MAKALAH MIKROBIOLOGI

“MIKROSKOP DAN METODE MIKROBIOLOGI’’

DISUSUN OLEH:
1. MOHAMMAD AFFAN A AMIRUDIN (G70118165)
2. QOFIFAH (G70118013)
3. TIARA BELLINDA GRANDISYA (G70118110)

JURUSAN FARMASI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS TADULAKO
PALU
2020
 KATA PENGANTAR
Puji syukur kami panjatkan kehadirat Tuhan Yang Maha Esa karena dengan
rahmat, karunia, serta taufik dan hidayah-Nya kami dapat menyelesaikan makalah
tentang “Mikroskop danMetode Mikrobiologi” ini dengan baik meskipun banyak
kekurangan didalamnya. Dan juga kami berterima kasih kepada Ibu Arsa Wahyu
Nugrahani,S.Farm.,M.Sc.,Apt selaku Dosen mata kuliah Mikrobiologi Jurusan
Farmasi Universitas Tadulako yang telah memberikan tugas ini kepada kami.
Harapan kami semoga makalah ini dapat menambah pengetahuan dan
pengalaman bagi para pembaca, Untuk ke depannya dapat memperbaiki bentuk
maupun menambah isi makalah agar menjadi lebih baik lagi.
Kami juga menyadari sepenuhnya bahwa dalam makalah ini terdapat
kekurangan dan jauh dari kata sempurna. Oleh sebab itu, kami berharap adanya
kritik, saran dan usulan dari pembaca demi kesempurnaan makalah ini.

Palu, 05 Februari 2019

Penyusun
Kelompok XII
 DAFTAR ISI

SAMPUL...................................................................................................................
KATA PENGANTAR.............................................................................................
DAFTAR ISI............................................................................................................
BAB I PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang....................................................................................................
1.2 Tujuan..................................................................................................................
1.3 Manfaat...............................................................................................................
BAB II ISI
2.1 PengertianMikroskop Dan Mikroskopis………..................................................
2.2 Reagen Pewarnaan Mikroskop.............................................................................
2.3 Pewarnaan Sederhana……...................................................................................
2.4 Pewarnaan Negatif…….......................................................................................
2.5 Pewarnan Diferensiasi; Pewarnaan gram; Asam,Kapsul,Spora Dan Flagel……

BAB III PENUTUP

3.1 Kesimpulan........................................................................................
3.2 Saran..................................................................................................
DAFTAR PUSTAKA...........................................................................
 BAB I
PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Dalam kehidupan, makhluk hidup saling berinteraksi dengan
lingkungannya. Diantara mahkluk hidup tersebut ada yang tampak kasat mata atau
dapat dilihat langsung dan tidak kasat mata atau memerlukan bantuan alat untuk
melihatnya. Mahkluk tidak kasat mata disebut dengan mikroorganisme atau
mikroba. Mikroorganisme ini dipelajari dalam cabang ilmu biologi yang disebut
mikroobiologi yaitu ilmu pengetahuan mengenai organisme hidup yang berukuran
sangat kecil sehingga tidak dapat dilihat dengan mata telanjang
Kini mikroorganisme digunakan oleh para ahli dengan penelaahan hampir
semua gejala biologis yang utama. Mikroba terdapat dalam jumlah yang besar dan
beranekaragam serta kosmopolitan di alam ini (Ristiati, 2000). Mikroba merupakan
bentuk kehidupan yang tersebar paling luas dan terdapat paling banyak di
bumi. Mikroorganisme terdiri dari 5 kelompok organisme, yaitu bakteri, protozoa,
virus, algae, dan cendawan. Beberapa diantaranya bermanfaat dan yang lain
merugikan.
Alat yang di gunakan adalah mikroskop dan keahlian dalam menggunakan
mikroskop ini dinamakan mikroskopi. Mikroskop sangat membantu dalam meneliti
mikroba – mikroba yang tidak kasat mata. Salah satu penemu sejarah mikrobiologi
dengan mikroskop adalah Antony van Leeuwenhoek (1632-1723), tahun 1675
Antony membuat mikroskop dengan kualitas lensa yang cukup baik dengan
menumpuk lebih banyak lensa sehingga ia bisa mengamati mikroorganisme yang
terdapat pada air hujan yang menggenang .
Dalam perkembangannya mikroskop mampu mempelajari organisme
hidup yang sangat kecil yang tidak dapat dilihat dengan mata telanjang, sehingga
mikroskop memberikan konstribusi penting dalam penemuan mikroorganisme dan
pengembangan sejarah mikrobiologi. Dalam mempelajari mikroorganisme
diperlukan dan keahlian khusus untuk dapat menggunakan mikroskop dengan
benar dalam mengamati objek tersebut. Sementara itu, pengetahuan mahasiswa
tentang mikroskop dan metode mikroskopinya masih kurang memadai.
Oleh karena itu penulis merasa perlu untuk membahas lebih lanjut mengenai
alat dan metode mikroskopik yang penulis buat dalam bentuk makalah yang
berjudul “Mikroskop dan Metode Mikrobiologi”.
1.2 Rumusan Masalah
Berdasarkan penjabaran diatas, Maka dapat dirumuskan beberapa permasalahan
sebagai berikut:
1. PengertianMikroskop Dan Metode Mikrobiologi
2. Reagen Pewarnaan Mikroskop
3. Pewarnaan Sederhana
4. Pewarnaan Negatif
5. Pewarnan Diferensiasi; Pewarnaan gram; Asam,Kapsul,Spora Dan Flagel

1.3 Tujuan Penulisan

Adapun tujuan dari penulisan makalah ini yang mengacu pada rumusan
masalah di atas adalah sebagai berikut:
1. Untuk mengetahui PengertianMikroskop Dan Mikroskopis
2. Untuk mengetahui Reagen Pewarnaan Mikroskop
3. Untuk mengetahui Pewarnaan Sederhana
4. Untuk mengetahui Pewarnaan Negatif
5. Untuk mengetahui Pewarnan Diferensiasi; Pewarnaan gram;
Asam,Kapsul,Spora Dan Flagel

1.4 Manfaat penulisan

Dari penulisan makalah ini diharapkan dapat diperoleh beberapa manfaat
antara lain:
1. Sebagai bahan kajian yang dapat memberikan informasi penting mengenai
Mikroskop Dan Mikrobiologi
2. Bagi pelajar atau mahasiswa dapat menerapkan pengetahuan tentang
Mikroskop Dan Mikrobiologi
3. Bagi para Dosen diharapkan makalah ini dapat digunakan sebagai bahan
acuan bagi para Dosen untuk mengajarkan Tugas Mikrobiologi pada materi
yang berhubungan dengan penggunaan Mikroskop Dan Metode
Mikrobiologi
 BAB II
PEMBAHASAN

2.1 Pengertian Mikroskop dan Mikroskopis

Mikroskop merupakan instrument yang paling banyak digunakan dan juga
paling bermanfaat di laboratorium. Mikroskop adalah alat yang menggunakan lensa
untuk mendapatkan gambar yang diperbesar dari obyek yang terlalu kecil untuk
dapat dilihat dengan mata telanjang. Mikroskop memungkinkan pembesaran dalam
kisaran luas dari seratus kali sampai ribuan kali.
Mikroskop yang umum digunakan dalam mikrobiologi biasanya dilengkapi
dengan tiga lensa objektif, masing-masing lensa memberikan derajat pembesaran
yang berlainan, yang terpancang pada turret yaitu suatu alas (platform) yang dapat
diputar untuk menggerakkan masing-masing objektif sehingga letaknya segaris
dengan kondensor. Pembesaran total yang dapat dicapai dengan salah satu objektif
manapun ditentukan dengan mengalikan daya pembesaran lensa objektif dengan
daya pembesaran lensa mata, yang biasanya 10 kali.
Mikroskopi merupakan keahlian dalam menggunakan mikroskop,
atau teknik yang digunakan untuk menghasilkan detail struktur gambar dari obyek
kecil yang tidak dapat dilihat dengan mata telanjang.

2.2 Jenis – jenis Mikroskop Yang Digunakan Dalam Pengamatan

Mikroorganisme
Mikroskop secara garis besar dapat dikelompokkan menjadi dua kelompok
besar yaitu mikroskop cahaya dan mikroskop elektron. Perbedaan dari kedua
mikroskop tersebut adalah pada Mikroskop cahaya menggunakan gelombang
cahaya untuk memperoleh bayangan yang diperbesar sedangkan pada mikroskop
elektron menggunakan listrik sebagai sumber cahaya yang mampu melakukan
pembesaran objek sampai 2 juta kali, yang menggunakan elektro statik dan elektro
magnetik untuk mengontrol pencahayaan dan tampilan gambar serta memiliki
kemampuan pembesaran objek serta resolusi yang jauh lebih bagus
daripada mikroskop cahaya.
1. Mikroskop Cahaya
Mikroskop cahaya merupakan mikroskop yang kesemuanya menggunakan
sistem lensa optis. Daya pisah suatu mikroskop cahaya ditentukan oleh panjang
gelombang cahaya dan sifat lensa objektif dan lensa kondensor yang dikenal dengan
apertur numerik (numerical aperture). Lensa objektif memperbesar gambaran objek
biasanya 4-100 kali dan lensa okuler umumnya memperbesar gambaran semu tidak
 lebih dari 10-15 kali. Yang memberikan perbesaran permulaan adalah sistem lensa
objektif kemudian diperbesar lagi oleh sistem lensa okuler. Perbesaran total
ditentukan dengan mengalikan perbesaran lensa objektif dengan daya perbesaran
lensa mata (okuler).
Mikroskop cahaya mencakup mikroskop medan terang, medan gelap,
fluoresensi dan fase kontras. Mikroskop elektron menggunakan berkas elektron
sebagai pengganti gelombang cahaya untuk memperoleh bayangan yang
diperbesar.
a. Mikroskop Medan Terang
Dalam mikroskop medan terang, medan mikroskop atau daerah yang
diamati diterangi dengan benderang sehingga objek-objek yang sedang ditelaah
tampak lebih gelap dari pada latar belakangnya. Pada umumnya mikroskop
semacam ini menghasilkan pembesaran maksimum sekitar 1.000 diameter. Dengan
sedikit modifikasi termasuk lensa mata (okuler) yang berkekuatan tinggi,
pembesaran ini dapat ditingkatkan. Akan tetapi pembesaran 1.000 sampai 2.000
diameter merupakan batas pembesaran bermanfaat yang dapat diperoleh dengan
peralatan seperti itu. Mikroskop majemuk, pembesaran dicapai dengan
menggunakan sistem lensa berlawanan dengan mikroskop sederhana
Leeuwenhoek, yang hanya mengguanakan lensa tunggal, dimana lensa terdapat
pada kondensor memusatkan kerucut cahaya pada medan spesimen.
Mikroskop medan terang digunakan untuk memperbesar gambaran objek
yang diuji, untuk menentukan ukuran, susunan karakteristik, dan motilitas bakteri
dan mikroba lain di lingkungan alami. Pada mikroskop ini, medan mikroskop atau
daerah yang diamati diterangi sehingga objek yang sedang diamati tampak lebih
gelap dari latar belakangnya. Perbesaran terbatas pada daya pisah suatu mikroskop
yaitu kemampuannya untuk menghasilkan bayangan berlainan dari dua objek yang
berdekatan.
b. Mikroskop Medan Gelap
Mikroskop medan gelap adalah mikroskop yang hampir sama dengan
mikroskop mdan terang namun pada mikroskop medan gelap dilengkapi dengan
kondensor.Mikroskop medan gelap digunakan untuk melihat spirochaeta
seperti Treponema (penyebab sifilis) Leptospira (leptospirosis).
Mikroskop ini mempunyai kondensor yang mencegah cahaya
ditransmisikan melalui bahan, tapi sebaliknya menyebabkan cahaya merefleksikan
bahan pada sudut tertentu, sehingga objek kelihatan lebih besar bersinar dengan
latar belakang yang gelap. Dengan menahan sebagian berkas cahaya yang masuk
ke dalam kondensor, cincin medan gelap hanya melewatkan berkas cahaya yang
 mengenai objek pada slide spesimen agar memasuki objektif. Karena itu objeknya
(mikroba) menjadi diterangi dalam medan mikroskopik yang seharusnya
gelap. Mikroskop medan gelap terutama berguna untuk pemeriksaan
mikroorganisme hidup. Teknik ini sangat berguna bagi identifikasi bakteri yang
menyebabkan sifilis.
Mikroskop medan gelap biasanya digunakan untuk mengamati bakteri
hidup khususnya bakteri yang begitu tipis yang hampir mendekati batas daya
mikroskop majemuk. Mikroskop medan gelap berbeda dengan mikroskop cahaya
majemuk biasa hanya dalam hal adanya kondensor khusus yang dapat membentuk
kerucut hampa berkas cahaya yang dapat dilihat. Berkas cahaya dari kerucut hampa
ini dipantulkan dengan sudut yang lebih kecil dari bagian atas gelas preparat. (Volk,
Wheeler, 1988)
c. Mikroskop Fluoresensi
Mikroskop Fluoresensi sering dipakai di laboratorium rumah sakit dan
klinis. Mikroskop ini digunakan untuk memeriksa spesimen yang telah diwarnai
dengan zat-zat pewarna Fluorokrom sehingga memungkinkan identifikasi
mikroorganisme dengan cepat. Bahan seperti itu dinamakan Fluoresen dan
fenomena ini dinamakan Mikroskop Fluorescensi (pendar fluor). Mikroskop ini
banyak digunakan dalam mikrobiolgi dan imunologi, dan telah dikembangkan
untuk mendeteksi antigen mikroba pada bahan pemeriksaan dengan jalan
mewarnainya dengan antibodi spesifik yang telah diberi tanda/label dengan zat
warna fluoresen (immunofluorescence).
Mikroskop fluoresensi digunakan untuk melihat spesimen yg sukar diamati
karena ukurannya kecil. Spesimen akan menghasilkan cahaya berpendar.
Mikroskop ini digunakan dalam prosedur diagnostik yg disebut fluoroscent
antibody tecnique. Melalui FM mikroorganisme yang menyerang jaringan dapat
segera dideteksi.
• Prinsip kerja:
· Langkah pertama yg dilakukan adalah memberi warna flurochrome auramine o.
· Untuk menghasilkan pencahayaan digunakan sinar UV atau sinar yang panjang
gelombangnya mendekati sinar UV. Hasilnya spesimen akan mengeluarkan cahaya
(berpendar).
Contoh spesimen yang ukurannya kecil adalah Mycobacterium
tubercolosis. Agar dapat diamati diberi warna flurochrome auramine o. Obyek yang
berukuran kecil dapat terlihat karena berpendar.
d. Mikroskop Fase Kontras
 Mikroskop fase kontras digunakan untuk menambah kontras antara sel
dengan latar belakangnya, antara struktur dalam sel dengan sitoplasma. Mikroskop
fase kontras digunakan untuk melihat objek dengan indeks refraksi sinar yang
berbeda. Fase perubahan bagian dalam sistem lensa objektif mengubah sinar
sehingga ada perbedaan dalam fase antara sinar yang terdefraksi dengan sinar yang
tidak mengalami defraksi. Jika sinar yang mengalami defraksi dan tidak terdefraksi
bersama-sama lagi ada penurunan intensitas sinar, sebab adanya perbedaan fase.
Semakin kecil objek yang sangat terang, defraksi lebih besar dan objek akan terlihat
lebih gelap.
Mikroskop ini dipakai utuk mengamati dengan detail/teliti struktur internal
spesimen hidup tanpa pewarnaan.Prinsip kerja menggunakan kondensor khusus
dan lempeng pemecah cahaya. Efek yg ditimbulkan adalah derajat terang yang
berbeda.Sorotan cahaya dipisahkan dan menerangi obyek melalui jalur yang
berbeda. Cahaya yang terpecah biasanya berwarna keemasan sedang cahaya yang
tidak terpisah berwarna merah. Tampilan obyeknya menunjukkan perbedaan
struktur internal dengan sangat jelas. Demikian pula tepi selnya. Keunikan dari fase
kontras adalah munculnya pita cahaya mengelilingi sel yang dikenal dengan
sebutan halo fase.
2. Mikroskop Elektron
Mikroskop elektron adalah sebuah mikroskop yang mampu melakukan
pembesaran objek sampai 2 juta kali, yang menggunakan elektro statik dan elektro
magnetik untuk mengontrol pencahayaan dan tampilan gambar serta memiliki
kemampuan pembesaran objek serta resolusi yang jauh lebih bagus
daripada mikroskop cahaya. Mikroskop elektron ini menggunakan jauh lebih
banyak energi dan radiasi elektromagnetik yang lebih pendek dibandingkan
mikroskop cahaya.
Mikroskop elektron digunakan untuk melihat secara rinci struktur
mikroba. Lensa magnetik digunakan oleh elektron yang langsung berlawanan
dengan objek dan memfokuskan elektron yang langsung berlawanan dengan objek
yang dihasilkan pada layar atau papan fotografik. Sinar elektron mempunyai
panjang gelombang yang lebih pendek dari sinar yang terlihat atau radiasi sinar
ultraviolet. Secara teoritis batas pemisah untuk mikroskop elektron kira-kira 100
kali lebih kecil daripada batas pemisah untuk mikroskop cahaya sehingga
mikroskop elektron dapat memberikan perbesaran yang jauh lebih besar daripada
mikroskop cahaya dan memiliki daya pisah yang lebih besar. Spesimen pada
mikroskop elektron harus disiapkan sebagai suatu lapisan kering yang teramat tipis
dan dimasukkan antara kondensor magnetik dan obyektif magnetik (sistem optik
 kaca tidak digunakan pada mikroskop elektron). Bayangan yang diperbesar akan
tampak pada layar flouresen atau terekam pada film fotografik oleh kamera yang
terpasang pada instrumen tersebut.
Terdapat dua jenis mikroskop elektron yaitu:
a. TEM (Transmission Elektron Microscope)
Seorang ilmuwan dari universitas Berlin yaitu Dr. Ernst ruska membangun
mikroskop transmisi elektron (TEM) yang pertama pada tahun 1931. Untuk hasil
karyanya ini maka dunia ilmu pengetahuan menganugrahinya hadiah penghargaan
nobel dalam fisika pada tahun 1986. Mikroskop transmisi elektron (TEM) adalah
sebuah mikroskop elektron yang cara kerjanya mirip dengan cara kerja proyektor slide
dimana elektron ditembuskan ke dalam obyek pengamatan dan pengamat mengamati
hasil tembusannya pada layar. TEM digunakan untuk mempelajari struktur subselular
dan hubungan satu dengan yang lainnya. Dengan TEM, maka gambar yang dihasilkan
akan memiliki tingkat resolusi yang jauh lebih tinggi daripada mikroskop
cahaya,sehingga dapat melihat sesuatu yang memiliki ukuran 10.000 kali lebih kecil
daripada ukuran objek terkecil yang bisa terlihat di mikroskop cahaya.
Kekurangan TEM adalah persiapan sampel untuk TEM umumnya
memerlukan lebih banyak waktu dan pengalaman daripada kebanyakan teknik
karakterisasi lainnya. Sebuah spesimen TEM tebalnya harus mendekati 1000Å .Selain
itu memerlukan persiapan sampel yang lebih rumit untuk menghasilkan sebuah sampel
yang cukup tipis, yang membuat analisis TEM relatif memakan waktu dalam peletakan
sampel yang kecil. Struktur sampel juga mungkin berubah selama proses persiapan.
Bidang pandang relatif kecil, meningkatkan kemungkinan bahwa daerah dianalisis
mungkin tidak menjadi ciri khas dari seluruh sampel serta ada potensi pula sampel
rusak oleh berkas elektron.
Agar pengamat dapat mengamati preparat dengan baik, diperlukan persiapan
sediaan dengan tahap sebagai berikut :
1. Melakukan fiksasi, yang bertujuan untuk mematikan sel tanpa mengubah struktur sel
yang akan diamati. Fiksasi dapat dilakukan dengan menggunakan senyawa
glutaraldehida atau osmium tetroksida.
2. Pembuatan sayatan, yang bertujuan untuk memotong sayatan hingga setipis mungkin
agar mudah diamati di bawah mikroskop. Preparat dilapisi dengan monomer resin
melalui proses pemanasan, kemudian dilanjutkan dengan pemotongan menggunakan
mikrotom. Umumnya mata pisau mikrotom terbuat dari berlian karena berlian tersusun
dari atom karbon yang padat. Oleh karena itu, sayatan yang terbentuk lebih rapi.
Sayatan yang telah terbentuk diletakkan di atas cincin berpetak untuk diamati.
3. Pelapisan/pewarnaan, bertujuan untuk memperbesar kontras antara preparat yang
akan diamati dengan lingkungan sekitarnya. Pelapisan/pewarnaan dapat menggunakan
logam berat seperti uranium dan timbal.

b. SEM (Scanning Elektron Microscope)

Tidak diketahui secara persis siapa sebenarnya penemu Scanning Elektron
Microscope ini. Publikasi pertama kali yang mendiskripsikan teori SEM dilakukan oleh
fisikawan Jerman Dr. Max Knoll pada 1935, meskipun fisikawan jerman lainnya Dr.
Manfren Von Ardenne mengklaim dirinya telah melakukan penelitian suatu fenomena
yang kemudian disebut SEM hingga tahun 1937. Mungkin karena itu, tidak satupun
dari keduanya mendapatkan hadiah nobel untuk penemuan itu. Pada tahun 1942 tiga
orang ilmuan Amerika Dr. Valdimir Kosma Zworykin, Dr. James Hillier, dan
Dr.Snijer,benar-benar membangun sebuah mikroskop elektron metode pemindaian
(SEM) dengan resolusi hingga 50 nm atau magnifikasi 8.000 kali. Sebagai
perbandingan modern sekarang ini mempunyai resolusi hinggga 1 nm atau pembesaran
400.000 kali.
Mikroskop elektron cara ini memfokuskan sinar elektron (elektron bean) di
permukaan obyek dan mengambil gambarnya dengan mendeteksi elektron yang
muncul dari permukaan obyek. Mikroskop pemindai elektron (SEM) digunakan untuk
study detil arsitektur permukaan sel (struktur jasad renik lainnya), dan obyek diamati
secara tiga dimensi.
Cara terbentuknya gambar pada SEM berbeda dengan apa yang terjadi pada
mikroskop optik dan TEM. Pada SEM, gambar dibuat berdasarkan deteksi elektron
baru (elektron sekunder) atau elektron pantul yang muncul dari permukaan sampel
ketika permukaan sampel tersebut disinari dengan sinar elektron.Elektron sekunder
atau elektron pantul yang terdeteksi selanjutnya diperkuat sinyalnya,kemudian besar
amplitudonya ditampilkan dalam gradasi gelap terang pada layar monitor CRT
(Cathode Ray Tube). Di layar CRT inilah gambar struktur objek yang sudah diperbesar
bisa dilihat. Pada proses operasinya, SEM tidak memerlukan sampel yang
ditipiskan,sehingga bisa digunakan untuk melihat objek dari sudut pandang tiga
dimensi.
Perbedaan mendasar dari TEM dan SEM adalah pada cara bagaimana
elektron yang ditembakkan oleh pistol elektron mengenai sampel. Pada TEM, sampel
yang disiapkan sangat tipis sehingga elektron dapat menembusnya kemudian hasil dari
tembusan elektron tersebut yang diolah menjadi gambar. Sedangkan pada SEM sampel
 tidak ditembus oleh elektron sehingga hanya pendaran hasil dari tumbukan elektron
dengan sampel yang ditangkap oleh detektor dan diolah.

2.3 Metode Mikroskopik untuk Mikroskop Cahaya dan Mikroskop Elektron.

Dalam pengamatan mikroorganisme dengan menggunakan mikroskop,baik
itu dengan mikroskop cahaya maupun mikroskop elektron menggunakan metode
tertentu. Metode itu disebut dengan metode mikroskopik yang terdiri dari teknik
mikroskop cahaya dan teknik mikroskop elektron.
a. Teknik Mikroskop Cahaya
· Teknik Preparat Basah dan Tetes Gantung
Mikroba hidup umumnya dapat dilihat melalui preparat basah dan preparat tetes
gantung. Preparat basah dan tetes gantung memungkinkan pemeriksaan
organisme hidup yang tersuspensi dalam cairan untuk mengetahui motilitas atau
proses–proses pengamatan dalam keadaan utuh. Preparat basah diperoleh dengan
menaruh setetes cairan yang mengandung organisme pada kaca objek dan menutupnya
dengan kaca yang sangat tipis yang dinamakan kaca tutup.

Untuk mengurangi laju penguapan dan meniadakan aliran udara, tetesan itu
biasanya dilingkari dengan jeli petroleum atau bahan serupa sehingga antara kaca objek
dengan kaca tutup terkatup rapat. Sedangkan untuk tetes gantung tersedia kaca objek
dengan daerah cekung kedalam. Preparat basah dan tetes gantung terutama berguna
untuk pengamatan aktivitas hidup seperti motilitas dan juga pengamatan morfologi
mikroba yang dapat rusak karena perlakuaan dengan panas atau bahan kimia atau
organisme itu sulit diwarnai.

· Teknik Pewarnaan

Banyak senyawa organik berwarna (zat pewarna) digunakan untuk mewarnai

mikroorganisme untuk pemeriksaan mikroskopis. Telah dikembangkan prosedur-
prosedur pewarnaan yaitu untuk :
ü Mengamati dengan lebih baik tampang morfologi mikroorganisme secara kasar
ü Mempermudah melihat ukuran dan bentuk mikroba.
ü Mengidentifikasi struktur luar dan dalam sel mikroba
ü Mengamati reaksi sel mikroba terhadap warna yang diberikan sehingga sifat-
sifat fisik dan kimia dapat diketahui.
Zat warna yang digunakan umumnya berbentuk senyawa kimia khusus yang
akan memberikan reaksi bila mengenai bagian tubuh mikroba, karena zat warna
 tersebut berbentuk ion yang bermuatan positif dan negative. Secara kimia zat warna
digolongkan dalam:
ü Zat warna basa yang bermuatan positif dan mudah bereaksi dengan bagian-bagian
inti sel. Misalnya metilen biru dan safranin.
ü Zat warna asam yang bermuatan negatif dan mempunyai sifat mewarnai latar
belakang sel. Misalnya Na-eosinat, eosin, fuksin, dan fuksin asam.
ü Zat warna indiferen misalnya sudan III, dimetil-amid-azo-benzol.
Untuk mengamati mikroba dengan jelas dan mempelajari anatominya,
digunakan bermacam-macam teknik pewarnaan antara lain:
ü Pewarnaan sederhana
Adalah pewarnaan tunggal dengan satu zat warna basa yang memberikan
kontras yang baik antara spesimen dan latar belakangnya. Pemberian warna pada
bakteri atau jasad-jasad renik lain dengan menggunakan larutan tunggal suatu
pewarna pada lapisan tipis atau olesan yang sudah difiksasi. Lapisan tadi digenangi
dengan larutan pewarna selama jangka waktu tertentu, kemudian larutan itu dicuci
dengan air dan kaca objeknya dikeringkan dengan kertas pengisap. Biasanya sel
terwarnai secara merata, tetapi pada beberapa organisme bilamana satu warna itu
biru metilen, beberapa granula di dalam sel tampak terwarnai lebih gelap
dibandingkan dengan bagian sel lainnya

ü Pewarnaan Diferensial
Adalah pewarnaan spesimen dengan dua atau lebih zat warna basa untuk
membedakan struktur selular. Contohnya pewarnaan gram, acidfast atau tahan asam
dan giemsa. Pewarnaan gram adalah salah satu teknik pewarnaan diferensial yang
paling penting dan paling luas digunakan untuk bakteri. Dalam proses ini olesan
bakteri yang terfiksasi dikenai larutan-larutan seperti ungu kristal, larutan yodium,
alkohol dan safranin.
ü Pewarnaan Fluoresens
Adalah pewarnaan spesimen dengan warna yang berfluororesen (berpendar).
ü Pewarnaan Negatif
Adalah pewarnaan dengan zat warna asam sehingga spesimen dapat dibedakan dari
latar belakananya. Contohnya pada pewarnaan kapsula. Pewarnaan negatif dan
pewarnaan sederhana sering dikombinasikan untuk menambah kontras.
 Langkah-langkah utama dalam mempersiapkan spesimen mikroba yang
diwarnai untuk pemeriksaan mikroskopik:
· Penempatan olesan atau lapisan tipis spesimen, pada kaca objek.
· Fiksasi olesan itu pada kaca objek. Biasanya dengan pemanasan yang
menyebabkan mikroorganisme itu melekat pada kaca objek.
· pewarna tunggal (pewarnaan sederhana) atau serangkaian larutan pewarna atau
reagen (pewarnaan diferensial).
Faktor-faktor penentu keberhasilan dalam pewarnaan mikroba antara lain:
Fiksasi yang dilakukan sebelum zat warna digunakan bertujuan :
· Melekatkan sel pada gelas objek.
· Membunuh mikroba karena sel dalam keadaan mati lebih mudah diwarnai daripada
sel dalam keadaan hidup.
· Mencegah terjadinya otolisis sel (pecahnya sel karena enzim yang ada di
dalamnya).
· Merubah daya ikat zat warna.
Fiksasi dapat dilakukan secara fisik dengan pemanasan atau pengeringan secara
dingin sedangkan secara kimia dengan penambahan sabun, formalin, fenol, bouin.
ü Peluntur warna
Untuk menghilangkan warna sel yang telah diwarnai. Senyawa ini digunakan untuk
menghasilkan keadaan yang kontras pada sel mikroba sehingga dengan jelas dapat
diamati dengan mikroskop. Beberapa jenis peluntur warna antara lain:
· Peluntur zat warna asam seperti HNO3, HCl, H2SO4 dan campuran tersebut dengan
alkohol.
· Peluntur zat warna basa seperti KOH, NaOH, sabun dan garam-garam basa.
· Peluntur zat warna lemah seperti alkohol, air, minyak cengkeh, asetat dan gliserin.
· Garam dari logam berat seperti AgNO3, CuSO4
· Garam dari logam ringan seperti Na2SO4, MgSO4
ü Substrat
Berhubungan dengan kandungan utama sel terdiri dari karbohidrat, protein, lemak,
dan asam nukleat
ü Intensifikasi perwarnaan
Pewarnaan mikroba dapat dipercepat dengan penambahan mordan, meningkatkan
satu warna dan temperatur pewarnaan (600 -700 C)
ü Zat warna pembanding
Diberikan pada akhir pewarnaan dengan tujuan memberikan warna kontras pada sel
mikroba yang diwarnai yang tidak menyerap warna pemula misal metilen biru,
safranin.
 b. Teknik Mikroskop Elektron
Spesimen pada mikroskop elektron harus disiapkan sebagai suatu lapisan
kering yang teramat tipis pada layar kecil dan dimasukkan ke dalam alat itu pada
titik diantara kondensor magnetik dan obyektif magnetik (sistem optik kaca tidak
digunakan pada mikroskop elektron), sehingga spesimen untuk mikroskop elektron
transimisi biasanya difiksasi dengan zat kimia seperti glutaraldehida untuk
mencegah dekomposisi bila dikeringkan dan diiris. Sesudah spesimen difiksasi
dengan glutaraldehida dan dehidrasi dengan aseton dan alkohol, dicetak dalam
plastik untuk menjaga bentuk spesimen dan diiris tipis dengan ultramikrotom.
Banyak teknik yang telah dikembangkan untuk pemeriksaan mikroorganisme
dengan mikroskop elektron. Adapun teknik-teknik yang dikembangkan dengan
mikroskop elektron yaitu:
ü Teknik bayangan logam (metal shadowing)
Teknik bayangan logam adalah teknik SEM yang digunakan untuk memberikan
gambar tiga dimensi yang biasanya digunakan untuk mempelajari bentuk virus dan
bakteri. Spesimen dilapisi dengan logam berat seperti emas atau palladium yang
umumnya mengendap di sudut spesimen sehingga menciptakan bayangan
spesimen.
ü Teknik pemecahan beku (freeze fracture)
Teknik pemecahan beku digunakan untuk mengamati struktur organela seluler dari
membran yang biasanya digunakan untuk mengamati struktur kloroplas,
mitokondria dan membran sitoplasma. Spesimen dibekukan dengan Freon 12 suatu
refrigerator sampai -1000C kemudian diiris dalam vakum untuk memperoleh
sayatan sel dan organelanya. Spesimen dilapisi dengan platinum dan karbon untuk
memperoleh replika logam spesimennya. Hasil akhir menampakkan gambar yang
tampak pada layar.
ü Metode-metode pewarnaan baru
Metode-metode pewarnaan baru yaitu metode yang digunakan untuk mengiris sel-
sel mikroba menjadi irisan tipis mikroskopis untuk pemeriksaan dan teknik
radioaktif. Setelah spesimen yang diamati dengan mikroskop elektron tersebut telah
diiris menjadi irisan tipis mikroskopis, kemudian irisan spesimen tersebut dijadikan
preparat dengan melalui teknik-teknik pembuatan preparat yang digunakan pada
mikroskop elektron. Teknik yang digunakan dalam pembuatan preparat ada
berbagai macam tergantung pada spesimen dan penelitian yang dibutuhkan, antara
lain:
· Kriofiksasi yaitu suatu metode persiapan dengan menggunakan teknik pembekuan
spesimen dengan cepat yang menggunakan nitrogen cair ataupun helium cair,
dimana air yang ada akan membentuk kristal-kristal yang menyerupai kaca. Suatu
bidang ilmu yang disebut mikroskopi cryo-elektron (cryo-elektron microscopy)
telah dikembangkan berdasarkan teknik ini.
· Fiksasi yaitu suatu metode persiapan untuk menyiapkan suatu sampel agar tampak
realistik (seperti kenyataannya) dengan menggunakan glutaraldehid dan osmium
tetroksida.
· Dehidrasi yaitu suatu metode persiapan dengan cara menggantikan air dengan
bahan pelarut organik seperti misalnya ethanol atau aseton.
· Penanaman (Embedding) yaitu suatu metode persiapan dengan cara menginfiltrasi
jaringan dengan resin seperti misalnya araldit atau epoksi untuk pemisahan bagian.
· Pembelahan (Sectioning) yaitu suatu metode persiapan untuk mendapatkan
potongan tipis dari spesimen sehingga menjadikannya semi transparan terhadap
elektron. Pemotongan ini bisa dilakukan dengan ultramicrotome dengan
menggunakan pisau berlian untuk menghasilkan potongan yang tipis sekali.
· Pewarnaan (Staining) yaitu suatu metode persiapan dengan menggunakan metal
berat seperti timah atau uranium untuk menguraikan elektron gambar sehingga
menghasilkan kontras antara struktur yang berlainan di mana khususnya materi
biological banyak yang warnanya nyaris transparan terhadap elektron (objek fase
lemah).
· Pembekuan fraktur (Freeze-fracture) yaitu suatu metode persiapan yang biasanya
digunakan untuk menguji membran lipid. Jaringan atau sel segar didinginkan
dengan cepat (cryofixed) kemudian dipatah-patahkan atau dengan menggunakan
microtome sewaktu masih berada dalam keadaan suhu nitrogen (hingga mencapai
-1000C).
 BAB III
PENUTUP
3.1 Simpulan
1. Mikroskop adalah instrumen yang paling banyak digunakan dan juga paling
bermanfaat di laboratorium sedangkan mikroskopi adalah keahlian dalam
menggunakan mikroskop.

2. Mikroskop dikategorikan menjadi dua jenis yaitu mikroskop cahaya dan mikroskop
elektron. Mikroskop cahaya menggunakan sistem lensa optis yang mencakup
mikroskop medan terang ,fluoresensi dan fase kontras. Sedangkan mikroskop
elektron menggunakan berkas elektron sebagai pengganti gelombang cahaya untuk
memperoleh bayangan yang diperbesar,mikroskop elektron dibedakan menjadi dua
yaitu Transmission Elektron Microscope (TEM) dan Scanning Elektron
Microscope (SEM)
3. Dalam pengamatan mikroorganisme dengan menggunakan mikroskop, baik itu
dengan mikroskop cahaya maupun mikroskop elektron menggunakan metode
tertentu. Metode itu disebut dengan metode mikroskopik yang terdiri dari teknik
mikroskop cahaya dan teknik mikroskop elektron.
4. Metode mikroskopik mikroskop cahaya meliputi teknik preparat basah dan tetes
gantung serta teknik pewarnaan, sedangkan teknik mikroskop elektron meliputi
teknik bayangan logam (metal shadowing), teknik pemecahan beku (freeze
fracture), dan metode-metode pewarnaan baru.
4.1 Saran
Dengan mempelajari tentang mikroskopi dan metode mikroskopik,
diharapkan agar kita mampu memanfaatkan secara benar dan tepat penggunaan
mikroskop dalam pembelajaran mikrobiologi. Seiring dengan perkembangan
teknologi, seharusnya kita mampu mengembangkan mikroskop agar kita dapat
mempelajari hal-hal baru tentang anatomi mikroba dan sel organisme yang lebih
tinggi.