MODUL PRAKTIKUM BIOKIMIA

Tim Penyusun:
Dr. Dian Herasari, M.Si.
Dra. Aspita Laila, M.S.
Dr. Nurhasanah, M.Si.
Prof. Dr. Yandri AS, M.S
Mulyono, Ph.D.
Dr. Eng. Heri Satria, M.Si.

Jurusan Kimia
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Universitas Lampung
2022
 PETUNJUK KESELAMATAN KERJA

Dengan kehati-hatian dan pengatuan akan teknik kerja yang benar, laboratorium
bukanlah tempat yang berbahaya. Petunjuk keselamatan kerja berikut ini adalah hal yang
masuk akal belaka.

1. Kenakan jas lab dan sepatu tertutup untuk keselamatan Anda sewaktu bekerja di
laboratorium
2. Andi tidak dibenarkan makan, minum, dan merokok saat di laboratorium
3. Anggaplah semua bahan kimia berbahaya, jangan mencicipi apapun kecuali
diminta Asisten
4. Jika bahan kimia mengenai anggota badan Anda, maka cucilah segera dengan air
sebanyak-banyak dan laporkan kejadian ini kepada Asisten
5. Jangan langsung membaui uap atau gas, tapi tepiskan sedikit sampel gas ke hidung
Anda
6. Setiap reaksi yang melibatkan bahan kimia berbahaya atau berbau tidak enak,
maka kerja harus dilakukan di dalam lemari asam
7. Hindarkan dari nyala api pelarut yang mudah terbakar seperti alcohol, aseton, dan
khususnya eter
8. Jangan kerjakan percobaan yang tidak diwajibkan

Harapn kami Anda bisa memperhatikan petunjuk keselamtan kerja di atas.

TIM PENYUSUN
 KATA PENGANTAR

Syukur kehadirat Allah SWT dengan selesainya Modul Praktikum Biokimia ini, harapan
kami buku ini bisa dijadikan pedoman dan petunjuk untuk melakukan kerja di
laboratorium. Karena ilmu yang bersifat eksperimental, maka percobaan adalah salah
satu langkah penting dalam pengembangan ilmu yang berkaitan dengan kimia. Buku
petunjuk praktikum ini akan memudahkan kerja mahasiswa dan asisten untuk memahami
tujuan kerja pada setiap percobaan, membuat tugas praktik sebelum bekerja di
laboratorium, memperlihatkan bagan kerja kepada asisten setiap kali akan melakukan
praktikum dan mencatat langsung hasil pengamatan pada lembar laporan. Laporan harus
dikumpulkan setelah praktikum selesai sesuai instruksi dan perjanjian dengan asisten.

Buku petunjuk praktikum ini adalah wujud dari upaya para dosen di Jurusan Kimia FMIPA
Unila. Dengan rendah hati kami mengharapkan saran perbaikan dari pengguna buku agar
buku petunjuk praktikum ini dapat kami sempurnakan pada terbitan yang akan datang.
Kami sangat berterima kasih kepada semua pihak yang telah membantu dalam
penyusunan buku petunjuk praktikum ini.

TIM PENYUSUN
 PENGARAHAN BAGI PRAKTIKAN

Dalam rangkaian percobaan yang Anda hadapi, Anda akan dapat menghayati apa yang
telah dilakukan oleh ilmuwan terdahulu pada zamannya. Mereka dahulu amat
bersemangat melakukan pengamatan sehingga kita sekarang bisa memetik teori, dalil
atau aturan yang dirumuskan acapkali dari percobaan-percobaan yang amat sederhana.
Anda akan terlibat dalam pekerjaan yang kami rancang untuk merangsang kemampuan
Anda dalam mengamati dan menarik kesimpulan yang masuk akal.

Seorang kimiawan yang bekerja di laboratorium harus ada perencanaan. Oleh karena itu,
agar dapat memperoleh pengalaman belajar yang sebesar-besarnya, maka Anda harus
mengetahui percobaan yang akan dilakukan sebelum datang ke laboratorium. Dan ada
beberapa langkah-langkah yang akan membantu Anda mempersiapkan praktikum yang
berhasil, yaitu:

1. Bacalah bagian tujuan dan formulasikan sifat umum percobaan tersebut

2. Buatlah garis besar dari prosedur agar Anda dapat mengantisipasi alur kerja
sewaktu percobaan
3. Kerjakan tugas prapraktik
4. Selama percobaan, catat pengamatan langsung pada lembar laporan, serta
perhatikan hal-hal berikut:
a. Selalu menampakkan informasi dalam Petunjuk Keselamatan Kerja
b. Bekerja sendiri atau berkelompok sesuai arahan dari asisten
c. Cucilah alat gelas segera setelah digunakan, menunda pekerjaan ini akan
mempersulit pembersihan alat gelas
d. Jangan tempatkan bahan kimia langsung pada piring neraca. Gunakan
secarik kertas minyak atau wadah dari kaca. Segera bersihkan bahan kimia
yang tercecer.
e. Rapikan kembali meja kerja Anda setelah percobaan hari itu selesai
5. Periksalah kembali lembar laporan Anda, apakah semua pengamatan sudah
dilaporkan, perhitungan sudah benar, rumus senyawa, dan muatan ion sudah
sesuai atau persamaan reaksi sudah seimbang
6. Jawablah semua pertanyaan dalam bagian pertanyaan. Latihan ini dimaksudkan
agar Anda lebih mendalami materi.

Jika Anda melaksanakan peraturan, kami yakin Anda akan memperoleh manfaat besar
dari pengalaman kerja di laboratorium. Disamping itu prinsip-prinsip yang diberikan oleh
dosen selama perkuliahan akan terasa relevan.

TIM PENYUSUN
 DAFTAR ISI

PETUNJUK KESELAMATAN KERJA

KATA PENGANTAR
PENGARAHAN BAGI PRAKTIKUM

1. Instrumen Biokimia, Buffer dan Pembuatan Media

2. Uji Kualitatif Protein
3. Uji Kualitatif Karbohidrat dan Lipid
4. Skrining dan Pembiakan Bakteri
5. Isolasi Enzim dari Bakteri Bacillus subtilis ITBCCB148 dan Jamur Aspergillus niger
6. Produksi Enzim -Amilase dari Bacillus subtilis ITBCCB148 dan Enzim Selulase dari
Aspergillus niger
7. Pemurnian Enzim -Amilase Dari Bacillus subtilis ITBCCB148 dan Enzim Selulase dari
Aspergillus niger dengan Ammonium Sulfat
8. Dialisis Enzim -Amilase Dari Bacillus subtilis ITBCCB148 dan Enzim Selulase Dari
Aspergillus niger
9. Kromatografi Kolom Enzim -Amilase dari Bacillus subtilis ITBCCB148 dan Enzim
Selulase dari Aspergillus niger dengan CM-Selulase
10. Penentuan Kadar Glukosa Darah
11. Penentuan Kolesterol Dalam Serum
12. Penentuan Protein Dalam Urin
13. Fermentasi dan Sintesis PLA
 1. Instrumen Biokimia, Buffer, dan Pembuatan Media

Instrumen Biokimia

Biokimia adalah cabang ilmu kimia yang mempelajari proses kimia yang terjadi dalam sel
hidup. Penelitian bidang biokimia, selain menggunakan peralatan dan instrumentasi yang
umum digunakan dalam penelitian ilmu kimia, juga menggunakan beberapa instrumentasi
khusus bidang biokimia.

Beberapa instrumentasi dalam bidang biokimia yang sering digunakan antara lain adalah:

A. Alat Sterilisasi
Bahan atau peralatan yang digunakan dalam teknik penelitian biokimia, harus dalam
keadaan steril. Sterilisasi yaitu usaha untuk membebaskan bahan-bahan dan alat-alat
dari segala mikroba. Cara sterilisasi yang dipakai tergantung pada macamnya bahan
dan sifat bahan yang disterilkan. Hal ini tergantung pada ketahanan alat / bahan
terhadap panas, bentuk bahan yang disterilkan: padat, cair atau gas.

Ada tiga cara utama yang umum dipakai dalam sterilisasi yaitu:
1. Secara fisik dengan sinar ultraviolet, sinar x, dll.
2. Secara mekanik dengan penyaringan.
3. Secara kimia dengan desinfektan, larutan filtrat formalin, dll.

1. Sterilisasi Alat Secara Fisik

a. Sterilisasi dengan pemijaran
Cara ini digunakan untuk mensterilisasi jarum ose yang terbuat dari platina atau
nikrom. Hal ini dapat dilakukan dengan membakar alat tersebut sampai pijar
atau merah membara.
b. Sterilisasi dengan udara kering
Sterilisasi dengan oven atau hot air sterilizer merupakan sterilisasi yang
menggunakan udara kering. Alat sterilisasi ini digunakan untuk mensteriliskan
alat–alat gelas seperti tabung reaksi, cawan petri, erlenmeyer dan alat–alat
gelas lainnya, serta bahan–bahan seperti kapas, kain kasa dan kertas. Pada
umumnya temperatur untuk sterilisasi yaitu 170°-180°C selama 2 jam, batas
waktu dimulai sejak suhu mencapai 170°C dan perlu diperhatikan bahwa
lamanya sterilisasi bergantung pada jumlah alat yang disterilkan dan ketahanan
alat tersebut terhadap panas.
c. Sterilisasi dengan uap panas bertekanan (autoclaving)
Alat yang digunakan untuk sterilisasi ini adalah autoklaf. Alat ini terdiri dari
bejana tekanan tinggi yang dilengkapi dengan manometer, termometer, dan
klep bahaya. Sterilisasi dengan autoklaf merupakan sterilisasi yang paling baik
6dibandingkan dengan sterilisasi lainnya. Alat-alat yang disterilkan adalah yang
 tidak rusak karena pemanasan dan tekanan tinggi. Untuk sterilisasi media
diperlukan temperatur 121°C, tekanan 2 atm (15 Psi) selama 15-20 menit
setelah kondisi tercapai. Sedangkan untuk sterilisasi alat-alat gelas diperlukan
temperatur 121°C, tekanan 2 atm (15 Psi) selama 15 menit setelah kondisi
tercapai. Jadi tekanan yang bekerja ke seluruh permukaan benda adalah 15
pon tiap inchi 2 (15 Psi = 15 pounds per square inch).
d. Sterilisasi dengan uap air panas (pasteurisasi)
Beberapa bahan-bahan berupa cairan (media kultur atau media pertumbuhan)
tidak dapat disterilkan dengan beberapa metode di atas. Sebagai alternatif
dapat dilakukan sterilisasi menggunakan uap panas (pasteurisasi) dengan
menggunakan steam sterilizer pada suhu 100ᵒC selama 30 menit.

2. Sterilisasi Alat Secara Mekanik

Untuk bahan yang mengalami perubahan atau penguraian ketika disterilisasi
dengan tekanan tinggi, dapat dilakukan secara mekanik dengan filter bakteri:
1. Berkefeld filter
2. Chamberland filter
3. Seitz filter

3. Sterilisasi Secara Kimia

Sterilisasi dengan zat kimia digunakan untuk membunuh mikroba disekitar tempat
kerja, jarum ose dan untuk membersihkan tangan sebelum dan sesudah kerja.

B. Laminar air flow

Kerja aseptis dilakukan dalam Laminar Air Flow (LAF). Instrumen ini digunkan saat
diperlukan kondisi kerja yang aseptik yaitu kondisi dimana diri, alat, bahan dan
lingkunggan yang bebas dari mikroorganisme. Cara menggunakan LAF adalah bagian
dalam LAF dibersihkan dengan tissue, kemudian disemprotkan dengan alkohol.
Kemudian tekan tombol menu, lalu tombol UV. UV dinyalakan selama 10 menit, lalu
dimatikan kembali dengan cara menekan tombol UV. Selanjutnya tekan tombol
blower dan dinyalakan selama 10 menit. Setelah tombol blower dimatikan dengan
cara menekan tombol blower kembali, LAF siap untuk dipergunakan. Untuk
mencegah terjadinya kontaminasi terhadap media atau mikroorganisme kita dapat
menggunakan lampu spirtus di dalam LAF. Selain itu, sebaiknya sebelum bekerja
menyemprotkan alkohol pada tangan terlebih dahulu untuk mencegah terjadinya
kontaminasi.

C. Inkubator
Alat yang digunakan untuk tempat pertumbuhan dan penyimpanan mikroorganisme.

D. Sentrifuga
Alat yang digunakan untuk memisahkan pellet dan supernatan dengan kecepatan
5000 rpm selama 15-20 menit yang berdasarkan gaya gravitasi bumi.

E. Waterbath
Instrumentasi yang digunakan pada proses pertumbuhan atau inkubasi
mikroorganisme media cair dan reaksi enzimatik.
F. Mikropipet
Pipet yang digunakan untuk mengambil enzim atau larutan lain dalam jumah mikro
dari 1 mL sampai 0,01 mL.

Selain instrumentasi yang khusus, pembuatan reagen dan beberapa pereaksi dalam
bidang ilmu kimia juga mempunyai kekhasan tersendiri. Kecuali untuk keperluan
standarisasi, reagen dan pereaksi bidang biokimia dibuat dengan labu ukur yang tidak
perlu dilakukan secara kimia sekali. Misalnya, untuk membuat media pertumbuhan
mikroorganisme yang terdiri dari bahan-bahan berikut: glukosa 10%, NaCl 1%, MgSO4
0,01% dan pepton 2,5% yang dilarutkan dalam 100mL akuades.

Buffer

Salah satu faktor yang mempengaruhi reaksi dalam sel biologis, utamanya aktivitas enzim,
adalah pH (derajat keasaman). Reaksi enzim akan mencapai aktivitas optimal pada saat
pH optimalnya. Perubahan pH saat reaksi enzim, apalagi bila terjadi perubahan pH yang
ekstrim dapat menyebabkan perubahan struktur protein enzim yang mengakibatkan
menurunnya atau hilangnya aktivitas enzim. Hal inilah yang mendasari perlunya larutan
buffer dalam suatu reaksi enzimatis, untuk menjaga stabilitas konsentrasi ion hidrogen
selama reaksi terjadi.

Buffer didefinisikan sebagai larutan penyangga yang dapat mempertahankan stabilitas pH

larutannya. Buffer terdiri dari larutan asam dan basa konjugatnya, misalnya karbonat dan
bikarbonat atau asetat dan asam asetat. Kualitas buffer tergantung pada kapasitas
buffernya dan kemampuan untuk menjaga stabilitas pH pada penambahan garam netral.

Pada penelitian biokimia, ada beberapa jenis buffer yang sering digunakan, bergantung
pada range pH yang dibutuhkan pada reaksi enzimatis. Secara umum larutan buffer ini
termasuk dalam kelompok larutan buffer asam, larutan buffer basa dan larutan buffer
netral.

TUGAS PENDAHULUAN
1. Tuliskan persamaan Henderson-Hasselbach untuk menghitung pH suatu larutan
buffer!
2. Sebutkan beberapa jenis buffer yang sering digunakan dalam penelitian biokimia,
yang termasuk dalam kelompok buffer asam dan buffer basa (3 contoh)!

PROSEDUR PERCOBAAN

1. Buatlah larutan stok A: 0,2 M natrium dihidrogen fosfat (27,8 g dalam 1000 mL
akuades) atau natrium dihidrogen fosfat hidrat (31,97 g dalam 1000 mL akuades).
2. Buatlah larutan stok B: 0,2 M dinatrium hidrogen fosfat (28,42 g dalam 1000 mL) atau
dinatrium hidrogen fosfat 7-hidrat (53,65 g dalam 1000 mL akuades)
3. Buatlah larutan buffer pada 4 keadaan pH yaitu 3, 5, 7 dan 9 melalui persamaan
Henderson-Hasselbach
 Stok A Stok B pH meter pH perhitungan

4. Setelah percampuran stok A dan stok B, maka lakukan pengecekan pH dengan pH

meter

Cara Membuat Buffer Secara Manual

[ ]

[ ]

[ ]

Misal:;
Va = X
Vg = (mL buffer yg akan dibuat – Va)

Nilai Va = mL stok A
Nilai Vg = mL stok B
Banyaknya mL stok A dan B
sesuai dengan mL buffer yang
akan dibuat.
Pembuatan Media
Pembuatan Media Pertumbuhan Mikroorganisme

Media adalah campuran zat-zat makanan untuk menumbuhkan mikroba. Media yang
dibutuhkan untuk menumbuhkan bakteri bervariasi tergantung pada jenis mikroba dan
jenis enzim yang akan dihasilkan.

Berdasarkan atas konsistensinya media terdiri dari:

a. Media padat : untuk mengisolasi biakan murni
b. Media semi padat : untuk menguji motilitas dan kemampuan fermentasi
c. Media cair : untuk pembiakan mikroba dalam jumlah besar

Berdasarkan komposisi kimiawinya dibedakan atas:

a. Media sintetik : komposisi zat kimia diketahui dengan tepat
b. Media non-sintetik : komposisi zat kimia tidak diketahui dengan tepat

Media harus memenuhi syarat-syarat berikut:

1. Mengandung semua zat makanan yang mudah digunakan oleh mikroba
2. Mempunyai pH yang sesuai
3. Tidak mengandung zat penghambat pertumbuhan
4. Bebas dari mikroba

Agar miring merupakan media berbentuk padat yang diletakkan dalam tabung reaksi yang
dimiringkan. Agar plate merupakan media padat yang diletakkan di dalam cawan petri.
Agar plate ini dapat digunakan untuk tujuan skrining atau untuk menumbuhkan
mikroorganisme. Sebelum cawan petri digunakan harus disterilisasi terlebih dahulu agar
tidak terjadi kontaminasi terhadap media yang diletakkan dalam cawan petri tersebut.
Agar ini digunakan sebagai media untuk menumbuhkan mikroorganisme (bakteri, jamur,
dan khamir). Media agar yang biasa digunakan untuk menumbuhkan bakteri adalah
Nutrient Agar (NA), Larient Broth (LB), sedangkan untuk jamur dan khamir adalah Potato
Dextrose Agar (PDA). Komponen dari NA adalah ekstrak ragi, pepton dan agar. Komponen
dari LB adalah pepton, ekstrak ragi, NaCl, dan agar. Cara membuat agar miring adalah
sebagai berikut:

a. Nutrient Agar (NA)

Sebanyak 3 gram ekstrak raga, 5 gram pepton, 15 gram agar dilarutkan dalam 1000 ml
akuadest.

b. Larient Broth (LB)

Sebanyak 10 gram pepton, 5 gram ekstrak ragi, 10 gram NaCl 10, dan 15 gram agar
dilarutkan dalam 1000 mL akuadest.

PROSEDUR KERJA

1. Teknik pembuatan tutup kapas tabung reaksi dan 10erlenmeyer

Tutup kapas/sumbat digunakan untuk menutup/menyumbat tabung reaksi atau labu
erlenmeyer sebagai wadah media pertumbuhan mikroorganisme. Hal ini bertujuan
 agar media ataupun mikroorganisme yang ada dalam tabung reaksi atau labu
11erlenmeyer tidak terkontaminasi. Cara membuat sumbat dari kapas yaitu dengan
mengambil kapas secukupnya (disesuaikan dengan ukuran mulut tabung atau labu
erlenmeyer1111), digulung, lalu dibungkus dengan kain kasa dan diuji kualitasnya
dengan cara memasangnya pada tabung reaksi atau labu 11erlenmeyer1111. Jika
pada saat penyumbat kapas ditarik dari tabung reaksi atau labu erlenmeyer
terdengar bunyi yang mantap maka kualitas penyumbat kapas yang dibuat baik
dan dapat digunakan.

2. Media agar miring

Sebanyak 2,8 gr NA dan atau 3,9 gr PDA dilarutkan dalam 100 ml akuades lalu
dipanaskan. Setelah media larut seluruhnya kemudian dimatikan bunsen, dan
dituangkan larutan sebanyak @ 4-5 ml tiap tabung reaksi. Lalu tabung reaksi ditutup
dengan sumbat kapas, kemudian media tersebut disterilkan dalam autoklaf pada
temperatur 121°C, tekanan 2 atm selama 15-20 menit setelah kondisi tercapai.
Setelah disterilisasi dengan autoklaf, setiap tabung reaksi diletakkan pada posisi
miring hingga agar memadat dan didiamkan selama kurang lebih 24 jam untuk
mengetahui bahwa media tersebut benar-benar steril dan tidak terkontaminasi.
Selanjutnya, media agar miring telah siap digunakan.

3. Pembuatan agar plate

Cara pembuatan agar plate sama dengan media agar miring, hanya saja diletakkan
dalam cawan petri bukan tabung reaksi. Cawan petri dapat disterilisasikan dengan
cara sterilisasi kering menggunakan oven (60-70oC) atau sterilisasi basah
menggunakan autoklaf. Sebelum cawan petri disterilkan harus dibungkus dengan
kertas, lalu disterilkan. Selanjutnya dimasukkan dalam laminar air flow, lalu disinari
dengan lampu UV dan diblower selama 10-15 menit. Setelah suhu media sekitar
60°C – 70°C, media dituangkan dalam cawan petri sampai merata. Lalu didinginkan
agar media memadat. Setelah media memadat, cawan petri ditutup dan dibungkus
kembali dengan kertas dan dapat disimpan dalam inkubator.
Laboratorium Biokimia

2. Uji Kualitatif Protein

Protein berasal dari kata proteos (Yunani) yang berarti pertama atau terutama.
Maksudnya adalah suatu zat yang terpenting di dalam kehidupan. Protein adalah senyawa
organik yang mengandung nitrogen yang sangat kompleks yang strukturnya terdiri dari
satuan-satuan asam amino yang terikat oleh ikatan peptida. Komposisi elementernya
menunjukkan bahwa selain karbon, hidrogen, oksigen, dan nitrogen kompleks dalam
jumlah bervariasi juga ditemukan belerang dan sulfur.

Umumnya protein dibedakan menjadi tiga golongan, yaitu :

a. Simple protein, contohnya albumin
b. Conjugated protein, contohnya lipo-protein (protein lemak)
c. Derived protein, contohnya protein a dan b

Percobaan berikut ini merupakan uji protein berdasarkan sifat-sifat koloid dari larutannya,
sejumlah reaksi-reaksi warna serta reaksi-reaksi pengendapan protein. Tipe/struktur
protein tergantung dari jenis asam-asam amino penyusunnya.

PROSEDUR KERJA

1. Komposisi Elementer

a. Masukkan 2 mL larutan putih telur ke dalam sebuah tabung reaksi yang bersih dan
kering, dan berangsur-angsur panaskan sampai tercium bau rambut terbakar, bau
ini khas untuk senyawa-senyawa yang mengandung nitrogen dari protein. Warna
hitam menunjukkan adanya karbon dan kondensasi air di bagian atas tabung
menunjukkan adanya oksigen dan hidrogen.

b. Masukkan 0,5 mL larutan putih telur ke dalam tabung reaksi, tambahkan sebanyak
dua kali volumenya kristal NaOH dan panaskan hati-hati. Perhatikan bau ammonia
atau pengaruh uapnya terhadap kertas lakmus merah yang telah dibasahi dengan
air, yang menunjukkan adanya nitrogen dan hidrogen.

c. Masukkan 1 mL larutan putih telur ke dalam sebuah tabung reaksi dan tambahkan 5
mL NaOH 10%. Didihkan campuran itu, tambahkan 10 tetes larutan Pb-Asetat 2%.
Larutan menjadi gelap atau hitam. Kemudian dengan hati-hati tambahkan 1 mL HCl
pekat dan perhatikan bau khas yang keluar, ini disebabkan oleh belerang. Didihkan
campuran itu, tambahkan 10 tetes larutan Pb-Asetat 2%. Larutan menjadi gelap
atau hitam. Kemudian dengan hati-hati tambahkan 1 mL HCl pekat dan perhatikan
bau khas yang keluar, ini disebabkan oleh belerang yang tidak teroksidasi.

Modul Praktikum Biokimia - Jurusan Kimia - FMIPA Unila Semester Genap 2021-2022 12
Laboratorium Biokimia

2. Pengendapan Protein oleh Logam-Logam Berat

Pada suatu pH tertentu (asam/basa) protein akan bermuatan negatif atau positif.
Pada suatu pH tertentu (asam/basa) protein akan bermuatan negatif (sebagai
anion) sehingga dapat bereaksi dengan ion logam berat (sebagai kation)
Protein (OH)- + L+ → endapan
Protein jika dalam larutan dapat berupa sebuah koloid. Dengan zat-zat tertentu
dapat diendapkan (irreversible) atau hanya sebagai emulsi (reversible).

Masukkan 3 mL larutan sampel protein (larutan putih telur) dalam tabung reaksi
yang pHnya telah disesuaikan kira-kira 7 (dengan menambah Na2CO3 1% sebanyak 3
tetes). Tambahkan tetes demi tetes pereaksi larutan AgNO 3 2% hingga 3 mL sambil
dikocok hati-hati dan perhatikan pengaruhnya tiap tetes penambahan. Perhatikan
apakah terbentuk endapan yang tetap atau melarut kembali, atau makin bertambah
dengan tiap penambahan pereaksi. Ulangi prosedur ini dengan menggunakan
larutan berikut ini sebagai pengganti AgNO3 yaitu : Pb-Asetat 2%, CuSO4 2%, HgCl2
2%, FeCl3 2 %.

3. Pengaruh Asam-asam Mineral Kuat

Semua asam kuat menghasilkan endapan dengan larutan protein, tetapi dengan
HNO3 pekat endapan itu yang paling sedikit dapat larut kembali dalam asam
berlebih.

Ke dalam 3 mL larutan putih telur ditambahkan beberapa HCl pekat. Campurkan

baik-baik dan perhatikan apakah ada endapan yang terbentuk. kemudian ditambah
HCl pekat beberapa tetes, perhatikan apakah endapan yang terbentuk akan larut
kembali dengan penambahan asam yang lebih banyak. Ulangi dengan penambahan
asam sulfat pekat dan asam nitrat pekat sebagai pengganti HCl.

4. Uji Heller

Uji Heller didasarkan atas pembentukan cincin tak berwarna dari protein yang
mengendap apabila larutan ditambahkan HNO3 pekat.

Ke dalam tabung reaksi masukkan 3 mL putih telur. Tuangkan dengan hati-hati 2 mL

HNO3 pekat melalui dinding tabung yang dimiringkan sampai horizontal supaya
tidak tercampur. Perhatikan endapan putih yang terbentuk dari hasil reaksi kedua
cairan itu. Ujilah kepekaan reaksi ini dengan mengencerkan larutan putih telur
hingga hanya menghasilkan reaksi dengan endapan yang sangat tipis.

5. Pengaruh Alkohol pada Protein

Ke dalam 1 mL larutan putih telur tambahkan 2,5 mL alkohol 95%. Campurkan baik-
baik. Apakah dan endapan yang terbentuk. Lakukan uji kelarutan dalam air dari
sedikit endapan itu.

Modul Praktikum Biokimia - Jurusan Kimia - FMIPA Unila Semester Genap 2021-2022 13
Laboratorium Biokimia

TUGAS PENDAHULUAN
1. Sebutkan fungsi protein dalam tubuh!
2. Gambarkan struktur asam amino, serta tunjukkan ikatan peptida yang terbentuk
bila asam amino tersebut membentuk rantai protein.
3. Mengapa logam dapat mengendapkan protein
4. Unsur-unsur apa yang biasannya ada dalam protein tetapi tidak ada dalam lipid dan
karbohidrat
5. Apakah pengertian istilah berikut :
a. Koagulasi
b. Denaturasi
c. Titik isoelektrik
d. Tetapan dielektrikum medium

Modul Praktikum Biokimia - Jurusan Kimia - FMIPA Unila Semester Genap 2021-2022 14
Laboratorium Biokimia

3. Uji Kualitatif Karbohidrat dan Lipid

Identifikasi Karbohidrat

PENDAHULUAN

Dalam kehidupan sehari-hari karbohidrat dapat kita jumpai pada nasi, tepung gandum,
susu, jagung, kedelai, ubi kayu, dan sebagainya. Karbohidrat adalah suatu hidrat /air dan
karbon (Cn[H2O]n), yaitu senyawa yang terdiri dari unsur-unsur C, H, dan O dengan berat
molekul yang tinggi. Argumentasi yang terbaru manyatakan bahwa karbohidrat adalah
suatu polihidrat alkohol dengan gugus-gugus aldehida atau keton atau turunannya.

Karbohidrat dibedakan dalam tiga kelompok besar (klsifikasi) yang terdiri dari:
a).Monosakarida; b).Oligosakarida; c).Polisakarida. Monosakarida adalah jenis karbohidrat
yang tidak dapat dipecah lagi menjadi unit yang lebih kecil (n=1). Oligosakarida adalah
kelipatan dari monosakarida (n=2, 3, dan 4). Sedangkan poliskarida mempunyai n lebih
dari 4.

Karbohidrat yang tergolong dalam kelompok monosakarida disebut juga gula sederhana,
yaitu diosa, triosa, tetrosa, pentosa (arabinosa, xylosa, ribosa), hexosa (glukosa, fruktosa,
galaktosa, manosa). Yang termasuk kelompok oligosakarida yaitu ditri, tetra, penta, dan
heksasakarida. Sedangkan kelompok polisakarida adalam amilum, glikogen, dekstrin, dan
selulosa.

Karbohidrat dapat pula dibagi berdasarkan ada atau tidaknya gugus aldehida atau keton
yang dimiliki oleh molekulnya. Bila terdapat gugus aldehida disebut aldosa, bila terdapat
gugus keton diberi nama ketosa.

PROSEDUR KERJA

A. Uji Kualitatif Karbohidrat

Sampel yang diuji larutan glukosa, fruktosa, amilum, laktosa, sukrosa, dan arabinosa;
masing-masing dengan konsentrasi 1%.

1. Uji Molisch (Test umum untuk semua karbohidrat)

Karbohidrat hidratase terhidrolisis oleh asam pekat memberikan suatu furfural atau
derivat-derivatnya, yang kemudian dengan α-naphtol dari pereaksi molisch bereaksi
membentuk senyawa yang berwarna ungu (Pereaksi Molisch terdiri dari larutan α-
naphtol 5% dalam alkohol 95%).

Modul Praktikum Biokimia - Jurusan Kimia - FMIPA Unila Semester Genap 2021-2022 15
Laboratorium Biokimia

Prosedur
Dalam tabung reaksi masukkan 2 mL sampel karbohidrat dan 2 tetes larutan molisch,
campurkan hingga homogen. Melalui dinding tabung yang dimiringkan, teteskan 5 mL
H2SO4 pekat perlahan-lahan. Perhatikan warna ungu kemerah-merahan/violet
berbentuk ring yang terjadi pada permukaan larutan bila uji positif.

2. Uji Benedict (Test untuk gula-gula pereduksi)

Gula-gula yang mempunyai gugus aldehid atau keton bebas dipanaskan dengan
Larutan Benedict (Na2CO3) membentuk enol reaktif yang akan mereduksi Cu2+ (CuSO4)
menjadi Cu+. Cu+. bersama OH- (Na-sitrat) membentuk CuOH (berwarna kuning) dan
dipanaskan menjadi endapan Cu2O yang berwarna merah. Warna yang terbentuk
bervariasi mulai dari hijau, kuning, orange, merah sampai endapan merah bata,
tergantung jumlah Cu2O yang terbentuk, sehingga reaksi ini dapat digunakan untuk
menentukan adanya gula baik secara kualitatif maupun kuantitatif.

Larutan A
Larutkan 173 g Na-sitrat + 100 mL Na2CO3 dalam 800 mL akuades (dibantu dengan
pemanasan) saring jika perlu.

Larutan B
Larutkan 17,3 g CuSO4 dalam 150 mL akuades hingga larut secara sempurna .

Tuangkan larutan B kedalam larutan A , sambil diaduk secara konstan, kemudian

diencerkan campuran dengan akuades hingga campuran menjadi 1 liter

Prosedur
Ke dalam tabung reaksi masukkan 1 mL sampel dan 5 mL larutan Benedict,
dihomogenkan. Masukkan dalam penangas air mendidih selama 15 menit. Amati
hasilnya, sampel mana yang memberikan endapan.

3. Uji Seliwanoff (Test untuk ketosa)

Reaksi didasarkan atas pembentukan 4-hidroksimetilfulfural oleh asam dan bereaksi

dengan pereaksi resorcinol (1,3-dihidroksibenzena) membentuk suatu senyawa
berwarna merah.

Kereaktifan aldosa dan ketosa sangatlah berbeda. Aldosa untuk terhidrolisis

membutuhkan asam pekat sedangkan ketosa membutuhkan asam encer sehingga
hidroksi metal furfural dari aldosa sedikit. Sedangkan untuk ketosa hidroksi metal
furfural yang terbentuk banyak. Karena itulah reaksi ini spesifik untuk fruktosa yang
termasuk ketoheksosa.

Larutan Seliwanoff terdiri dari 0,5g resorcinol dilarutkan ke dalam 1 liter HCl 3 M

Modul Praktikum Biokimia - Jurusan Kimia - FMIPA Unila Semester Genap 2021-2022 16
Laboratorium Biokimia

Prosedur
Ke dalam tabung reaksi masukkan 1 mL sampel + 5 mL larutan Seliwanoff, kocok,
kemudian tempatkan dalam air mendidih hingga timbul warna merah. Amati
hasilnya, mana yang memberikan warna.

4. Hidrolisa Suatu Polisakarida

Suatu polisakarida akan terhidrolisis oleh asam (H +) menjadi monosakarida.

HCl HCl HCl HCl HCl

Amilum Amilodekstrin Eritrodekstrin Akroodekstrin Maltosa Glukosa

I2 I2 I2 I2 I2 I2

biru ungu merah tidak berwarna tidak berwarna

PROSEDUR

Reagen:
 Larutan Amilum 1% (2 g amilum dalam 200 mL air)
 2 g KI dilarutkan dalam 200 mL air, tambahkan 0,5 g I 2 aduk hingga larut

Ke dalam Erlenmeyer masukkan 20 mL larutan amilum 1% dan 6 mL HCl 3 M,

masukkan dalam penangas air. Setiap waktu 3 menit, ambil 1 mL dari larutan amilum,
uji dengan 1 tetes larutan I2 dalam KI pada kaca arloji, catat warnanya. Perubahan
warna dicatat setiap interval 3 menit. Catat lama hidrolisa dalam menit, sampai
didapat hasil tidak memberikan warna lagi dengan I2 dalam KI.

TUGAS PENDAHULUAN
1. Apakah yang disebut karbohidrat itu, jelaskan dengan singkat!
2. Tuliskan prinsip reaksi untuk setiap perubahan yang saudara lakukan
3. Gambarkan skema langkap reaksi hidrolisis polisakarida amilum menjadi
monosakarida oleh asam menggunakan indikator I2. Jelaskan!
4. Tuliskan rumus bangun dari:
 Glukosa  Galaktosa
 Fruktosa  Maltosa
 Sukrosa  Gula invert (gula tebu)
5. Apakah perbedaan gula pereduksi dengan non-pereduksi serta berikan contoh
masing-masingnya

Modul Praktikum Biokimia - Jurusan Kimia - FMIPA Unila Semester Genap 2021-2022 17
Laboratorium Biokimia

Identifikasi Lemak

PENDAHULUAN

A. Uji Kualitatif Lipid

Secara kimia, lipida adalah ester dari gliserol dan asam lemak atau zat lain yang dapat
membentuk ester, di alam banyak ditemukan dalam bahan-bahan nabati dan hewani.
Yang disebut lipid bukan hanya lemak dan minyak, tetapi juga zat organik lain yang
sangat berlainan susunan kimianya, akan tetapi mempunyai sifat-sifat yang serupa
dalam hal tidak atau sukarnya larut dalam air, mudah larut dalam pelarut lemak
seperti eter, petroleum eter, kloroform, 18olatil, 18olatil panas da sebagainya.

Lipid dibedakan dalam 3 golongan besar, yaitu:

a. Simple lipid, contohnya lemak netral dan malam
b. Combined lipid, contohnya fosfolipida dan glikolipida
c. Derived lipid, contohnya asam lemak, aldehida, keton dan sterol

Sifat fisik lemak antara lain BJ < BJ air, trigliserida rantai pendek sedikit larut dalam
air, sedang yang berantai panjang tidak larut dalam air, tak berwarna, tak berasa, tak
berbau, tetapi warna, rasa, dan bau ada karena zat-zat yang dikandungnya. Sebagai
contoh warna kuning karena vitamin B2, karoten, dan xanthopyl.

Sifat kimia dari lipida antara lain mudah terhidrolisa pada suhu dan tekanan tinggi,
mudah teroksidasi oleh udara (Oksigen), safonikasi dengan panas dan basa
membentuk sabun. Uji-uji yang biasa dipakai untuk menentukan derajat mutu
lemak/lipida antara lain uji bilangan sabun, uji bilangan asam, uji bilangan ester, uji
bilangan iod, dan sebagainya.

PROSEDUR KERJA

1. Uji kelarutan
Sampel yang diuji: minyak kelapa, lemak, asam palmitat, gliserol
Pelarut yang digunakan: air, 18olatil, eter, kloroform
Kurang lebih 0,25 – 0,5 g lemak hewan atau 0,5 mL minyak kelapa dan 2 mL pelarut
masukkan ke dalam tabung reaksi. Kocok dan amati bagaimana kelarutannya. Khusus
untuk campuran 18olatil minyak /lemak, panaskan tabung dalam penangas. Amati
kelarutan dalam 18olatil panas. Susunlah dalam bentuk tabel pelarut-pelarut mana
yang paling mudah melarutkan minyak dan lemak, gliserol, dan asam palmitat.

2. Uji Ketidakjenuhan (Penentuan Angka Iodium)

Angka iod (iod number) didefinisikan sebagai banyaknya iodium dalam gram yang
diikat oleh 100 g lemak
a. Larutkan 0,5 mL asam oleat dalam 2 mL GHGl3. Tambahkan 1 tetes larutan hanus
iodine (1 g I2 dalam 100 mL KI 15%). Kocok hingga warna iod segera hilang. Ulangi
dengan menggunakan asam palmitat, sebagai pengganti asam oleat. Terangkan
perbedaannya!

Modul Praktikum Biokimia - Jurusan Kimia - FMIPA Unila Semester Genap 2021-2022 18
Laboratorium Biokimia

b. Ke dalam 19olatile1919 300 mL masukkan 1 mL minyak atau 1 g mentega,

tambahkan 10 mL kloroform. Kemudian tambahkan 20 mL larutan iod hanus,
tutup rapat, diamkan 30 menit, tiap kali dikocok-kocok tambahkan 10 mL larutan
KI 15%. Titrasi dengan Na2S2O3 0,2 N dengan 19olatile19 amilum 1% sampai
warna biru hilang. Lakukan terhadap blanko (semua komponen zat-zat tersebut di
atas kecuali minyak)

Misalkan untuk titrtasi sampel membutuhkan a mL Na 2S2O3, sedangkan blanko

membutuhkan b mL Na2S2O3, maka:

3. Uji Ketengikan (Uji Kreis)

Pada umumnya pada proses ketengikan berlangsung 2 macam reaksi kimia, yaitu
hidrilisis dan oksidasi. Hidrolisisi akan menghasilakan asam lemak-asam lemak bebas
19olatile yang berbau tidak enak karena adanya air dalam lemak/minyak dan
berbagai jenis mikroorganisme dari udar serta panas akan mempercepat
berlangsungnya reaksi hidrolisis.

Proses oksidasi merupakan reaksi kimia kedua yang dapat menyebabkan ketengikan.
Oksigen dari udara dapat menyerang rantai-rantai tidak jenuh yang terkandung
dalam campuran gliserida. Hasil reaksi oksidasi ini adalah asam lemak-asam lemak
bebas 19olatile berantai pendek atau macam-macam aldehid yang menimbulkan bau
tengik.

a. Masukkan 1 mL minyak ke dalam tabung reaksi, tambahkan 1 mL larutan

floroglusinol 0,1% dalam eter dan 1 mL HCl pekat. Lalu kocok. Warna merah atau
merah jambu yang terbentuk sesudah dibiarkan menunjukkan adanya ketengikan.
Lakukan uji ini terhadap minyak kelapa biasa dan minyak sayur, serta terhadap
lemak hewan yang sudah dibiarkan lama, dan telah dicairkan terlebih dahulu.

TUGAS PENDAHULUAN

1. Apakah yang dimaksud dengan lemak?

2. Sebutkan peranan lemak bagi tubuh!
3. Tuliskan rumus molekul lemak, dan sebutkan pembagian lemak berikut contohnya
masing-masing 3 buah!
4. Apakah yang dimaksud dengan:
a. Bilangan sabun
b. Bilangan ester
c. Bilangan asam
d. Bilangan iodide
e. Bilangan polenske
f. Bilangan rancidity
g. Anti oksidan
h. Fosfolipida

Modul Praktikum Biokimia - Jurusan Kimia - FMIPA Unila Semester Genap 2021-2022 19
Laboratorium Biokimia

4. Skrining dan Pembiakan Bakteri

Skrining Bakteri

TUJUAN
1. Untuk mendapatkan bakteri dari sampel (tanah)
2. Mengetahui teknik skrining bakteri

PENDAHULUAN

Isolasi adalah pemindahan mikroba dari lingkungan alaminya dan menumbuhkan sebagai
biakan murni dalam media buatan.

PROSEDUR KERJA

Sebanyak 1 gram sampel tanah diencerkan dengan akuades steril atau larutan salin
(0,85% NaCl) sebanyak 100 ml kemudian dilakukan pengenceran hingga 10 kali.
Selanjutnya dari 20iltrate sampel tersebut diambil sebanyak 1 mL dan dimasukkan ke
1
dalam tabung reaksi yang berisi akuades steril sebanyak 9 mL (pengenceran 10- ), dari
-1
tabung pengenceran 10 diambil sebanyak 1 ml kemudian dimasukkan ke dalam tabung
2 -10
selanjutnya (pengenceran 10- ), dan seterusnya hingga pengenceran 10 . Sebanyak 1-2
mL sampel dari setiap pengenceran ditanam pada agar plate. Kemudian diinkubasi dalam
inkubator, setelah mikroba tumbuh, dapat diamati dan setiap pengenceran dibandingkan.
Semakin banyak pengenceran, jenis mikroba yang tumbuh semakin sedikit.

Pembiakan Bakteri

TUJUAN
1. Meningkatkan ketrampilan dalam teknik penggoresan
2. Dapat membedakan mikroba yang diharapkan dan mikroba kontaminasi

PENDAHULUAN

Pembiakan adalah proses perbanyakan mikroorganisme dengan menyediakan unsur yang

tepat. Tujuan pembiakan:
a. Untuk mengisolasi mikroba dari habitat aslinya.
b. Untuk mempertahankan biakan murni

Modul Praktikum Biokimia - Jurusan Kimia - FMIPA Unila Semester Genap 2021-2022 20
Laboratorium Biokimia

Secara umum digunakan 4 teknik isolasi:

1. Teknik gores zigzag, teknik ini biasa dipakai pada media padat dalam tabung reaksi
dan cawan petri dengan cara menarik garis secara zigzag.
2. Teknik tusuk, teknik ini biasa dipakai pada media padat dalam tabung dan cawan
petri dengan cara menusuk media ¾ bagian.
3. Teknik gores kuadran, teknik ini banyak digunakan untuk mengisolasi satu koloni
bakteri ataupun jamur.
4. Teknik tuang atau 21iltr, teknik ini biasa digunakan untuk mengisolasi mikroorganisme
yang berasal dari sampel (tanah) dimana konsentrasi sel mikroba tidak diketahui.
Mikroba yang tumbuh dapat berupa anaerob dan aerob sehingga adanya kontaminasi
tidak diketahui (Hadioetomo, R.S., 1993).

Untuk memindahkan mikroba digunakan jarum ose dalam keadaan aseptis. Bentuk jarum
ose untuk bakteri berbeda dengan jarum ose untuk jamur.

Ose untuk bakteri Ose untuk jamur

Jarum ose yang digunakan terlebih dahulu dicelupkan pada alkohol, lalu dibakar pada
nyala api hingga membara setelah agak dingin kemudian digunakan untuk mengambil
mikroba dari kultur untuk dipindahkan ke media agar miring atau agar plate dengan cara
digoreskan. Setelah digunakan, jarum ose dipanaskan/dibakar lalu dicelupkan ke dalam
21iltrat kembali.

PROSEDUR

1. Teknik gores zig-zag

Ambil tabung reaksi dan cawan petri yang telah berisi media pertumbuhan NA, NA
pati, PDA dan PDA selulosa. Lalu goreslah media secara zig-zag dengan jarum ose
dalam keadaan aseptis di dalam laminar air flow.

2. Teknik tusuk
Ambil tabung reaksi dan cawan petri yang telah berisi media pertumbuhan NA, NA
pati, PDA dan PDA selulosa. Lalu goreslah media secara zig-zag dengan jarum ose
dalam keadaan aseptis di dalam laminar air flow.

Modul Praktikum Biokimia - Jurusan Kimia - FMIPA Unila Semester Genap 2021-2022 21
Laboratorium Biokimia

5. Isolasi Enzim dari Bakteri Bacillus subtilis ITBCCB148 dan

Jamur Aspergillus niger

TUJUAN
 Mengetahui cara membuat media dan inokulasi bakteri dan jamur dalam jumlah
besar
 Mengetahui cara memproduksi enzim dengan baik

PENDAHULUAN

Isolasi enzim dari bakteri selalu diawali dengan menumbuhkan/membiakkan bakteri pada
media selektif tertentu sehingga akan diperoleh bakteri dalam jumlah besar. Media yang
digunakan biasanya berupa media cair.

Media cair merupakan media yang banyak digunakan untuk memperbanyak atau
pembiakan bakteri dalam jumlah besar. Dalam percobaan ini mengunakan media
22inokulum dan media fermentasi. Kedua media tersebut memiliki komposisi yang
sama, hanya saja medium inokulum merupakan medium adaptasi sebelum dibiakkan
dalam media yang lebih besar (media fermentasi). Dimana suatu media memiliki
komposisi tertentu untuk mendapatkan enzim tertentu dari bakteri tertentu juga. Setiap
media memiliki sumber nutrisi yang berupa karbohidrat, mineral, buffer.

PROSEDUR KERJA

Media inokulum dan fermentasi Bacillus yang digunakan terdiri dari0,5% pati, 0,5%
yeast ekstrak, 0,02% MgSO4.7H2O, 0,01% CaCl2.5H2O dan 0,05% KH2PO4 dilarutkan
dalam akuades. Media ini disterilisasi pada suhu 121ºC, tekanan 1 atm, selama kurang
lebih 15 menit dalam autoklaf.

Media inokulum dan fermentasi Aspergillus yang digunakan terdiri dari 0,03% urea,
0,03% KCl, 0,02% MgSO4.7H2O, 0,03% CaCl2.5H2O, 0,2% KH2PO4, 0,1% selulosa,
0,14% (NH4)SO4, 0,2% yeast ekstrak, 0,2% pepton, 0,05% glukosa, dilarutkan dalam
akuades. Media ini disterilisasi pada suhu 121ºC, tekanan 1 atm, selama kurang lebih 15
menit dalam autoklaf.

Media inokulum yang telah dishaker selama 24 jam diambil 2% dari volum media
fermentasi dilakukan dalam keadaan aseptik. Kemudian media di shaker selama 72 jam
(Yandri et al., 2010).

Modul Praktikum Biokimia - Jurusan Kimia - FMIPA Unila Semester Genap 2021-2022 22
Laboratorium Biokimia

6. Produksi Enzim α-amilase dari Bakteri Bacillus subtilis ITBCCB148

dan Enzim Selulase dari Jamur Aspergillus niger

PENDAHULUAN

Enzim dapat diproduksi dengan cara mensentrifugasi ekstrak kasar enzim. Sentrifugasi
merupakan salah satu teknik untuk memisahkan antara pelet (endapan) dengan
23supernatan (filtrat). Cara memisahkan pelet dengan endapan adalah sebagai berikut:
cairan atau larutan dimasukkan ke dalam tabung sentrifugasi dan volumenya harus
sama. Kemudian tabung tersebut dimasukkan ke dalam alat sentrifuga (letaknya harus
seimbang), atur kecepatan dan waktu putaran. Untuk memisahkan ekstrak kasar enzim
dari sel-sel mikroba pada umumnya menggunakan kecepatan 5000 rpm selama 15-20
menit.

Penentuan kurva pertumbuhan bertujuan untuk mengetahui waktu yang tepat untuk
pemanenan mikroba. Penentuan kurva pertumbuhan dapat dilakukan dengan cara
menumbuhkan mikroba dalam media cair steril, kemudian diinkubasi dalam shaker
incubator23 selama waktu tertentu. Setiap beberapa jam (misalnya setiap 1 jam)
dilakukan sampling dan pengukuran. Dari data-data yang diperoleh, dapat dibuat kurva
pertumbuhan mikroba, sehingga dapat diketahui waktu adaptasi, fase log, fase
eksponensial, fase stasioner, dan fase kematian dari mikroba tersebut.

PROSEDUR KERJA

Setelah media fermentasi yang berisi Bacillus subtilis ITBCCB148 dan Aspergillus niger
dikocok menggunakan shaker incubator selama 72 jam selanjutnya biakan disentrifugasi
dengan kecepatan 5000 rpm pada suhu 4oC selama 20 menit. Filtrat yang diperoleh
disebut ekstrak kasar enzim yang akan diuji aktivitasnya dengan metode Fuwa, metode
Mandels dan diukur kadar proteinnya dengan metode Lowry.

A. Uji Aktivitas α-Amilase dengan metode Fuwa

1. Pembuatan pereaksi untuk pengukuran aktivitas α-amilase metode Fuwa

a. Pereaksi iodin
Dimasukkan 2 gram KI dalam labu takar 100 mL dan dilarutkan dalam 10 mL
akuades. Lalu ditambahkan 0,2 gram I2. Kemudian ditambahkan akuades hingga
batas meniskus.

Modul Praktikum Biokimia - Jurusan Kimia - FMIPA Unila Semester Genap 2021-2022 23
Laboratorium Biokimia

b. Larutan pati
0,1 gram pati dilarutkan dalam 100 mL akuades dan dipanaskan hingga larut.
c. Larutan HCl 1N
Hitung pengenceran HCl pekat 12 N menjadi 1N. Maka akan diperoleh 8,3 mL HCl
pekat yang akan ditambah akuades hingga batas miniskus pada labu ukur
100 mL.

2. Uji aktivitas
Aktivitas α-amilase ditentukan oleh metode iodin (Fuwa, 1954). Metode ini
berdasarkan jumlah pengurangan jumlah pati hingga menghasilkan warna bening.

Sebanyak 0,25 mL enzim ditambahkan ke dalam 0,25 mL larutan pati 0,1% lalu
diinkubasi pada suhu 60oC selama 10 menit. Reaksi dihentikan dengan penambahan
0,25 mL HCl 1 N dan kemudian ditambahkan 0,25 mL pereaksi iodin dan 4 mL
akuades. Lalu campuran diaduk rata dan diukur serapannya menggunakan
spektrofotometer UV- VIS pada λ 600 nm.

Kontrol dibuat dengan cara yang sama, hanya menggunakan 0,25 mL enzim yang
sudah diinaktifkan dengan HCl. Penentuan aktivitas dengan menggunakan metode
iodin dilakukan pada tahap isolasi, pemurnian dan karakterisasi enzim.

B. Uji Aktivitas α –amilase dengan Metode Mandels

1. Pembuatan pereaksi untuk pengkuran aktivitas α-amilase metode Mandels

Dalam labu ukur 100 mL, dimasukkan 1% DNS (dinitrosalisilic acid), 1% NaOH, 0,2%,
fenol, 0,05% Na2SO3, 40% Na(K) tartrat kemudian dilarutkan dengan 100 mL
akuades hingga tanda batas (Mandels et al., 1976).

2. Uji aktivitas
Metode ini berdasarkan glukosa yang terbentuk (Mandels et al., 1976). Sebanyak 0,5
mL enzim, 0,5 mL larutan pati 0,1 % dan buffer fosfat pH 6,0 dicampur lalu
diinkubasi selama 30 menit pada suhu 60oC. Kemudian ditambahkan 2 mL pereaksi
DNS dididihkan selama 10 menit pada penangas air dan didinginkan. Setelah dingin,
serapannya diukur menggunakan spektrofotometer UV-VIS pada λ 510 nm. Kadar
glukosa yang terbentuk ditentukan dengan menggunakan kurva standar glukosa. Uji
ini dilakukan pada tahap penentuan KM dan Vmaks.

B. Penentuan kadar protein metode Lowry (Lowry et al., 1951)

1. Pembuatan pereaksi
Pereaksi A : 2 gram Na2CO3 dilarutkan dalam 100 mL NaOH 0,1N.
Pereaksi B : 5 mL larutan CuSO4.5H2O 1% ditambahkan ke dalam 5 mL
larutan Na/K-tartrat 1%.
Pereaksi C : 2 mL pereaksi B + 100 mL pereaksi A.
Pereaksi D : reagen folin ciocelteau diencerkan dengan akuades 1:1.

Modul Praktikum Biokimia - Jurusan Kimia - FMIPA Unila Semester Genap 2021-2022 24
Laboratorium Biokimia

Larutan standar : larutan BSA (Bovine Serum Albumin) dengan kadar 20, 40, 60, 80,
100, 120, 140 ppm
2. Penentuan kadar protein
Kadar protein enzim ditentukan dengan metode Lowry (1951). Sebanyak 0,1 mL
enzim yang akan diukur kadar proteinnya ditambahkan 0,9 mL akuades lalu
direaksikan dengan 5 mL pereaksi C dan campuran diaduk rata kemudian dibiarkan
selama 10 menit pada suhu kamar. Setelah itu ditambahkan dengan cepat 0,5 mL
pereaksi D dan diaduk dengan sempurna, didiamkan selama 30 menit pada suhu
kamar. Untuk kontrol, 0,1 mL enzim diganti dengan 0,1 mL akuades, selanjutnya
perlakuannya sama seperti sampel. Serapannya diukur menggunakan
spektrofotometer UV-VIS pada λ 750 nm. Untuk menentukan konsentrasi protein
enzim yang digunakan kurva standar BSA (Bovine Serum Albumin).

Modul Praktikum Biokimia - Jurusan Kimia - FMIPA Unila Semester Genap 2021-2022 25
Laboratorium Biokimia

7. Pemurnian Enzim α-Amilase dari Bacillus subtilis ITBCCB148 dan

Enzim Selulase dari Aspergillus niger dengan Ammonium Sulfat

TUJUAN

Mengetahui cara pemurnian enzim dengan ammonium sulfat

PENDAHULUAN

Pemurnian enzim merupakan tahap dimana enzim yang diinginkan dipisahkan dari
protein lain dengan tujuan untuk meningkatkan aktivitas enzim. Fraksinasi merupakan
proses pengendapan secara bretahap. Pengendapan dilakukan dengan penambahan
garam seperti natrium klorida, natrium sulfat ataupun ammonium sulfat.

Menurut Suhartono (1989), Penambahan senyawa elektrolit menurunkan kelarutan

protein, karena kelarutannya dipengaruhi oleh kekuatan ion. Dengan meningkatnya
kekuatan ion, kelarutan enzim akan semakin besar atau disebut dengan peristiwa salting
in, setelah mencapai suatu titik tertentu kelarutannya akan semakin menurun atau
disebut peristiwa salting out. Pada kekuatan ion rendah, protein akan terionisasi
sehingga interaksi antar protein akan menurun dan kelarutan akan meningkat.
Peningkatan kekuatan ion ini meningkatkan kadar air yang terikat pada ion, dan jika
interaksi antar ion kuat, kelarutannya menurun akibatnya interaksi antar protein lebih
kuat dan kelarutannya menurun.

Senyawa elektrolit yang sering digunakan untuk mengendapkan protein ialah ammonium
sulfat. Kelebihan ammonium sulfat dengan dibandingkan dengan senyawa-senyawa
elektrolit lain ialah memiliki kelarutan yang tinggi, tidak mempengaruhi aktivitas enzim,
mempunyai daya pengendap yang efektif, efek penstabil terhadap kebanyakan enzim,
dapat digunakan pada berbagai pH dan harganya murah.

PROSEDUR KERJA

Ekstrak kasar enzim yang diperoleh diendapkan dengan garam ammonium sulfat
pada berbagai derajat kejenuhan yaitu (0-15)%; (15-30)%; (30-45)%; (45-60); (60-75)%;
dan (75-90)%. Skema proses pengendapan protein enzim dengan penambahan amonium
sulfat ditunjukkan pada gambar berikut:

Modul Praktikum Biokimia - Jurusan Kimia - FMIPA Unila Semester Genap 2021-2022 26
Laboratorium Biokimia

Sejumlah ekstrak kasar enzim yang diperoleh ditambahkan garam ammonium sulfat
secara perlahan sambil diaduk dengan magnetic stirer. Endapan protein enzim yang
didapatkan pada tiap fraksi kejenuhan ammonium sulfat dipisahkan dari filtratnya
dengan sentrifugasi dingin pada kecepatan 5000 rpm selama 20 menit. Kemudian
endapan yang diperoleh dilarutkan dengan buffer phosfat 0,1 M pH 6,0 dan diuji
aktivitasnya dengan metode Fuwa dan metode Mandels serta diukur kadar proteinnya
dengan metode Lowry. Selanjutnya, filtrat yang didapat dari fraksi 0-15% digunakan
untuk diendapkan kembali dengan fraksi kejenuhan 15-30% dengan prosedur yang sama.

Modul Praktikum Biokimia - Jurusan Kimia - FMIPA Unila Semester Genap 2021-2022 27
Laboratorium Biokimia

8. Dialisis Enzim α-Amilase dari Bacillus subtilis ITBCCB148

dan Enzim Selulase dari Aspergillus niger

TUJUAN

Mengetahui dan memahami cara mendialisis enzim

PENDAHULUAN

Dialisis merupakan metode yang digunakan untuk memisahkan garam dari larutan protein
berdasarkan pada sifat semipermeabel membran. Secara umum, proses dialisis
berlangsung sebagai berikut: Larutan protein atau enzim dimasukkan ke dalam kantung
dialisis yang terbuat dari membran semipermeabel (selofan). Jika kantung yang berisi
larutan protein atau enzim dimasukkan ke dalam larutan buffer, maka molekul kecil yang
ada di dalam larutan protein atau enzim seperti garam anorganik akan keluar melewati
pori-pori membran, sedangkan molekul protein atau enzim yang berukuran besar tetap
tertahan dalam kantung dialisis. Keluarnya molekul menyebabkan distribusi ion-ion yang
ada di dalam dan di luar kantung dialisis tidak seimbang. Untuk memperkecil pengaruh ini
digunakan larutan buffer dengan konsentrasi rendah di luar kantung dialisis (Lehninger,
1982). Setelah tercapai keseimbangan, larutan di luar kantung dialisis diganti dengan
larutan yang baru agar konsentrasi ion-ion di dalam kantung dialisis dapat dikurangi.

Proses ini dapat dilakukan secara terus menerus sampai ion-ion di dalam kantung dialisis
dapat diabaikan. Difusi zat terlarut bergantung pada suhu dan viskositas larutan.
Meskipun suhu tinggi dapat meningkatkan laju difusi, namun sebagian besar protein dan
enzim stabil pada suhu 4-8°C sehingga dialisis harus dilakukan di dalam ruang dingin.

PROSEDUR KERJA

Endapan enzim yang telah dilarutkan dari tiap fraksi amonium sulfat dengan aktivitas
spesifik yang tinggi dimasukkan ke dalam kantong selofan dan didialisis dengan buffer
fosfat 0,01 M pH 6 selama 24 jam pada suhu dingin. Selama dialisis, dilakukan pergantian
buffer selama 4-6 jam agar konsentrasi ion-ion di dalam kantong dialisis dapat dikurangi.
Proses ini dilakukan secara kontinu sampai ion-ion didalam kantong dialisis dapat
diabaikan. Untuk mengetahui bahwa sudah tidak ada lagi ion-ion garam dalam kantong,
maka diuji dengan menambahkan larutan Ba(OH)2 atau BaCl2, bila masih ada ion sulfat
dalam kantong, maka akan terbentuk endapan putih BaSO 4. Semakin banyak endapan
yang terbentuk, maka semakin banyak ion sulfat yang ada dalam kantong. Selanjutnya
dilakukan uji aktivitas dengan metode Fuwa, serta diukur kadar proteinnya dengan
metode Lowry.

Modul Praktikum Biokimia - Jurusan Kimia - FMIPA Unila Semester Genap 2021-2022 28
 9. Kromatografi Kolom Enzim α-Amilase dari Bacillus subtilis ITBCCB148
dan Enzim Selulase dari Aspergillus niger dengan CM-Selulase

TUJUAN

Mengetahui dan memahami cara kromatografi kolom dengan CM-selulosa

PENDAHULUAN

Kromatografi kolom merupakan metode yang banyak digunakan untuk isolasi dan
pemurnian enzim. Pada kromatografi kolom suatu fluida dialirkan ke dalam kolom yang
mengandung matriks bahan pengisi dan molekul yang ingin dipisahkan menjadi beberapa
komponen dengan adanya perbedaan daya ikat terhadap bahan pengisi. Pada proses
isolasi dan pemurnian enzim dikenal tiga jenis kromatografi, yaitu kromatografi filtasi
gel, kromatografi afinitas, dan kromatografi ion.

1. Kromatografi filtrasi gel

Kromatografi filtrasi gel yang digunakan untuk memisahkan protein yang mempunyai
berat molekul tinggi dengan protein atau molekul lain yang berat molekulnya rendah.
Salah satu bahan terpenting sebagai gel adalah dektran (polimer gula yang biasa larut
dalam air) yang telah mengalami reaksi “cross linkage” yang secara komersil dikenal
dengan nama sephadex. Pemisahan dengan metode ini didasarkan pada ukuran protein.
Matriks filtrasi gel mengandung pori yang memungkinkan buffer dan protein lebih kecil
memasukinya sedangkan protein yang lebih besar tidak dapat memasukinya sehingga
akan keluar terlebih dulu (Watson, 1987).

Kromatogafi filtrasi gel merupakan teknik pemurnian yang kapasitasnya lemah. Namun,
metode ini efektif dalam pemisahan enzim dari pelarut penggumpal, larutan garam dan
buffer yang tidak dikehendaki. Kapasitas sampelnya cukup tinggi dan efesien filtrasi gel
meningkat dengan semakin tingginya kolom.

2. Kromatografi penukaran ion

Prinsip dasar teknik penukaran ion adalah memisahkan biomolekul berdasarkan muatan
ioniknya. Pernukaran ion terdiri atas matriks yang tidak larut dan gugus bermuatan yang
terikat secara kovalen pada matriks. Gugus-gugus bermuatan berasosiasi dengan
“counter ion”. Counter ion dapat diganti secara reversibel oleh ion-ion lain yang
bermuatan sama. Penukaran ion yang bemuatan positif mempunyai counter ion yang
bermuatan negatif, sehingga disebut dengan penukaran anion. Sedangkan penukaran
kation bermuatan negatif dan mempunyai counter ion yang bermuatan positif. Matriks
Laboratorium Biokimia

dapat berupa senyawa anorganik, resin sintetik, polisakarida, dan sebagainya (Wolfe,
1993).

Protein yang terikat pada penukaran ion dapat dialusi kolom dengan mengubah pH atau
konsentrasi garam, misalnya NaCl. Pada saat konsentarsi garam naik, protein akan diganti
Cl pada penukar anion dan akan digantikan oleh Na+ pada penukaran kation. Penukaran
ion dengan matriks selulosa yang banyak digunakan dalam pemisahan protein adalah
DEAE-selulosa (dietilaminoetil-selulosa) dan CM-selulosa (karboksimetil- selulosa). Gugus
DEAE, - OC2H5NH(C2H5)2 bemuatan positif pada pH 6,0-8,0 sehingga dapat digunakan
untuk protein yang bermuatan negatif pada rentang pH tersebut. Sedangkan CM-selulosa
(selulosa-OCH2COO-) dapat digunakan untuk memisahkan protein yang bermuatan positif
pada pH 4,5.

Kelebihan metode ini dibandingkan dengan kromatografi filtrasi gel adalah kromatografi
penukar ion tidak terlalu dipengaruhi oleh tinggi kolom. Efisien dapat diperbaiki dengan
meningkatkan diameter kolom, apabila digunakan jumlah sampel yang lebih banyak. Pada
filtrasi gel memerlukan kolom yang lebih tinggi untuk penggunaan sampel yang lebih
banyak.

3. Kromatografi afinitas

Pada metode ini, pemisahan terjadi karena adanya interaksi spesifik diantara pasangan
senyawa (seperti makromolekul enzim dengan subtrat, kofaktor allosetrik, efektor atau
inhibitor). Pada prinsipnya, suatu ligan yang terikat secara kovalen pada matriks yang
tidak larut air akan menyerap salah satu satu beberapa komponen dari campuran.
Komponen yang diserap harus mempunyai afinitas yang spesifik terhadap ligan tersebut.
Komponen-komponen yang tidak mempunyai afinitas akan melaju terus. Molekul-
molekul yang telah diserap dapat dilepaskan dengan mengubah kondisi elusi (dengan
larutan bebas ligan atau perubahn pH dan kakuatan ion) (Murray, 2003).

Keuntungan menggunakan teknik ini adalah sifat interaksinya yang spesifik. Jumlah
adsorben yang dibutuhkan dapat disesuaikan dengan jumlah zat yang akan diadsorpsi,
partikel-partikel yang terserap dapat dilepaskan dengan mudah dan absorben dapat
diregenerasi beberapa kali (Suhartono,1989).

PROSEDUR KERJA

a. Pengembangan gel dan pencucian CMC

Sebanyak 40 gram CMC disuspensikan dalam akuades dan dibiarkan mengembang pada
suhu kamar. Partikel halus dibuang dengan cara dekantasi. Setelah itu ditambahkan
600 mL NaOH 0,5 M dan diaduk perlahan-lahan selama 30 menit, lalu didekantasi
dan dilakukan pencucian dengan akuades sampai air cucian menunjukkan pH 8.
Kenudian CMC direndam dengan 600 mL larutan HCl 0,5 M selama 30 menit sambil
sekali- kali diaduk. Setelah itu dilakukan pencucian lagi dengan akuades sampai air cucian
bersifat netral, CMC ini kemudian distabilkan dengan buffer awal.

Modul Praktikum Biokimia - Jurusan Kimia - FMIPA Unila Semester Genap 2021-2022 1
Laboratorium Biokimia

b. Penentuan buffer awal

CMC yang sudah siap, distabilkan menggunakan buffer fosfat 0,1 M dengan variasi pH
yaitu 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; 8,0. Kemudian ke dalam matriks ditambahkan 0,5 mL
enzim hasil dialisis dan dielusi dengan buffer yang sesuai, diaduk 5-10 menit. Campuran
tersebut selanjutnya dibiarkan hingga CMC mengendap. Supernatan selanjutnya
didekantasi dan diuji aktivitas enzimnya.

c. Penentuan buffer elusi

Penentuan buffer elusi dilakukan sama seperti di atas, setelah CMC distabilkan
menggunakan buffer fosfat 0,1 M dan kemudian ke dalam masing-masing tabung
ditambahkan 0,5 mL enzim, kemudian masing-masing tabung dielusi dengan buffer fosfat
dengan pH yang divariasikan, diaduk 5-10 menit. Campuran tersebut selanjutnya
dibiarkan hingga CMC mengendap dan supernatan didekantasi dan diuji aktivitas
enzimnya.

d. Penyiapan kolom gel

Kolom berukuran 1,5 x 50 cm dibubuhi wol gelas atau kapas di ujung bawah. Kolom
dipasang tegak lurus. Bubur gel yang telah mengembang selanjutnya dimasukkan ke
dalam kolom dengan kondisi tidak terlalu kental. Untuk menghindari timbul gelembung
udara dalam kolom gel, karena pengatur dibiarkan terbuka.

e. Penstabilan gel

Gel dalam kolom distabilkan dengan mengalirkan akuades sebanyak 2 kali volum matriks,
dilanjutkan dengan mengalirkan buffer fosfat pH pengikatan enzim (hasil pemeriksaan)
sebanyak 2 kali volum matriks atau sampai kondisi pH pengikatan tercapai. Karena
pengatur dibuka sedemikian rupa sehingga kecepatan tetesan 1-2 mL/menit.

f. Penempatan cuplikan enzim ke dalam kolom

Sebanyak 25 mL enzim hasil dialisis dimasukkan ke dalam kolom yang telah berisi CMC.
Enzim dielusi dengan buffer awal dan eluat ditampung sebanyak 25 mL untuk fraksi 1-25.
Selanjutnya dielusi dengan buffer elusi. Eluat ditampung dengan volume 25 mL untuk
fraksi 26-50. Fraksi pertama dimulai pada saat cuplikan enzim telah dimasukkan.

g. Pengukuran protein enzim hasil kromatografi kolom.

Untuk mengetahui pola protein enzim hasil kromatografi kolom, maka setiap fraksi diukur
pada λ 280 nm menggunakan spektrofotometer UV-VIS.

h. Pengukuran aktivitas enzim

Setiap fraksi pada puncak protein yang diperoleh dari pengukuran eluen yang ditentukan
aktivitasnya. Pada fraksi yang menunjukkan aktivitas unit tertinggi ditentukan kadar
proteinnya untuk mengetahui aktifitas spesifiknya.

Modul Praktikum Biokimia - Jurusan Kimia - FMIPA Unila Semester Genap 2021-2022 2
Laboratorium Biokimia

10. Penentuan Kadar Glukosa Darah

TUJUAN

Untuk memahami cara menentukan kadar glukosa darah

PENDAHULUAN

Perubahan konsentrasi senyawa tertentu dalam tubuh dapat memberikan indikasi

mengenai fungsi metabolisme dalam tubuh. Glukosa terbentuk dari karbohidrat dalam
makanan dan disimpan sebagai glikogen dalam hati dan otot rangka. Kadar glukosa
dipengaruhi oleh 3 macam hormon yang dihasilkan oleh kelenjar pankreas. Hormon-
hormon itu adalah :
a. Insulin dihasilkan oleh sel-sel β, untuk mendorong penyimpanan energi dan
meningkatkan pemakaian glukosa.
b. Glukagon dihasilkan oleh sel-sel α, meningkatkan sintesis protein dan
menstimulasi glikogenolisis (pengubahan glikogen cadangan menjadi glukosa)
dalam hati.
c. Somatostatin dihasilkan oleh sel-sel delta, menghambat sekresi glukagon dan
insulin.

Saat setelah makan atau minum, terjadi peningkatan kadar gula darah yang merangsang
pankreas menghasilkan insulin untuk mencegah kenaikan kadar gula darah lebih lanjut.
Insulin memasukkan gula ke dalam sel sehingga bisa menghasilkan energi atau disimpan
sebagai cadangan energi.

Nilai Rujukan
a. Gula darah sewaktu
DEWASA : Serum dan plasma : sampai dengan 140 mg/dl;
Darah lengkap : sampai dengan 120 mg/dl
ANAK : Sampai dengan 120 mg/dl
LANSIA : Serum dan plasma : sampai dengan 160 mg/dl;
Darahlengkap : sampai dengan 140 mg/dl.
b. Gula darah puasa
DEWASA : Serum dan plasma : 70 – 110 mg/dl;
Darah lengkap : 60 – 100 mg/dl;
Nilai panik : kurang dari 40 mg/dl dan > 700 mg/dl
ANAK : Bayi baru lahir : 30 – 80 mg/dl; Anak : 60 – 100 mg/dl
LANSIA : 70 – 120 mg/dl.
c. Gula darah 2 jam setelah makan (post prandial)
DEWASA : Serum dan plasma : sampai dengan 140 mg/dl;
Darah lengkap : sampai dengan 120 mg/dl

Modul Praktikum Biokimia - Jurusan Kimia - FMIPA Unila Semester Genap 2021-2022 3
Laboratorium Biokimia

ANAK : sampai dengan 120 mg/dl

LANSIA : Serum dan plasma : sampai dengan 160 mg/dl;
Darah lengkap : sampai dengan 140 mg/dl.

Peningkatan kadar glukosa darah (hyperglycaemia) : diabetes mellitus, asidosis diabetik,

hiperaktivitas kelenjar adrenal (sindrom Chusing), akromegali, hipertiroidisme,
kegemukan (obesitas), feokromositoma, penyakit hati yang parah, reaksi stress akut (fisik
atau emosi), syok, kejang, MCI akut, cedera tabrakan, luka bakar, infeksi, gagal ginjal,
hipotermia aktifitas, pankreatitis akut, kanker pankreas, CHF, sindrom pasca gastrektomi
(dumping syndrome), pembedahan mayor. Pengaruh obat : ACTH; kortison; diuretik
(hidroklorotiazid, furosemid, asam etakrinat); obat anestesi, levodopa.

Penurunan kadar glukosa darah (hypoglycaemia) : reaksi hipoglikemik (insulin berlebih),

hipofungsi korteks adrenal (penyakit Addison), hipopituitarisme, galaktosemia,
pembentukan insulin ektopik oleh tumor/kanker (lambung, hati, paru-paru), malnutrisi,
ingesti alkohol akut, penyakit hati yang berat, sirosis hati, beberapa penyakit penimbunan
glikogen, hipoglikemia fungsional (aktifitas berat), intoleransi fruktosa herediter,
eritroblastosis fetalis, hiperinsulinisme. Pengaruh obat : insulin yang berlebih, salisilat,
obat antituberkulosis.

Faktor yang dapat mempengaruhi hasil laboratorium

 Obat-obatan (kortison, tiazid, “loop” diuretik) dapat menyebabkan peningkatan
kadar gula darah.
 Trauma, stress dapat menyebabkan peningkatan kadar gula darah.
 Penundan pemeriksaan serum dapat menyebabkan penurunan kadar gula darah.
 Merokok dapat meningkatkan kadar gula darah serum.
 Aktifitas yang berat sebelum uji laboratorium dilakukan dapat menurunkan kadar
gula darah.

Darah mengandung sel darah merah, sel darah putih, protein dan glukosa yang terlarut
dalam plasma darah. Untuk menetukan kadar glukosa dalam darah, maka sampel harus
diberi perlakuan khusus. Protein harus diendapkan terlebih dahuluagar tidak dapat
mengganggu analisis darah. Sampel darah kemudian dipanaskan dengan larutan Cu 2+
dalam suasana basa. Glukosa mempunyai gugus aldehid bebas yang dalam larutan berada
dalam bentuk setimbang dalam bentuk enediol. Pada suasana basa bentuk enediol
dominan dan mereduksi ion kupri (Cu 2+). Cu2O yang terbentuk kemudian direaksikan
dengan asam fosfomolibdat yangbakan memerikan warna biru (molybdenum blue).
Intensitas warna diukur pada panjang gelombang nm. Konsentrasi glukosa darah dapat
ditentukan dengan kurva standar.

PROSEDUR KERJA

A. Pembuatan Pereaksi
1. Larutan Ba(OH)2 0,3 N
2. Larutan ZnSO4.7H2O 5 %
3. Larutan standar glukosa 1,00 mg/ml

Modul Praktikum Biokimia - Jurusan Kimia - FMIPA Unila Semester Genap 2021-2022 4
Laboratorium Biokimia

4. Reagen warna arsenomolibdat. Larutkan 500 g ammonium molibdat dalam 90

mL H2O dan tambahkan 4,2 mL H2SO4 pekat, aduk dan dinginkan (Larutan I).
Larutkan 0,6 g Na2HAsO4.7H2O dalam 5 mL H2O dan campurkan dengan Larutan I.
Larutan (berwarna kuning bening) disimpan dalam botol coklat dan diinkubasi
selama 24 - 48 jam pada suhu 37oC dan kemudian disimpan dalam lemari es.
5. Larutan Nelson A : Larutkan 1,5 g Rocelle: 3 g Na 2CO3 anhidrat 2 g NaHCO3 dan
18 g Na2SO4 anhidrat dalam air sambil diaduk dan kemudian diencerkan hingga
100 mL
6. Larutan Nelsom B: Larutkan 2 g CuSO4.5H2O dalam air dan tambahkan 18 g
Na2SO4 anhidrat. Kemudian aduk sampai semua larut. Tambahkan 1-2 tetes
H2SO4 pekat dan encerkan hingga 100 mL
7. Larutan Cu alkalis : Campurkan 4 volume Larutan Nelson A dan 1 volume Larutan
Nelson B, aduk sampai semua bercampur.

B. Pembuatan Filtrat Darah Bebas Protein

1. Masukkan 0,1 mL darah yang axalated ke dalam tabung tabung sentrifuga yang
telah diisi dengan 1,90 mL H2O, campurkan dengan baik.
2. Tambahkan 1,5 mL Ba(OH)2 0,3 N, aduk dengan baik
3. Tambahkan 1,5 mL ZnSO4 5% , campur dengan baik
4. Biarkan selama 3 menit, kemudian sentrifugasi selama 20 menit.
5. Cairan bening hasil sentrifugasi digunakan untuk analisis lebih lanjut.

C. Penentuan Kadar Glukosa Darah

1. Pipet 1,0 mL filtrat darah bebas protein ke dalam tabung reaksi dan tambahkan
1,0 mL larutan Cu alkalis,.
2. Inkubasi dalam air mendidih selama 20 menit kemudian pindahkan tabung
kedalam air dingin.
3. Tambahkan 1,0 mL reagen warna arsenomolibdat, aduk dengan baik.
4. Tambahkan 7,0 mL H2O, aduk dengan baik
5. Baca absorbansi dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 660 nm.
6. Tentukan serapan blanko dengan cara yang sama
7. Tentukan serapan standar yang masing-masing berisi 0,001; 0,005; 0,02; 0,04;
0,06; 0,08; dan 0,1 mg/mL glukosa.

PERTANYAAN
1. Buat kurva standar glukosa
2. Hitung kadar glukosa darah dalam mg glukosa/mL sampel darah yang dianalisis

TUGAS PENDAHULUAN
1. Jelaskan mengapa glukosa merupakan sumber energi bagi sel !
2. Jelaskan mengapa seorang penderita penyakit diabetes diobati dengan insulin !
3. Tuliskan reaksi – reaksi yang terjadi pada penentuan kadar glukosa darah yang
dilakukan dalam percobaan ini !

Modul Praktikum Biokimia - Jurusan Kimia - FMIPA Unila Semester Genap 2021-2022 5
Laboratorium Biokimia

11. Penentuan Kolesterol dalam Serum

PENDAHULUAN

Kolesterol tidak larut dalam cairan darah, untuk itu agar dapat dikirim ke seluruh tubuh
perlu dikemas bersama protein menjadi partikel yang disebut Lipoprotein, sebagai
‘pembawa’ (carier) kolesterol dalam darah. Kolesterol dihasilkan tubuh 80% (organ hati)
dan 20% dari luar tubuh untuk bermacam-macam fungsi di dalam tubuh, antara lain
membentuk dinding sel. Informasi mengenai lemak utama dalam darah yakni total
kolesterol yang terdiri dari kolesterol LDL, HDL, dan trigliserida.

Total Kolesterol
Total kolesterol menunjukkan jumlah antara HDL kolesterol, LDL kolesterol, dan
trigliserida normal adalah 140-250 mg/dl.

HDL Kolesterol (hight density lipoprotein)

HDL merupakan kolesterol baik dalam darah untuk membawa kolesterol menuju hati dan
diproses lebih lanjut guna menghindari terjadinya penumpukan kolesterol pada saluran
darah. Kadar HDL normal adalah <40 mg/dL (1,04 mmol/L) - >60 mg/dL (1,56 mmol/L).

LDL Kolesterol (low density lipoprotein)

Kadar LDL merupakan kolesterol jahat dalam darah yang menyebabkan penyempitan
pembuluh darah.
<100 mg/dL (2,6 mmol/L) Optimal
100-129 mg/dL (2,6-3,34 mmol/L) Mendekati optimal
130-159 mg/dL (3,34-4,13 mmol/L) Batas normal tertinggi
160-189 mg/dL (4,14-4,90 mmol/L) Tinggi
> 190 mg/dL (4,91 mmol/L) Sangat tinggi

Trigliserida
< 150 mg/dL (1,69 mmol/L) Normal
150-199 mg/dL (1,69-2,25 mmol/L) Batas normal tertinggi
200-499 mg/dL (2,26-2,65 mmol/L) Tinggi
>500 mg/dL (5,64 mmol/L) Sangat tinggi

Penentuan kolesterol pada percobaan ini dilakukan dengan mengekstraksi kolesterol dari
serum dengan menggunakan etanol. Ekstrak kolesterol kemudian direaksikan dengan
larutan FeCl3 dalam asam fosfat yang akan menghasilkan kompleks berwarna merah.

Modul Praktikum Biokimia - Jurusan Kimia - FMIPA Unila Semester Genap 2021-2022 6
Laboratorium Biokimia

PROSEDUR KERJA

A. Pembuatan Pereaksi

1. Larutan standar kolesterol 0,1 mg/mL (larutan stok kolesterol)

2. Larutan kerja kolesterol : tambahkan 2 mL larutan stok kolesterol dengan 98 mL
etanol absolut. Buat segar setiap hari. Simpan di lemari pendingin.
3. Larutan stok besi : Larutkan 5 g FeCl3.6H2O dalam 200 mL H3PO4 pekat.
4. Reagen warna : larutan 40 mL larutan stok besi dalam 500 mL H2SO4 pekat.

B. Pembuatan Serum Darah

1. Diamkan sampel darah selama 1 jam atau lebih

2. Sentrifius sampel selama 10 menit
3. Dengan hati-hati pisahkan serum (tidak berwarna) dengan menggunakan pipet.

C. Penentuan Kadar Kolesterol dan Serum

1. Masukkan 0,1 mL serum darah ke dalam tabung reaksi. Tambahkan 10 mL etanol
absolut, kocok hingga tercampur dengan baik.
2. Sentrifius tabung selama 5 menit, dan pindahkan ekstrak (dengan hati-hati) ke
dalam tabung reaksi yang baru. Siapkan 2 mL ekstrak untuk penentuan kadar
kolesterol dalam serum. Jika terlihat adanya endapan pada tabung, lakukan
sentrifigasi sekali lagi.
3. Sebagai standar, siapkan 2 mL larutan standar kolesterol 0,02 mg/mL pada
tabung yang lain.
4. Sebagai blanko, gunakan 2 mL etanol sebagai pengganti kolesterol.
5. Dengan perlahan-lahan tambahkan 2 mL “reagen warna” pada masing-masing
tabung dan campurkan dengan baik (hati-hati, reagen yang digunakan adalah
asam kuat).
6. Tutup tabung reaksi dengan parafilm dan diamkan pada temperatur kamar
selama 30 menit. Warna yang terbentuk; stabil dalam waktu 1 jam.
7. Baca absorbansi larutan dalam masing-masing tabung pada panjang gelombang
550 nm.
8. Hitung kadar kolesterol [A550nm sampel : A550nm standar x konsentrasi standar x
100].

TUGAS PENDAHULUAN
1. Bagaimana proses kolesterol LDL dapat menyebabkan penyempitan pembuluh
darah?
2. Jelaskan hubungan antara HDL dengan LDL dalam darah?
3. Sebutkan contoh makanan yang dapat;
a) menurunkan kadar LDL dan menaikkan kadar HDL
b) menaikkan jumlah LDL dan HDL dengan kekuatan seimbang
c) menaikkan jumlah LDL dan menurunkan jumlah HDL

Modul Praktikum Biokimia - Jurusan Kimia - FMIPA Unila Semester Genap 2021-2022 7
Laboratorium Biokimia

12. Penentuan Protein dalam Urin

TUJUAN

Memahami cara menentukan protein dalam urin

PENDAHULUAN

Proteinuria adalah suatu kondisi di mana sejumlah protein terdapat dalam urin. Yang
paling banyak didapatkan adalah protein serum albumin, di mana albumin merupakan
protein serum yang paling banyak terdapat dan mempunyai berat molekul terkecil,
sehingga mempunyai kemungkinan besar berdifusi melalui membran. Protein lain yang
mungkin didapatkan dalam urin adalah globulin. Ekskresi normal dari total protein adalah
0,02-0,075 g protein per hari (jam). Dari kadar tersebut, 90-100% adalah protein albumin
dan 0-10% globulin.

Total protein ditentukan menurut reaksi biuret. Sebelum ditambahkan reagen biuret,
protein dalam urin diendapkan dengan penambahan trichloroacetic acid (TCA). Pellet
protein kemudian diresuspensi dalam alkali (3% NaOH). Lakukan prosedur percobaan
menurut protokol seperti di bawah ini:

PROSEDUR KERJA

Tabung ke-
Penambahan (mL)
1 2 3 4 5 6 7 8
BSA (2 mg/mL) 0,1 0,2 0,3 0,4 - - - -
Urin - - - - 20 20 20 20
H2O 20 19,9 19,8 19,7 19,6 - - -
TCA 50% 2 2 2 2 2 2 2 2
Campurkan dengan baik, letakkan dalam es selama 3 menit,
sentrifius selama 5 menit. Pisahkan supernatant, resuspensi
masing-masing pellet dalam 1,5 mL NaOH 3%. Homogenkan.
Reagen Biuret 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5
o
Inkubasi pada 37 C selama 15 menit dan tentukan A540.

Hitung jumlah protein per mL urin dengan membandingkan A540nm sampel dengan kurva
standar. Konversikan hasil dalam satuan g/hari.

Modul Praktikum Biokimia - Jurusan Kimia - FMIPA Unila Semester Genap 2021-2022 8
Laboratorium Biokimia

13. Fermentasi dan Sintesis Asam Laktat sebagai Bahan Baku Plastik
Biodegradable

Penggunaan bahan plastik dalam kehidupan manusia tidak hanya memberikan

kemudahan tetapi juga meninggalkan efek lingkungan yang cukup mengkhawatirkan
karena sulitnya sampah plastik didegradasi. Saat ini telah dikembangkan plastik
biodegradable (bioplastik), yaitu jenis plastik yang bisa terurai oleh aktivitas
mikroorganisme menjadi air dan karbondioksida di alam sehingga dengan demikian jenis
plastik ini tidak akan tertimbun dan mencemari lingkungan. Sintesis secara biologis
menggunakan mikrooorganisme tertentu merupakan salah satu cara untuk memperoleh
sumber-sumber bahan baku material yang dapat diperbaharui sebagai produk yang
bersahabat dengan lingkungan.

PLA (polylactic acid) atau poli asam laktat adalah polimer dari senyawa asam laktat yang
dibuat dari bahan alami terbarukan melalui proses fermentasi karbohidrat dan
polimerisasi secara kimia. Struktur PLA dapat dilihat pada Gambar 1.

Gambar 1. Struktur Poli Asam Laktat

Monomer dari PLA adalah senyawa asam laktat atau asam -hidroksi propionat
merupakan salah satu asam organik yang dapat dihasilkan melalui sintesis kimia dan
sintesis secara mikroobiologis dengan mikoorganisme tertentu melalui proses fermentasi.
Asam laktat mempunyai rumus kimia C3H6O3 dengan rumus molekul CH3CHOHCOOH.
Asam laktat dalam larutan akan kehilangan satu proton dari gugus asam dan
menghasilkan ion laktat CH3CH(OH)COO-. Penggunaan asam laktat amat luas mencakup
industri makanan, minuman, farmasi, kosmetik, dan kimia. Selanjutnya untuk membentuk
poli asam laktat, melalui polimerisasi kimia asam laktat dapat dihasilkan PLA, yang
merupakan biodegradable plastik yang saat ini banyak digunakan sebagai biomedikal
seperti surgical implant, drug delivery system, dan artificial scaffold matterials.

Bakteri asam laktat (BAL) adalah sebutan bagi bakteri yang dapat
memfermentasikan karbohidrat untuk menghasilkan asam laktat. Berdasarkan taksonomi,
terdapat sekitar 20 genus bakteri yang termasuk BAL. BAL adalah kelompok bakteri gram-
positif yang tidak membentuk spora. Beberapa BAL yang sering digunakan adalah
Aerococcus, Bifidobacterium, Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus,
Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus,
dan Weissella. Dalam pengolahan makanan, BAL dapat melindungi dari pencemaran
bakteri patogen, meningkatkan nutrisi, dan berpotensi memberikan dampak positif bagi

Modul Praktikum Biokimia - Jurusan Kimia - FMIPA Unila Semester Genap 2021-2022 9
Laboratorium Biokimia

kesehatan manusia biasa disebut sebagai asam susu adalah salah bahan kimia yang
berperan penting dalam industri biokimia. Contoh produk makanan yang dibuat
menggunakan bantuan BAL adalah yogurt, keju, mentega, sour cream (susu asam), dan
produk fermentasi lainnya.

Fermentasi asam laktat merupakan sebuah tahapan respirasi anaerob yang menghasilkan
asam laktat sebagai produk akhir. Bahan dasar atau utama dari proses fermentasi asam
laktat adalah glukosa yang dibantu dengan enzim. Reaksi pembentukan asam laktat pada
proses fermentasi dapat dituliskan sebagai berikut:

C6H12O6 + enzim → 2C2H5OCOOH + energi (ATP)

Tugas Pendahuluan
1. Gambarkan jalur metabolisme sintesis asam laktat!
2. Jelaskan perbedaan fermentasi asam laktat secara homofermentatif dan
heterofermentatif
3. Bagaimana proses polimerisasi asam laktat membentuk PLA? Jelaskan!

Prosedur Percobaan

Pembuatan Inokulum BAL

BAL biasanya ditumbuhkan pada media de Mann Rogose and Sharpe (MRS). Media MRS
merupakan media spesifik untuk pertumbuhan bakteri asam laktat. Komposisi MRS-broth
: 10 gram kasein / daging pepton, 8 gram ekstrak daging, 4 gram ekstrak ragi, 20 gram
D(+)-glukosa, 2 gram diPotasium hidrogen fosfat, 1 ml tween 80, 2 gram di-amonium
hidrogen sitrate, 5 gram sodium asetat, 0,2 gram magnesium sulfat, 0,04 gram mangan
sulfat.

Sebanyak satu ose isolat bakteri diinokulasikan ke dalam 100 ml media MRS-broth steril
secara aseptis, lalu diinkubasi pada suhu kamar selama 24 jam dan dikocok 200 rpm.
Setelah waktu inkubasi selesai kemudian dilakukan pemisahan antara filtrat dan suspensi
sel dengan menggunakan centrifuge dengan putaran 10000 rpm selama 5 menit pada
suhu 25°C. Suspensi sel digunakan untuk proses selanjutnya yaitu fermentasi.

Fermentasi Asam Laktat

25% (%v/v) dari suspensi sel dipindahkan ke 500 ml reaktor yang berisi medium MRS-
broth baru dengan konsentrasi glukosa 40 g/L untuk membentuk 200 ml volume akhir.
Proses fermentasi dilakukan dalam kondisi anaerobik pada suhu kamar dan kecepatan
pengadukan 200 rpm selama 24 jam. Hasil fermentasi asam laktat dianalisis dengan
metode titrimetri.

Penentuan Kadar Asam Laktat dengan Metode Titrimetri

Penentuan kadar asam laktat dilakukan berdasarkan metode titrasi dengan menggunakan
NaOH 0,1 N 1 ml. Sebanyak 1 ml sampel diencerkan dengan akuadest hingga mencapai
volume 20 ml, kemudian ditambahkan 5 tetes phenophtalein ke dalam sampel yang telah

Modul Praktikum Biokimia - Jurusan Kimia - FMIPA Unila Semester Genap 2021-2022 10
Laboratorium Biokimia

diencerkan. Larutan ini selanjutnya dititrasi dengan larutan NaoH 0,1 N. Kadar asam laktat
dihitung dengan rumus:

Kadar asam laktat (%) = ml NaOH X Normalitas NaOH X 9 ml sampel

Modul Praktikum Biokimia - Jurusan Kimia - FMIPA Unila Semester Genap 2021-2022 11
Laboratorium Biokimia

DAFTAR PUSTAKA

Fuwa, H. 1954. A new method for microdetermination of amylase activity by the use of
amylase as the subtrate. J. eBiochem. Tokyo.

Judoamijojo, R. M., S. E. Gumbira, L. Hartato. 1989. Biokonversi. Departemen

Pendidikan dan Kebudayaan. Dirjen Dikti, PAU Bioteknologi IPB.

Lehninger, A. L. 1982. Dasar-Dasar Biokimia. Jilid 1. Alih bahasa oleh Maggi

Thenawidjaya. Jakarta. Erlangga.

Lowry, O. H., N. J., Rosebrough, A. L., Farr, and R. J. Randall. 1951. Protein measurement
with the folin phenol reagent. J. Biol. Chem.

Mandels, et. al. 1990. Measurement of saccharifying cellulose. Biotech and Bioeng. Symp.
John Wiley and Sons Inc.

Martoharsono, S. dkk. 1981. Biokimia. UGM Press.

Murray, R.K. 2003. Biokimia Harper. Buku Kedokteran. EGC Press. Suhartono. M.T.
1989. Enzim dan Bioteknologi. PAU. Bioteknologi ITB. Bandung.

Page, D. S. 1989. Prinsip-Prinsip Biokimia. Erlangga. Jakarta. Poenjiadi, A. 1994. Dasar-

dasar Biokimia. Jakarta. UI-Press.

Watson. J. D. 1987. Molecular Biloogy of the Gene. CSHL Press. USA.

Wirahadikusumah, M. 1977. Biokimia protein, Enzim, dan asam Nukleat. ITB. Bandung.

Wolfe, S.L. 1993. Molecular and Cellular Biology. Wadsworth Publishing Company.
California.

Yandri, A.S. 2004. Karakterisasi dan Modifikasi Kimia α-amilase dari Bakteri Isolat Lokal
Bacillus subtilis ITBCCB148 Dengan Modifikasi Kimia Menggunakan Dimetiladipimidat.
(Disertasi). Institut Teknologi Bandung. Bandung.

Yandri, A.S., Tati S., and Hadi, S. 2010. Purification and characterization of extracellular
α-amilase enzyme from locale bacteria isolate Bacillus subtilis ITBCCB148. European
Journal of Scientific Research.

Modul Praktikum Biokimia - Jurusan Kimia - FMIPA Unila Semester Genap 2021-2022 12
Laboratorium Biokimia

Nandini, dkk. 2021. Skrining Bakteri Lactobacillus dan Weisella untuk Produksi Asam
Laktat dengan Metode Fermentasi Batch. Akta Kimia Indonesia. Vol. 6(2), 127-135.

Indrarti, dkk. 2005. Biosintesis Asam Laktat sebagai Bahan Baku Plastik Plastik
Biodegradable. Prosiding Simposium Nasional Polimer V. ISSN 1410-8720.

Modul Praktikum Biokimia - Jurusan Kimia - FMIPA Unila Semester Genap 2021-2022 13