kiri secara aseptis.
2. Pegang Erlenmeyer dengan tangan kiri dan buka tutp kapasnya dengan menjepitnya pada jari
kelingking tangan kanan secara aseptis
3. Pindahkan kultur cair dari labu ke Erlenmeyer
4. Sebelum tutup kapas dimasukan panasilah terlebih dahulu mulut Erlenmeyer
5. Inkubasikan Erlenmeyer pada inkubator
 ACARA III

IDENTIFIKASI MORFOLOGI MIKROORGANISME

A. Morfologi mikroorganisme

Morfologi adalah ilmu yang mempelajari bentuk:, ukuran dan susunan sel. Biasanya
bentuk dan ukuran mikrobia ditentukan secara genetik, dan kebanyakan bakteri mempunyai
dinding sel yang sangat kaku (rigid). Perubahan lingkungan mungkin dapat sedikit
mempengaruhi bentuk: dan ukuran sel, seperti sel bentuk: batang menjadi lebih pendek atau
lebih panjang, namun hampir tidak pernah terjadi perubahan dari bentuk: bulat menjadi bentuk:
batang atau sebaliknya. Oleh karenanya, bentuk dan ukuran mikrobia merupakan karakteristik
yang penting yang dapat digunakan untuk: identifikasi.

Sebagian besar bakteri berbentuk silinder atau bulat. Bakteri silinder dapat berbentuk:
lurus atau lengkung. Bentuk silinder lurus ini disebut rod (batang), yang bervariasi dari
panjang tipis sampai pendek tebal. Bentuk: silinder lengkung juga bervariasi dari pendek
dan sedikit lengkung menyerupai koma sampai spiral panjang. Disamping itu bakteri bentuk:
batang juga bervariasi dalam tingkat keeratannya satu sarna lain setelah pembelahan sel. Hal ini
menen- tukan apakah selnya berupa sel tunggal, berpasangan atau merupakan rantai
panjang. Bakteri bentuk bulat sering juga disebut cocci. Sel-selnya dapat tampak berpasangan
(diplococci), rantai panjang (streptococci), berbentuk: kubus (sarcinae) atau tidak beraturan
menyerupai buah anggur (staphylococcl). Susunan sel ini tidak sestabil bentuk sel karena
susunan sel tersebut dapat berubah selarna penanganan dan preparasi sampel untuk pengamatan
mikroskopis.

Diantara tumbuh-tumbuhan rendah, maka golongan ganggang (alga) dan golongan jamur
merupakan kelanjutan daripada golongan bakteri. Baik jamur yang bersahaja maupun jamur yang
tingkat tinggi, tubuhnya mempunyai ciri yang khas, yaitu berupa benang tunggal bercabang-cabang
yang disebut misselium atau berupa kumpulan benag-benang yang padat menjadi satu. Hanya
golongan ragi (saccharomycetes) itu tubuhnya berupa sel-sel tunggal. Ciri kedua ialah, jamur tidak
mempunyai klorofil, sehingga hidupnya terpaksa heterotrof.

Golongan jamur mencakup lebih daripada 55.000 species. Jumlah ini jauh melebihi jumlah
species bakteri. Tentang klasifikasinya belum ada kesatuan pendapat yang menyeluruh diantara para
sarjana taksonomi. Bakteri dan jamur merupakan golongan tumbuh-tumbuhan yang tubuhnya tidak
mempunyai diferensiasi, oleh karena itu disebut tumbuhan talus (thallophyta), lengkapnya
thallophyta yang tidak berklorofil.

B. Tujuan

Mengamati bentuk dan morfologi bakteri, jamur dan yeast.

C. Alat dan Bahan

Mikroskop
Bakteri (Lactobacillus, Streptococcus)
Jamur (Rhizopus)
Yeast (Saccharomices)

D. Prosedur kerja

1. Siapkan mikroskop dan kaca preparat

2. Sampel di letakkan diatas kaca preparat dan ditetesi minyak imersi kemudian ditutup dengan kaca
penutup.
3. Pengamatan dilakukan dibawah mikroskop.

E. PENGAMATAN

Gambar penampakan morfologis yang terlihat. Identifikasi struktur sel.

 ACARA I V

ISOLASI DAN ENUMERASI MIKROORGANISME

A. Teknik Isolasi dan Enumerasi

Berbagai jenis mikroba terdapat dalam makanan, tanah, air, udara, sampah, limbah dan
sebagainya. Untuk mempelajari sifat pertumbuhan, morfologi dan sifat fisiologinya, masing-masing
mikroba tersebut harus dipisahkan satu dengan yang lainnya, sehingga terbentuk suatu kultur murni
yaitu suatu biakan yang terdiri dari sel-sel dari satu spesies atau satu galur mikrobia. Salah satu faktor
yang perlu diperhatikan dalam kultivasi mikroorganisme adalah faktor kebutuhan nutrien, disamping
faktor-faktor lain yang diperlukan untuk kehidupannya. Hal-hal yang perlu diperhatikan dalam isolasi
dan kultivasi yaitu sebagai berikut :
1. Semua peralatan dan sarana dalam keadaan steril (bebas mikroorganisme hidup) atau bebas
kontaminan (mikrooganisme yang tidak dikehendaki).
2. Dilakukan secara aseptik (tidak memberi kesempatan untuk terjadinya kontaminasi)
Media untuk isolasi dan enumerasi mikroba dapat berbentuk cair (broth) maupun padat
(agar). Kultur cair sangat bermanfaat untuk menumbuhkan mikroba dalam jumlah besar di
lingkungan homogen. Media padat sangat bermanfaat untuk isolasi kultur murni, perhitungan
mikroba, dan seleksi galur yang diinginkan. Setelah semua bahan dan alat yang akan digunakan
dalam proses kultivasi disterilkan, maka dimulailah proses isolasi untuk mendapatkan biakan murni.
Bahan yang diinokulasikan pada medium disebut inokulum. Beberapa teknik inokulasi yang
dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi antara lain Spread Plate, Streak Plate dan Pour Plate
Technique.
Bahan pangan yang diperkirakan mengandung lebih dari 300 sel mikroba per ml, per gram,
atau per cm2 (jika dilakukan pengamatan pada permukaan luar bahan pangan), memerlukan perlakuan
pengenceran sebelum ditumbuhkan pada medium agar di dalam cawan petri, sehingga setelah
inkubasi akan terbentuk koloni pada cawan tersebut dalam jumlah yang dapat dihitung, dimana
jumlah yang terbaik adalah diantara 30-300 koloni. Pengenceran biasanya dilakukan secara desimal
yaitu 1:10, 1:100, 1:1000, dst atau 1:100, 1:10000, 1:1.000.000, dan seterusnya seperti pada gambar
1. Pengambilan contoh dilakukan secara aseptik dan pada tiap pengenceran dilakukan pengocokan
atau setrifugasi hingga merata. Pengenceran secara desimal memudahkan dalam perhitungan “total
count”. Untuk mengetahui jumlah mikroba pada permukaan luar bahan pangan, misalnya daging
sapi, daging ayam, ikan dan lainnya, pengambilan sampel dapat dilakukan dengan menggunakan
metode swab.
 Larutan yang digunakan dalam pengenceran dapat berupa larutan garam fisiologis 0,85% atau
larutan buffer fosfat, atau larutan ringer. Untuk bahan pangan yang sukar larut, kedalam larutan
pengencer pertama dapat ditambahkan pasir putih atau butir-butir gelas (glass bead) yang disterilisasi
bersamaan dengan larutan pengencer tersebut.

Gambar 1. Teknik pengenceran

Tujuan dari pengenceran yaitu memperkecil atau mengurangi jumlah mikroba yang terdapat
pada suspensi atau larutan sampel. Penentuan besarnya atau banyaknya tingkat pengenceran
bergantung pada perkiraan jumlah mikroba yang terdapat pada sampel. Digunakan perbandingan 1 :
9 untuk sampel dan pengenceran pertama dan selanjutnya, sehingga pengenceran berikutnya
mengandung 1/10 sel mikroorganisme dari pengenceran sebelumnya.

Cara Pemupukan (Platting)

Prinsip dari metode pemupukan /platting adalah jika sel mikroba yang masih hidup
ditumbuhkan pada media agar, maka sel mikroba tersebut akan berkembang biak dan membentuk
koloni yang dapat dilihat langsung dengan mata tanpa menggunakan mikroskop. Metode pemupukan
merupakan cara yang paling sensitif menentukan jumlah mikroba karena :
1. Hanya sel yang masih hidup yang dapat dihitung
2. Beberapa jenis mikroba dapat dihitung sekaligus
3. Dapat digunakan untuk isolasi dan identifikasi mikroba karena koloni yang terbentuk
mungkin berasal dari satu sel mikroba dengan penampakan pertumbuhan yang spesifik
 Selain keuntungan-keuntungan tersebut, metode pemupukan juga mempunyai kelemahan-
kelemahan yaitu :
1. Hasil perhitungan tidak menunjukkan jumlah sel mikroba yang sebenarnya karena beberapa
sel yang terdekat mungkin membentuk satu koloni.
2. Medium dan kondisi yang berbeda akan menghasilkan hasil yang kurang optimal.
3. Mikroba yang ditumbuhkan harus dapat tumbuh pada medium padat dan membentuk koloni
yang jelas dan kompak serta tidak menyebar.
4. Membutuhkan persiapan dan waktu inkubasi yang lama sehingga pertumbuhan koloni dapat
dihitung.
Metode pamupukan mikroba pada media padat dapat dibedakan menjadi tiga metode, yaitu
metode tuang (pour plate), metode permukaan (spread plate), dan metode gores kuadran (streak plate)
yang masing-masing memiliki keunggulan dan kelemahan setiap metodenya.
1. Metode tuang (Pour Plate)
Dari pengenceran yang dikehendaki, sebanyak 1 ml atau 0,1 ml larutan dipipet kedalam cawan
petri menggunakan pipet volume atau mikropipet 1 ml. Sebaiknya waktu antara dimulainya
pengenceran sampai menuangkan kedalam cawan petri tidak boleh lebih dari 30 menit.
Kemudian kedalam cawan tersebut dimasukkan media agar cair yang telah didinginkan sampai
suhu 45-470C sebanyak 12-15 ml tiap cawan petri. Selama penuangan medium tutup cawan
tidak boleh dibuka terlalu lebar untuk menghindari kontaminasi dengan lingkungan sekitar.
Segera setelah penuangan, cawan petri digerakkan diatas meja secara hati-hati untuk
menyebarkan sel-sel mikroba secara merata, yaitu dengan gerakan melingkar atau gerakan
seperti angka delapan. Setelah agar memadat, cawan-cawan tersebut diinkubasi dengan cara
membalikkan posisi cawan.
2. Metode Permukaan (Surface/Spread plate)
Pada pemupukan dengan metode permukaan, agar steril terlebih dahulu dituangkan ke dalam
cawan petri dan dibiarkan membeku. Setelah media membeku atau memadat sempurna,
kemudian sebanyak 0,1 ml larutan sampel yang telah diencerkan di pipet pada permukaan agar
tersebut. Sebuah batang gelas melengkung (hockey stick) dicelupkan kedalam alkohol 95% dan
dipijarkan sehingga alkohol tersebut habis terbakar. Setelah dingin batang gelas tersebut
digunakan untuk meratakan sampel diatas medium agar dengan cara memutarkan cawan petri
diatas meja. Selanjutnya inkubasi dan perhitungan koloni dilakukan seperti pada metode
penuangan.
3. Metode goresaan (Streak plate)
 Metode pemupukan dengan cara goresan (streak plate) adalah suatu metode dalam
menumbuhkan mikroba di dalam media agar cawan dengan cara menggoreskan ujung jarum
ose yang telah diinokulasikan dengan kultur mikroba. Dengan teknik ini mikroba yang tumbuh
akan tampak dalam goresan-goresan inokulum bekas dari streak jarum ose. Cara ini dilakukan
dengan membagi cawan petri menjadi 3-4 bagian. Ose steril yang telah disiapkan dilekatkan
pada sumber isolat, kemudian menggoreskan ose tersebut pada cawan berisi media steril. Ada
beberapa teknik dalam metode goresan, yaitu :
- Goresan sinambung
Pada goresan sinambung, ujung jarum ose yang telah diinokulasi kultur digoreskan pada
permukaan secara kontinyu sampai setengah permukaan agar. Metode goresan ini digunakan
untuk peremajaan mikroba ke medium baru.

- Goresan “T”
Pada metode goresan T, media pada cawan petri dibagi menjadi 3 daerah, ujung jarum ose
digoreskan pada daerah 1 secara zig-zag. Kemudian panaskan jarum ose dan tunggu dingin
dan lanjutkan goresan pada daerah 2, kemudian cawan diputar untuk memperoleh goresan
yang sempurna. Lakukan hal yang sama pada daerah 3.
- Goresan kuadran
Metode ini hampir sama dengan goresan T, namun berpola goresan yang berbeda yaitu dibagi
menjadi empat. Daerah 1 merupakan daerah awal sehingga masih mengandung banyak sel
mikroba. Goresan kedua dipotongkan atau disilangkan dari goresan pertama sehingga
jumlahnya lebih sedikit, dan begitu seterusnya hingga daerah 4 yang akhirnya terpisah-pisah
menjadi koloni tunggal.
Gambar . Streak plate method dengan
goresan sinambung

Gambar . Streak plate method dengan

goresan T

Gambar . Streak plate method dengan

goresan banyak sektor
 Gambar . Contoh hasil isolasi
dengan
Streak plate method

B. Tujuan
Praktikum ini bertujuan untuk mengetahui teknik isolasi dan enumerasi
mikroorganisme pada sampel bahan pangan
C. Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan ialah kawat ose, tabung reaksi, pipet, bola hisap,
pembakar bunsen, mikro pipet, botol semprot alkohol, cawan petri, autoklaf.
Bahan-bahan yang digunakan ialah sampel makanan, aquades, alcohol 70%,
NaCl 0,85%, media MRSA dan PCA.
D. Prosedur Kerja

1. Persiapkan sampel bahan makanan yang akan diuji dengan

menimbang sebanyak 1 gram sampel.
2. Masukkan sampel yang sudah ditimbang tersebut ke dalam tabung
reaksi yang sudah diisi dengan 9 ml larutan NaCl 0,85% secara
aseptis.
3. Sampel yang sudah dilarutkan divortex hingga tercampur merata
4. Ambil larutan sampel sebanyak 1 ml dan masukkan kembali ke
dalam tabung reaksi berikutnya secara aseptis.
5. Prosedur diatas diulangi sampai pada tingkat pengenceran yang
diinginkan.
6. Setelah dilakukan pengenceran sampai tingkat yang diinginkan,
diambil 3 tabung rekasi pada pengenceran terakhir untuk dilakukan
plattig dengan 3 metode yaitu pour, streak, dan spread plate (seperti
pada penjelasan diatas).
7. Sebanyak 0,1 ml larutan sampel pada tiga pengenceran terakhir
untuk dilakukan platting pada media dalam cawan petri dengan
menggunakan metode spread dan pour plate.
8. Sedangkan pada metode streak plate, ujung kawat ose yag telah
dilewatkan pada bara api didinginkan sejenak dan segera dicelupkan
pada larutan sampel, kemudian digoreskan menurut teknik streak
plate pada masing-masing kuadran.
9. Inkubasi cawan petri dengan posisi terbalik pada suhu 30-32oC
selama 24 jam dan amati pertumbuhannya.
 ACARA V.

PENGECATAN GRAM

A. Pengecetan Gram

Pewarnaan gram atau metode gram adalah suatu metode empiris untuk
membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yaitu gram positif dan
gram negative, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel bakteri. Metode
tersebut diberi nama berdasarkan penemunya ilmuwan Denmark, Hans Christian
Gram (1853-1938) yang mengembangkan teknik tersebut pada tahun 1884 untuk
membedakan antara Pneumococcus dan bakteri Klebsiella pneumonia (Karmana
2008).
Bakteri garam positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna metil
ungu atau Kristal ungu sewaktu proses pewarnaan gram. Bakteri jenis tersebut akan
berwarna biru atau ungu di bawah mikroskop, sedangkan bakteri gram negative
akan berwarna merah muda atau merah. Perbedaan klasifikasi antara kedua jenis
bakteri tersebut terutama didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri
(Karmana 2008).
Bakteri gram negatif adalah bakteri yang tidak mampu mempertahankan zat
warna metil ungu atau kristal ungu pada metode pewarnaan gram. Bakteri gram
positif akan mempertahankan warna ungu gelap setelah dicuci dengan alcohol,
sementara bakteri gram negatif tidak. Pada uji pewarnaan gram, suatu pewarna
penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu atau Kristal ungu, yang
membuat semua bakteri gram negative menjadi berwarna merah atau merah muda.
Pengujian tersebut berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri tersebut
berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka (Karmana 2008).
Metode pewarnaan spora berfungsi untuk mempermudah pengamatan agar
peneliti atau pengamat mampu melihat spora, membedakan dengan sel vegetatif
ataupun mengamati bentuknya. Endospora tidak mudah diwarnai dengan zat
pewarna pada umumnya. Hal tersebut yang menjadi dasar dari metode pengecatan
endospora dengan larutan hijau malasit. Metode Shaeffor, foton endospora diwarnai
pertama dengan larutan hijau malasit. Pengecatan tersebut sifatnya kuat karena
dapat berpenetrasi ke dalam endospora dengan perlakuan larutan hijau malasit.
Teknik tersebut akan menghasilkan warna hijau pada endospora dan merah pada
sel vegetatif (James 2002).

B. Tujuan
Praktikum ini bertujuan untuk mengklasifikasikan antara bakteri gram
positif dan negatif berdasarkan pewarnaan gram serta mengamati morfologinya di
bawah mikroskop.
C. Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan ialah kawat ose, tabung eppendorf, spirtus, kaca preparat,
kaca penutup dan mikroskop.
Bahan-bahan yang digunakan ialah kultur bakteri L.bulgaricus, dan E.coli, aquades,
alcohol 70%, kristal violet atau kristal ungu, kalium iodida (KI), alkohol 96%,
safranin, dan minyak imersi.
D. Prosedur
1. Pewarnaan Gram
a) Bersihkan gelas benda dan gelas penutup dengan alkohol sampai bebas
lemak dan debu. Beri label pada ujung gelas benda dengan nama atau inisial
bakteri yang akan dicat. Di bawah gelas benda digambarkan bulatan
berdiameter 1 cm dengan spidol. Gunakan daerah ini sebagai daerah untuk
pengecatan mikrobia. Balikkan gelas benda sehingga gambar bulatan ada di
baliknya.
b) Letakkan 1 tetes aquades pada permukaan gelas benda di dalam daerah yang
sudah digambar. Ambil sedikit biakan bakteri dengan ose bermata secara
aseptis dan campur dengan aquades yang ada pada gelas benda. Ratakan
suspensi ini pada seluruh bulatan area. Lakukan hal yang sama untuk bakteri
yang lain. Bila bakteri berasal dari kultur cairan, pindahkan beberapa ose ke
dalam gelas benda tanpa dicampur dengan aquades. Ratakan selnya pada
seluruh permukaan bulatan.
c) Kering anginkan (dengan kipas angin) hingga membentuk noda.
d) Lakukan fiksasi dengan cara ,melewatkan gelas benda pada nyala api
beberapa kali. Jangan biarkan gelas benda langsung kena nyala api sehingga
menjadi terlalu panas. Untuk mengetes suhu fiksasi, tempelkan gelas benda
 pada pergelangan tangan selama 1-2 detik. Fiksasi yang baik adalah apabilaterasa
hangat, bukan terasa panas.
e) Bubuhkan cat utama violet kristal 2-3 tetes, diamkan selama 1 menit.
f) Cuci dengan air mengalir, kemudian kering anginkan (dengan kipas angin).
g) Tetesi dengan beberapa tetes larutan iodin, biarkan selama 1 menit.
h) Cuci sisa iodin dengan air mengalir dan kering anginkan.
i) Miringkan gelas benda, cuci dengan larutan etanol dengan cara meneteskan etanol pada
permukaan noda bakteri sampai etanol bekas cucian tidak berwarna, selama 30 detik.
j) Cuci dengan air mengalir secara singkat, kemudian kering anginkan.
k) Bubuhkan beberapa tetes cat penutup safranin dan diamkan selama 2 menit.
l) Cuci secara cepat dengan air mengalir dan kering anginkan. Tutup permukaan dengan
gelas penutup.
m) Amati preparat dengan mikroskop perbesaran kuat (dengan minyak imersi). Sel akan
berwarna merah muda/pink (Gram negatif) atau biru ungu (Gram positif). Catat hasil
pengecatan Gram (+ atau -), ukuran relatif bakteri dan ciri-ciri yang lain (dalam bentuk
berikatan, berkelompok dsb) untuk setiap preparat. Gambar beberapa sel yang mewakili
dan tuliskan perbesaran yangbaik.
 ACARA VI

UJI E.COLI METODE MPN

A. METODE MPN

Kualitas air yang dapat menunjang kehidupan manusia ditentukan oleh kualitas lingkungan.
Keberadaan mikroorganisme dalam lingkungan perairan menyebabkan air tersebut tidak layak
digunakan sebagai air konsumsi maupun untuk kebutuhan sehari-hari. Menurut World Health
Organization (WHO) dan American Public Health Association (APHA) kualitas air ditentukan
oleh kehadiran dan jumlah bakteri didalamnya. Terdapat beberapa jenis bakteri terutama bakteri
Escherichia coli dan Coliform. Keberadaan Escherichia coli dan Coliform dapat di uji dengan
metode Most Probable Number (MPN). Tabel tersebut dapat digunakan untuk memperkirakan jumlah
bakteri Coliform di dalam 100 ml sampel air yang positif terhadap uji penduga (presumptive
test), uji penegas (confirmative test) dan uji pelengkap (complete test).
Berdasarkan Keputusan Menteri Lingkungan Hidup Nomor 51 tahun 2004 Tentang Baku
Mutu Air Laut, persyaratan air bersih dapat di tinjau dari parameter fisika, kimia, parameter
biologi dan parameter radioaktivitas yang terdapat di dalam air. Persyaratan mikrobiologis untuk air
bersih yaitu tidak mengandung bakteri patogen dan para Sitik yang mengganggu kesehatan. Standar
baku untuk Escherichia coli 200 MPN per 100mL, Sedangkan standar baku mutu air laut untuk
biota laut berdasarkan parameter mikrobiologi untuk bakteri patogen 0 MPN per100ml. Untuk
menguji kualitas air yang digunakan, dapat ditentukan berdasarkan perhitungan indeks Most Probable
Number (MPN). MPN adalah metode untuk mendeteksi dan menghitung jumlah bakteri coliform
dan colifecal. Dengan demikian dapat diperoleh indeks berdasarkan tabel MPN untuk menyatakan
perkiraan jumlah coliform pada sampel. Ciri-ciri dari bakteri coliform ini adalah merupakan gram
negatif, tidak memiliki spora, mampu memfermentasi laktosa menjadi gas dan asam pada suhu 35-
37p (Novel et al., 2010).
Coliform adalah kelompok bakteri yang digunakan sebagai indikator untuk menentukan
kualitas atau mutu dari lingkungan air, tanah, atau bahan makanan. Kelompok dari bakteri
coliform ini adalah Escherichia coli, Enterobacter aerogenes, Klebsiella dan Citrobacter fruendii.
Cara penyebarannya melalui makanan maupun air yang terkontaminasi secaralangsung (melalui
tangan) dan tidak langsung (melalui air) oleh tinja selama pengolahan (Pratiwi, 2017). Colifecal
merupakan kelompok bakteri yang spesifik terhadap tinja yaitu bakteri Escherichia coli. E. coli adalah
bakteri yang ditemukan di dalam usus besar manusia sebagai flora normal. Air yang terkontaminasi
oleh bakteri E coli apabila diminum dapat menyebabkan penyakit diare. Dalam metode MPN
untuk air minum ada dua tahap pemeriksaan yaitu :
a. Tes Pendahuluan (Presumtive Test) Pemeriksaan pada tes pendahuluan dengan
menginokulasi pada media Lactose Broth dilihat ada tidaknya pembentukan gas dalam tabung durham
setelah di inkubasi selama 24 – 48 jam pada suhu 35oC – 37oC. Bila terdapat pembentukan gas tabung
durham maka tes air minum menurut KepMenKes RI No.: 907/MenKes/SK/VII/2002. bila setelah 48
jam tidak terbentuk gas, hasil dinyatakan negatif dan tidak perlu melakukan penegasan.
b. Tes Penegasan (Confirmatif Tes) Pemeriksaan pada tes penegasan dengan penanaman pada
media Brillian Green Lactosa Bile Broth, dilihat ada tidaknya pembentukan gas dalam tabung durham
setelah diinkubasi selama 48 jam. Bila terbentuk gas dalam tabung durham maka tes dinyatakan
positif.
B. Tujuan

Metode MPN digunakan sebagai uji kualitas air berdasarkan keberadaan dan jumlah ambang
mikroorganisme pathogen yang terdapat didalamnya
C. Alat dan Bahan

1. Alat
Alat-alat laboratorium mikrobiologi, seperti lemari pengeram (inkubator), autoklav, rak
dan tabung reaksi, beker glass, pipet hisap, pipet ukur, pinset, cawan petri, lidi kapas
steril, lampu spiritus, ose, serta peralatan lain yang digunakan di laboratorium
mikrobiologi
2. Bahan
Lactose Broth Single Strength (LBSS), Lactose Broth Triple Strength (LBTS), Brilliant Green
Lactose Bile Broth (BGLB), Eosin Metilen Blue (EMB), Media gula-gula (Glukosa, Laktosa,
Manitol, Maltosa, Sukrosa), Agar Sulfur Indole Motility (SIM), Agar Simmons Citrate (SC).

C. Prosedur Kerja

 Sampel minuman diambil masing-masing 100 ml. Setelah sampel siap, lakukan uji pertama
Most Probable Number (MPN) presumptive test.
 Apabila presumptive test positif, lakukan uji berikutnya yaitu MPN confirm test. Apabila
presumptive test negatif, pengujian sampel selesai.
 Bila confirm test positif lanjutkan pada uji MPN complete test, apabila menunjukkan hasil
yang positif, terakhir dilakukan uji biokimia atau uji gula-gula.
 Bila semua pengujian sudah menunjukkan hasil, dilakukan pengumpulan hasil dan
melakukan interpretasi hitung angka MPN dengan rumus penghitungan MPN.

PENGAMATAN
 DAFTAR PUSTAKA

Madigan et al., 1995. Biology of microorganisms, Prentice Hall, Inc.,

NewJersey.
Schlegel, H.G., 1986. General microbiology, Cambridge University
Press, Cambridge.
Stanier, R.Y., E.A. Adelberg, JL.Ingraham, 1980. The Microbial Word,
PrenticeHall, Inc., New Jersey.
Metting, F.B. (1993). Soil Microbial Ecology.Applications in
Agriculture and Environment Management.Marcel Dekker. Inc.
NY
Ali, A., 2005. Mikrobiologi Dasar Jilid I. State University of Makassar
Press.
Makassar.
Fardiaz, S., 1992. Mikrobiologi Pangan 1. PT Gramedia Pustaka Utama.
Jakarta.
Pelczar, M.J dan E.C.S. Chan., 1986. Dasar-dasar Mikrobiologi I.
Diterjemahkan oleh Hadioetomo, dkk. Universitas Indonesia Press.
Jakarta.
Waluyo, L., 2004. Mikrobiologi pangan. UMM Press. Malang.