PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI
(Ilmu Kedokteran Dasar)
KATA PENGANTAR
Puji dan syukur penyusun panjatkan kehadirat Allah SWT, berkat rahmat
dan BimbinganNya penyusun dapat menyelesaikan buku petunjuk praktikum
Bakteriologi dapat terselesaikan.
Bersama ini perkenalkanlah penyusun mengucapkan terimakasih yang
sebesar-besarnya kepada:
1. Dra. Ec. Lianawati, MBA. selaku Ketua Yayasan Pendidikan Bhakti
Wiyata Kediri.
2. Prof. dr. Muhamad Zainuddin., Apt selaku Rektor Institut Ilmu Kesehatan
Bhakti Wiyata Kediri
3. Binti Mu’arofah., S.Pd., S.ST., M.Si Selaku Kepala Laboratorium
Bakteriologi Media dan Tim Laboratorium Bakteriologi Media
4. Serta semua pihak yang belum penyusun sebutkan satu persatu yang telah
membantu dalam penyusunan buku petunjuk praktikum Bakteriologi.
Semoga Allah SWT membalas budi baik semua pihak yang telah
memberikan kesempatan, dukungan dan bantuan dalam menyelesaikan buku
petunjuk praktikum Bakteriologi.
DAFTAR ISI
Bahan Kimia
Bahan-bahan kimia di laboratorium harus dianggap beracun dan berbahaya.
jangan makan dan minum di laboratorium ! Cucilah tangan anda setiap
akan meninggalkan laboratorium! dan bila perlu segera minum susu setelah
melaksanakan praktikum.
Selalu buka pintu dan jendela serta nyalakan lemari asam dan blower ketika
bekerja di laboratorium. Kerjakan reaksi-reaksi yang melibatkan senyawa
yang mudah menguap dan mudah terbakar di dalam lemari asam !
Jika anda menyimpan zat-zat yang mudah menguap di meja anda, tutuplah
selalu wadah yang digunakan untuk menyimpan zat tersebut !
Jika anda menumpahkan zat kimia di meja anda, segera bersihkan dengan
lap kering atau tissu. Buanglah tissu pada tempatnya, jangan buang sampah
di dalam wasbak !
Jika anda terkena zat kimia, segeralah cuci dengan sabun dan bilaslah
dengan air mengalir yang banyak. kecuali apabila anda terkena tumpahan
atau cipratan brom, fenol atau asam-asam pekat, hindari membilas dengan
air !!
Jika terkena H2SO4 pekat, laplah bagian tubuh anda yang terkena asam
sulfat pekat dengan tissue kering atau lap kering. Kemudian setelah
beberapa saat, cucilah bagian tubuh anda dengan air sabun dan air mengalir
yang banyak.
Zat-zat kimia berikut sangat iritan, kecuali jika dalam konsentrasi encer :
asam sulfat (H2SO4), asam nitrat (HNO3), asam klorida (HCl), asam asetat
(CH3COOH), larutan kalium hidroksida (KOH) dan natrium hidroksida
(NaOH). Berhati-hatilah!
Dimetilsulfoksida, walaupun tidak iritan, tapi cepat sekali terserap oleh
kulit. Berhati-hatilah !
Selain pengetahuan mengenai penggunaan alat dan teknis pelaksanaan di
laboratorium, pengetahuan resiko bahaya dan pengetahuan sifat bahan yang
digunakan dalam percobaan.Sifat bahan secara rinci dan lengkap dapat dibaca
pada Material Safety Data Sheet (MSDS) yang dapat didownload dari internet.
Berikut ini sifat bahan berdasarkan kode gambar yang ada pada kemasan bahan
kimia:
Corrosive(korosif)
Bahan ini dapat merusak
Huruf kode:
jaringan hidup, menyebabkan
C
iritasi kulit, dan gatal.
Explosive (bersifat
mudah meledak)
Bahan ini mudah meledak
Huruf kode: dengan adanya panas, percikan
E bunga api, guncangan atau
gesekan.
Oxidizing
(pengoksidasi) Bahan ini dapat menyebabkan
kebakaran. Bahan ini
Huruf kode:
menghasilkan panas jika kontak
O
dengan bahan organik dan
reduktor.
flammable (sangat
mudah terbakar)
Bahan ini memiliki titik nyala
Huruf kode: rendah dan bahan yang bereaksi
F dengan air untuk menghasilkan
gas yang mudah terbakar.
Harmful (berbahaya)
Huruf kode: Bahan ini menyebabkan luka
Xn bakar pada kulit, berlendir dan
mengganggu pernapasan.
3. Staining Jar
- Untuk pewarnaan kuman dengan
system celup
- Bak pengecatan
4. Devicator/Evicator - Untuk
mengikubasi/mengeramkan
kuman secara anaerob oksigen
MACAM-MACAM REAGENT
1. PZ
Phisiologi Zuur yang isinya NaCl 0,85%
Digunakan : - untuk pembuatan suspense kuman
2. Oil Imersi
Digunakan : - untuk pengamatan mikroskop menggunakan lensa
Objektif
3. Xylol / Xylene
Digunakan : - untuk membersihkan lensa objektif 100 kali pada
mikroskop
Caranya : - kapas putih (biasa) Xylol dan dioleskan ke lensa
obyektif pada mikroskop
MIKROSKOP MONOKULER
Mikroskop adalah suatu alat yang digunakan untuk melihat benda-benda kecil
(jasad renik) yang tidak tampak oleh mata telanjang.
1) System Optik
Terdiri dari : a. Okulator
b. Obyektif
c. Kondensor
d. cermin
2) System Mekanik
Terdiri dari : a. Tabung / Tabus
b. Makrometer
c. Mikrometer
d. Revolver Nois Picce
e. Meja Objek / Stage
f. Penjepit
g. Sekrup penggerak
h. Kerangka body
i. Food / kaki
j. Diafragma
SISTEM OPTIK
a. Okulair / Eyepiece
Gunanya : untuk memperbesar bayangan semu terakhir
sehingfa dapat dilihat oleh mata.
Ada dua macam :
1. Monokulair / satu okulair
2. Binokulair / dua okulair
Ukuran yang tertera 5x, 10x, 15x
b. Objektif / Noisepiece
Gunanya : untuk memperbesar bayangan benda
Mempunyai perbesaran
1. 5x, 10x, 20x yang dikenal dengan low dry
2. 40x, 50x yang dikenal dengan high dry
3. 97x, 100x yang menggunakan Oil Immersi
Tingkat numeris
Adalah salah satu factor penting untuk mengefisiensikan
penggunaan lensa obyektif dengan kondensor.
c. Kondensor
Kondensor adalah lensa cembung yang bersifat menfokuskan sinar
dan mempertegas pencahayaan benda.
Terdiri dari :
1. Lensa datar
2. Lensa cembung
d. Cermin
Gunanya : untuk mengumpulkan / menangkap sumber cahaya
Terdiri dari :
1. Cermin Datar
Digunakan apabila menggunakan sinar dari alam / lansung
Contoh : sinar matahari
2. Cermin Cekung
Digunakan apabila menggunakan sibar buatan / tak langsung
Ada 2 sinar buatan :
a. sinar dari dalam
contoh : lampu dari dalam mikroskop
b. sinar dari luar
contoh : lampu TI / Ruangan
SISTEM MEKANIK
a. Tabung atau Tubus
Tempat lensa okulair
b. Makrometer
Menaik turunkan tubus secara tepat agar bayangan dapat terfokus
c. Mikrometer
Menaik turunkan tubus secara sangat lambat agar bayangan dapat terfokus
d. Revolver Nolse Piece
Lensa okulair
e. Meja Objek / Stage
Tempat sediaan yang akan diperiksa
f. Penjepit
Untuk menjepit sediaan yang akan diperiksa
g. Sekrup penggerak
Penggerak sediaan yang akan diperiksa
h. Kerangka / body
Untuk menyangga mikroskop
i. Foot / kaki
Dasar mikroskop
j. Diafragma
Mengatur intensitas cahaya yang masuk
GAMBAR MIKROSKOP
b. Objek Glass
c. Cover Glass
d. Lampu
- Bahan / objek : preparat bakteri
- Prosedur
Menggunakan cara basah :
a. Mikroskop harus dalam posisi tegak
b. Mencari sumber cahaya dengan cermin pada mikroskop
Caranya :
- Objek 100x ditempatkan diatas lubang stage
- Kondensor dinaikkan penuh / diafragma dibuka penuh
- Tetesi preparat dengan oil immersion
- Putar-putarlah cermin sampai dapat lapang pandang yang
terang.
c. Setelah dapat lapang pandang yang terang, letakkan sediaan pada
meja sediaan dan jepit dengan penjepit sediaan.
d. Objek diturunkan sampai hampir menyentuh sediaan
e. Mencari bayangan benda, naikkan objek dengan menggunakan
makrometer dengan perlahan
f. setelah bayangan benda terfokus, putarlah makrometer sampai
bayangan benda jelas terlihat.
MIKROSKOP BINOKULER
2. Binokuler jika memiliki lensa dua. Dan menurut jenisnya terdapat dua yaitu
mikroskop cahaya dan mikroskop electron.
Bagian Bagian Mikroskop
Bagian mikroskop dibagi menjadi dua bagian yaitu bagian optik dan mekanik.
A. Bagian Optik
1. Lensa Okuler
Lensa okuler berfungsi memperbesar bayangan memperbesar bayangan
dengan perbesaran 6 kali, 10 kali, atau 12 kali.
2. Lensa Objektif
Terdapat tiga lensa objektid dengan perbesaran 10 kali, 40 kali, 100 kali
atau juga ada yang 1000 kali pada jenis mikroskop terbaru. Saat
menggunakan lensa objektif, 100 kali untuk memperjelas gambaran benda
perlu diberi minyak pelumas oil imersi karena benda atau objek sampai
menempel atau bersentuhan dengan lensa.
3. Kondensor
Kondensor merupakan bagian yang bisa diputar naik turun berfungsi untuk
memusatkan objek atau benda serta memperjelas cahaya yang dipantulkan
oleh cermin.
4. Diafragma
Benda atau objek mikro biasanya diletakkan pada preparat atau lempengan
kaya yang di jepitkan pada tatakan bawah lensa. Diafragma berfungsi
mengatur seberapa banyak cahaya yang digunakan untuk melihat objek pada
preparat.
5. Cermin
Cermin berada pada posisi bawah berbentuk bulat dan berfungsi menerima
dan memantulkan cahaya ke arah preparat agar objek yang sedang diamati
bisa terlihat jelas. Cermin bisa diarahkan ke segala arah untuk mendapatkan
pencahayaan yang cukup terang.
B. Bagian Mekanik
1. Revolver
Revolver merupakan bagian yang digunakan untuk mengatur seberapa
banyak perbesaran lensa yang diinginkan. Revolver bisa diatur dengan
memutarnya sesuai dengan perbesaran yang tertera atau tertulis.
2. Tabung Mikroskop
Tabung mikroskop ini yang berbentuk panjang karena merupakan
penghubung antara lensa objektif dan lensa okuler pada mikroskop.
3. Lengan Mikroskop
Lengan mikroskop merupakan tempat pegangan untuk pengamat. Untuk
memberi kenyamanan bagi pengamat saat menggunakan mikroskop.
4. Meja Benda
Meja benda merupakan tatakan tempat objek atau preparat diletakkan. Pada
meja tersebut terdapat penjepit di kanan dan kiri meja benda yang berfungsi
untuk menjaga agar preparat tidak bergeser.
5. Makrometer
Makrometer merupakan bagian untuk menaikkan atau menurunkan tabung
mikroskop secara cepat dengan tujuan memperjelas gambaran pada objek.
6. Mikrometer
Mikrometer merupakan bagian untuk memperjelas gambaran pada objek.
7. Kaki Mikroskop
Kaki mikroskop merupakan bagian dasar yang menopang mikroskop secara
keseluruhan, dan juga penyangga saat mikroskop akan dipindahkan.
8. Sendi Inklinasi
Pengatur sudut atau tegaknya mikroskop sesuai dengan kenyamanan
pengamat. Sendi inklinasi ini bisa ditegakkan atau dibungkukkan tergantung
kenyamanan pengamat dan disesuaikan dengan arah lensa okulernya.
3. Diafragma digeser dari posisi MIN ke posisi MAX atau mendekati MAX agar
diperoleh pencahayaan yang terang pada obyek yang sedang diamati.
4. Preparat di pasang pada meja benda.
5. Objek pada mikroskop pertama kali dicari pada perbesaran lemah (4 x 10)
dengan cara memutar makrometer mikroskop.
6. Obyek dapat diperbesar atau diperjelas dengan menambah ukuran lensa okuler.
Penambahan ukuran lensa okuler dilakukan dengan menggeser revolver.
7. Perubahan lensa okuler menyebabkan obyek yang telah tampak pada perbesaran
lemah akan menjadi kabur. Obyek yang menjadi kabur dapat diperjelas dengan
menggeser mikrometer. makrometer mikroskop sebaiknya tidak digunakan
ketika memperjelas obyek. Penggunaan makrometer pada perbesaran kuat dapat
menyebabkan pecahnya kaca benda atau preparat yang sedang diamati.
lingkungan sekitar mikroskop tidak lembab. Selain itu dapat pula diletakkan
dalam lemari yang diberi lampu untuk mencegah tumbuhnya jamur.
2. Bagian mikroskop non optik, terbuat dari logam atau plastik, dapat dibersihkan
dengan menggunakan kain fanel. Untuk membersihkan debu yang terselip di
bagian mikroskop tersebut dapat digunakan kuas kecil atau kuas lensa kamera.
3. Lensa-lensa mikroskop (okuler, objektif, dan kondensor) dibersihkan dengan
menggunakan tisue lensa. Jangan membersihkan lensa menggunakan sapu
tangan atau lap kain.
4. Sisa minyak imersi pada lensa objektif dapat dibersihkan dengan xilol (xylene).
Pada penggunaan xilol haruslah hati-hati, jangan sampai cairan xilol menempel
pada bagian mikroskop non optik, karena akan merusak cat atau merusak
bahan plastik, dan juga jangan menggunakan larutan ini kebagian lensa yang
lain.
5. Sebelum menyimpan mikroskop,bersihkan selalu mikroskop tersebut, terutama
hapus semua minyak imersi di permukaan lensa, sehingga partikel yang halus
tidak menempel dan menggumpal serta mengering. Minyak dan partikel halus
pada lensa dapat mengaburkannya dan menyebabkan goresan.
6. Sebelum menyimpan mikroskop, meja mikroskop diatur lagi dan lensa objektif
dijauhkan dari meja preparat dengan memutar alat penggeraknya ke posisi
semula, kondensor diturunkan kembali, lampu dikecilkan intensitasnya lalu
dimatikan.
PEWARNAAN
Macam-macam pewarnaan
1. Regresif staining : pewarnaan mengunakan lebih dari satu macam cat
( Gram, ZN, KG )
2. Progresif staining : pewarnaan yang mengunakan 1 macam cat saja
(Lugol, Fucshin, Methylen Blue)
3. Negatif staining : pewarnaan yang diwarnai latar belakangnya ( Kapsul )
4. Metha cromatik staining ( Pewarnaan granula)
PEWARNAAN SEDERHANA
TUJUAN :
* untuk melihat morfologi kuman
* untuk melihat susunan kuman
ALAT : Objek glass, ose bulat/jaru, lampu spiritus, Mikroskop
BAHAN : Pz, Oil imersi, kuman
Prosedur Kerja
A. Pembuatan Sediaan
1. Siapkan semua alat dan bahan.
2. Sterilkan objek glass dengan difiksasi diatas api dan tetesi dengan pz
(kuman dari media padat plate).
3. Panaskan ose bulat dengan api diatas lampu spiritus sampai merah
membara dan dinginkan.
4. Ambil kuman dalam tabung/plate yang telah diflaming dengan ose bulat,
kemudian oleskan pada objek glass searah dengan jarum jam dan
keringkan.
5. Sediaan difiksasi (dipanasi diatas api) dan diwarnai.
Coccus
Cat Malacite Methylen Fucshin Gentian
Green Blue Violet
Bentuk Coccus Coccus Coccus Coccus
Susunan Bergerombol Bergerombol Bergerombol Bergerombol
Warna Hijau Biru merah unggu
PEWARNAAN GRAM
TUJUAN :
untuk membedakan kuman Gram positif dan kuman Gram
negatif
untuk melihat susunan dan morfologi kuman
untuk melihat sifat kuman terhadap pewarnaan
untuk membantu klasifikasi kuman
PRINSIP :
* Kuman Gram positif
Dituangi Gram 1 (gentian violet) berwarna unggu, kemudian
digenangi gram 2 (lugol) agar cat semakin kuat dan bila
dilunturkan dengan Gram 3 ( alkohol 70%) tidak luntur bila
digenangi fucshin tidak terserap sehinga kuman tetap berwarna
unggu.
* Kuman Gram Negatif
Dituangi Gram 1 (gentian violet) berwarna unggu, kemudian
digenangi gram 2 (lugol) dilunturkan dengan Gram 3 ( alkohol
70%) luntur, digenangi fucshin terserap sehinga kuman merah.
ALAT :
* Objek glass
* ose bulat/jarum
* lampu spiritus
* Mikroskop
BAHAN :
* Pz
* Oil imersi
* kuman
* Gram 1 : Gentian Violet
* Gram II : Lugol
* Gram III : Alkohol 70%
* Gram IV : Fucshin
Prosedur Kerja
1. Sedian difiksasi
2. Digenangi Gram 1 selama 3-5 menit, cat dibuang di cuci dengan air mengalir
kecil.
3. Digenangi Gram II selama 1 menit, cat dibuang.
4. Digenangi Gram III selama 10 detik, alkohol dibuang dicuci dengan air
mengalir kecil.
5. Digenangi Gram IV selama 3-5 menit, cat dibuang dicuci dengan air mengalir
kecil.
6. Dikeringkan dan diperiksa memakai mikroskop perbesaran 100X
HASIL
Sifat pewarnaan Gram Positif Gram Negatif
BENTUK KUMAN
1. Batang Gram Negatif
* Echerichia coli
* Klebsiella
* Salmonella
* Shigella
* Proteus
* Pseudomonas
* Vibrio cholera
2. Batang Gram positif
* M. tuberculosa
* M.lepra
* C. difteri
3. Coccus Gram Positif
* Staphylococcu * Diplococcus
* Sarkina * Tetracoccus
Satu ose penuh strain ditanam dalam broth/inkubasi 27º C 2-3 jam.
Kekeruhan broth dibandingkan dengan standar Mc farlan.
2. Dengan swab steril kultur dalam broth ditanam merata pada agar MH.
Sebelumnya swab diperas dahulu pada dinding tabung (dengan menekan
sambil diputar). Lalu diswabkan meliputi seluruh permukaan plate secara
merata.
3. Metode Cakram :
4. Metode Sumuran :
Control kualitas :
Selalu digunakan control kuman yang murni.
Media perlu diuji sterilitas dan spesifisitasnya.
Disk antibiotiknya tidak kadaluarsa.
Cara pelaporan : Ada 3 kategori:
1. Resisten (R)
2. Intermediate (I)
3. Sensitif (S)
MEDIA :
A. SENSITIFITAS ANTIBIOTIK
MH Agar
12 plate 100 ml 6 plate
Aquadest 100 / 6 × 12 = 200 ml
34 gram / 1000 ml × 200 ml = 6,8 gram
B. MEDIA PELARUT
1. Letheen Broth
a. Erlenmeyer 90 ml
b. Tabung reaksi @ 9 ml 18 ml
108 ml
37,8 gram / 1000 ml × 108 = 4,1 gram
Twen 80 5/1000 ml × 108 = 0,5 ml
Aquadest 108 – 0,5 = 107,5 ml
2. PZ (Pisiologi Zuur)
Auadest 100 ml
NaCl 5 gram / 1000 = 0,9 gram
3. PDF
a. Erlenmeyer 90 ml
b. Tabung reaksi @ 9 ml 18 ml
Aquadest 108 ml
Pepton 25,5gram/1000ml×108 ml = 2,8 gram
4. Buffer phosphate
Stock KH2PO4 17 gram
Aquadest 250 ml dan di adkan sampai 1000 ml
C. PEWARNAAN
1. CAT INDUK
Basic Fuchsin
5 gram basic fuchsin + 95 ml alcohol 96%
Methylen Blue
5 gram methylen blue + 95 ml alcohol 96%
Kristal Violet
5 gram kristal violet + 95 ml alcohol 96%
Gentian Violet
5 gram gentian violet + 95 ml alcohol 96%
Safranin
5 gram safranin + 95 ml alcohol 96%
Malachit Green
5 gram malacit green + 95 ml alcohol 96%
2. PEWARNAAN SEDERHANA
Fuchsin
10 ml cat induk fuchsin + 90 ml aquadest
Methylen Blue
10 ml cat induk methylen blue + 90 ml aquadest
Kristal Violet
10 ml cat induk kristal violet + 90 ml aquadest
Malachite Green
10 ml cat induk malachite green + 90 ml aquadest
3. PEWARNAAN GRAM
Gram I (Gentian Violet)
5 gram gentian violet + 95 ml alcohol 95%
Pengencer 10 ml cat induk gentian violet + 90 ml aquadest
Gram III
Alcohol 96% 73 ml
PEMBUATAN MEDIA
2. Media cair
Misalnya
Pembuatan -masing media dimasukkan beaker
glass ditambah aquadest sesuai kebutuhan dan
dipanaskan sampai larut, sesuaikan pHnya sesuai yang
diminta, tuang pada tabung sesuai ukuran masing-
masing, tutup dengan kapas berlemak, steril diautoclav,
setelah dingin disimpan di lemari es
DAFTAR PUSTAKA
Joklik, Willett, Amos, Wilfert, “Zinsser Mikrobiologi, 19th” Ed. Prentice. Hall
International Inc. 1988, him 487
Senzel, A.J (ED). Hewburger’s Manual of Cosmetic Analiysis, 2nd Ed, the
association of official Analytical Chemists, Inc Washington DC, 1977, hlm
132 – 140
41