Pembelajaran 5.

2 : Kromatografi kertas dan lapis tipis

1. Capaian pembelajaran :
Setelah menyelesaikan proses pembelajaran pada modul ini, mahasiswa diharapkan
memiliki kemampuan :
1. Memahami prinsip dasar kromatografi kertas dan lapis tipis
2. Memahami tentang Rf pada kromatografi kertas dan lapis tipis
Untuk membantu Anda dalam mencapai tujuan-tujuan tersebut, dalam modul ini akan
disajikan uraian, latihan (pengayaan) dan rambu-rambu jawaban serta soal evaluasi. Agar
anda dapat belajar dengan baik dalam mempelajari modul ini, lakukanlah hal-hal berikut :
1. Pelajarilah dengan cermat semua uraian yang tercantum dalam masing-masing proses
pembelajaran.
2. Kerjakanlah soal-soal latihan (pengayaan) yang terdapat dalam setiap proses pembelajaran
dengan berusaha tanpa melihat dahulu rambu-rambu jawabannya. Setelah Anda selesai
mengerjakan soal-soal tersebut, cocokkanlah pekerjaan anda dengan rambu-rambu
jawaban yang tersedia. Bila pekerjaan Anda masih jauh menyimpang dari rambu-rambu
jawaban, hendaknya Anda tidak berputus asa untuk mempelajarinya kembali.
3. Dalam setiap proses pembelajaran diakhiri dengan intisari (rangkuman) yang merupakan
sari pati dari uraian yang telah disajikan. Bacalah dengan seksama isi rangkuman tersebut
sehingga pengalaman belajar Anda benar-benar mantap.
4. Evaluasi (tes formatif) yang disusun setelah rangkuman merupakan tes yang diberikan
untuk mengukur penguasaan Anda dalam pokok bahasan yang telah dipaparkan dalam
proses pembelajaran. Hasil anda dalam tes formatif tersebut digunakan sebagai dasar
penentuan apakah Anda sudah dapat melanjutkan ke proses pembelajaran berikutnya
ataukah masih perlu mengulang. Seberapa jauh tingkat penguasaan Anda, dapat Anda
hitung sendiri dengan rumus sederhana yang dicantumkan pada setiap akhir tes formatif.

Selamat Belajar, Semoga Sukses !

2. Materi
a. Kromatografi Kertas
Kromatografi adalah teknik untuk memisahkan campuran menjadi
komponennya dengan bantuan perbedaan sifat fisik masing-masing komponen.
Pemisahan beberapa kation dan anion-anion dapat dilakukan dengan baik dan efektif
menggunakan krematografi kertas dan lapisan tipis. Kromatografi kertas adalah teknik
pemisahan yang menggunakan pita selebar 2-5cm dimana lembaran panjangnya dapat
dengan mudah digunting sedangkan kromatografi lapisan tipis adalah (TLC) merupakan
teknik pemisahan yang menggunakan lembaran tipis aluminium oksida, gel silika,
selulosa atau suatu bahan lain yang didukung oleh suatu lembaran logam atau suatu
polimer.
Kromatografi kertas maupun lapisan tipis menggunakan sedikit bahan yang
diletakkan pada daerah terbatas didekat ujung selembar kertas saring atau lapis tipis.
Suatu pelarut dibiarkan berdifusi dari ujung kertas atau lapis tipis melalui kerja kapiler ;
pada kondisi selang beberapa waktu (1-30 jam), campuran akan dijumpai telah
berpindah kedaerah penotolan dan telah terpisah sebagian atau seluruhnya menjadi
komponen-komponen dengan zona yang yang jelas. Zona –zona dalam bentuk noda-
noda atau pita-pita dapat ditentukan letaknya dengan menggunakan reagensia kimia
yang sesuai.atau menggunakan pendaran fluor ultra-violet
Posisi yang dicapai oleh suatu zat atau ion dirumuskan dengan RF dimana
merupakan angka banding jarak yang dijalani oleh suatu zat atau ion teerhadap jarak
yang dijalani garis depan pelarut dan diukur dari titik penotolan campuran. Gambar
VI.2 akan membantu menjelaskan definisi dari RF.
Point (a) adalah sepotong kertas saring terbenam dalam pelarut dan ditopang oleh
sebatang kaca. Point (b) AB menyatakan dimana noda larutan ditotolkan pada awal
eksperimen. Point (c) posisi kedua pita dibuat nampak misalnya dengan
menyemprotkan reagensia yang sesuai pada daerah C dan D dan juga garis depan
pelarut E. Harga RF dipengaruhi oleh beberapa faktor antara lain:
a. Kehadiran ion lain
b. Keasaman larutan aslinya
c. Waktu melakukan percobaan misalnya dengan sepotong kertas
d. Adanya kation lain dan konsentrasi

Tehnik pemisahan kromatografi kertas

Proses pengeluaran asam mineral dari kertas saring disebut desalting, larutan
ditempatkan pada kertas dengan menggunakan mikropipet pada jarak 2-3 cm dari salah
satu ujung kertas dalam bentuk coretan garis horizontal. Setelah kertas dikeringkan,
diletakkan di dalam ruang yang sudah dijenuhkan dengan air atau dengan pelarut yang
sesuai, penjenuhan dapat dilakukan 24 jam sebelum analisis, adapun tiga tehnik
pelaksanaan analisis
a. Descending adalah salah satu tehnik dimana cairan dibiarkan bergerak menuruni
kertas akibat gravitasi.
b. Ascending .Pada tehnik ini pelarut bergerak ke atas dengan gaya kapiler, nilai R f
harus sama pada descending
c. Teknik yang ketiga dikenal sebagai cara radial atau kromatografi kertas sirkuler.
Kondisi-kondisi yang diatas harus diperhatikan untuk memperoleh nilai R f
yang reproducible, temperature harus dikendalikan dalam variasi tidak boleh lebih dari
0,5oC, kertas harus didiamkan dahulu paling tidak 24 jam dengan atmosfer pelarutnya,
agar mencapai kesetimbangan sebelum pengaliran pelarutnya pada kertas, dilakukan
beberapa pengerjaan yang parallel, Rf nya tidak boleh berbeda lebih dari ± 0.02.
Suatu atomiser umumnya digunakan sebagai reagent penyemprot bila batas
permukaan pelarut dan zat terlarut dalam kertas ingin dibuat dapat dilihat, atomiser
yang harus lebih disukai. Gas-gas juga dapat digunakan sebagai penanda bercak, untuk
karbonhidrat notasi RG yang digunakan untuk menggantikan Rf. setelah penandaan
beracak atau batas permukaan, selanjutnya dapat digunakan anlisis kalorimetri atau
spektroskopi reflektansi bila sampel berupa logam.materi yang di dalam kertas dapat
ditentukan secara langsung dengan pelarutan kromatografi kertas, selain untuk
 pemisahan dan analisis kuantitatif juga sangat bermamfaat untuk identifikasi. Hal ini
dapat dilakukan misalnya membuat grafik antara RM α terhadap jumlah kation dalam
suatu deretan homolog, maka kemungkinan untuk mengidentifikasi suatu anggota deret
homolog.

b. Kromatografi lapis tipis

Kromatografi lapisan tipis adalah (TLC) merupakan teknik pemisahan yang
menggunakan lembaran tipis aluminium oksida, gel silika, selulosa atau suatu bahan
lain yang didukung oleh suatu lembaran logam atau suatu polimer. Derajat retensi pada
kromatografi lempeng biasanya dinyatakan sebagai faktor retensi, R f :
𝑗𝑎𝑟𝑎𝑘 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑡𝑒𝑚𝑝𝑢ℎ 𝑠𝑒𝑛𝑦𝑎𝑤𝑎 𝑡𝑒𝑟𝑙𝑎𝑟𝑢𝑡
Rf = 𝑗𝑎𝑟𝑎𝑘 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑡𝑒𝑚𝑝𝑢ℎ 𝑝𝑒𝑙𝑎𝑟𝑢𝑡

Jarak yang telah ditempuh pelarut dapat diukur dengan mudah dan jarak tempuh
cuplikan diukur pada pusat bercak itu, atau pada titik kerapatan maksiumum. Definisi
koefisien distribusi K adalah perbandingan dingin kadar senyawa terlarut dalam fasa
gerak CM dan kadar senyawa terlarut dalam fasa diam Cs,
CS
K=
CM

Ada hubungan sederhana antara harga K dan Rf. Jarak tempuh rata-rata
molekul terlarut berbanding langsung dengan kecepatan alir pelarut dikalikan dengan
fraksi waktu senyawa terlarut terdapat dalam fasa gerak. Kemudian dapat dinyatakan
sebagai jumlah molekul dalam setiap fasa, atau sebagai distribusi senyawa terlarut
dalam dua fasa :
𝑗𝑢𝑚𝑙𝑎ℎ 𝑚𝑜𝑙 𝑠𝑒𝑛𝑦𝑎𝑤𝑎 𝑡𝑒𝑟𝑙𝑎𝑟𝑢𝑡 𝑑𝑎𝑙𝑎𝑚 𝑓𝑎𝑠𝑎 𝑔𝑒𝑟𝑎𝑘
Rf = 𝑀𝑜𝑙 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑠𝑒𝑛𝑦𝑎𝑤𝑎 𝑡𝑒𝑟𝑙𝑎𝑟𝑢𝑡 𝑑𝑎𝑙𝑎𝑚 𝑑𝑢𝑎 𝑓𝑎𝑠𝑎

CM AM
=
CM AM + CS AS

Dimana AM dan AS, adalah luas penampang melihat dua fasa itu (tegak lurus lempeng).
Penjabaran lebih lanjut persamaan di atas, diperoleh
AM AM
Rf = =
AM + AS CS CM AM + KAS
Luas penampang melintang sukar diukur, oleh karena itu persamaan di atas kurang
praktis, tetapi dapat menunjukan bahwa harga Rf adalah bentuk modifikasi dari tetapan
keseimbangan. Karnanya harga Rf dapat diharapkan tergantung pada parameter sama
seperti pada metode kromatografi kolom. Harga Rf juga merupakan subyek terhadap
 beberapa pengaruh, seperti macam penyerapan, ketebalan, metode arah pengembangan,
kadar dan jumlah cuplikan, dan juga jarak yang ditempuh bercak. Dengan seperti
diatas, lebih mudah dan lebih tepat menggunakan harga R f relatif atau Rstandar, dimana
suatu senyawa standar ditambahkan pada cuplikan. Harga Rstd adalah angka banding
jarak tempuh dua bercak itu dalam waktu pengembangan yang sama.
Fasa diam
Pada semua prosedur kromatografi, kondisi optimum untuk suatu pemisahan
merupakan hasil kecocokan antara fasa diam dan fasa gerak. Pada umumnya sebagai
fasa diam digunakan silika gel. Fasa diam dapat dikelompokkan berdasarkan beberapa
hal, misalnya berdasarkan sifat kimianya, dapat dikelompokkan dalam senyawa organik
dan anorganik. Jika dilihat mekanisme pemisahan, fasa diam dikelompokkan :
a. Kromatografi serapan (Silika gel, alumina, keiselguhr)
b. Kromatografi partisi (Selulosa, keiselguhr, silika gel)
c. Kromatografi penukar ion (Penukar ion selulosa, resina penukar ion)
d. Kromatografi gel (Sephadex, Biogel)
Ada bebrapa fasa diam yang sukar dikelompokkan, misalnya poliamida, plimer
organik berpori seperti porapak.
• Silika gel merupakan fasa diam yang paling sering digunakan untuk KLT. Silika gel
mempunyai ukuran 10–40 µ. Sedangkan proses serapan terutama bervariasi dari 20-
150 Å. Silika gel berpori 80-150 dinamakan berpori besar. Luas permukaan silika gel
bervariasi dari 300 – 1000 m2/g. Pada kelembapan 45 -75 % dapat mengikat air 7 –
20%.
• Alumina merupakan fasa diam yang paling banyak digunakan setelah silika gel.
Alumina untuk KLT bersifat sedikit basa (pH 9), di samping itu juga ada alumina
netral (pH 7) dan alumina asam (pH 4). Dalam banyak hal digunkaan CaSO 4 sebagai
pengikat.
• Keiselguhr merupakan penyerap dengan aktivitas rendah. Tidak banyak digunakan
dalam KLT. Penggunaan utama sebagai padatan pendukung untuk fasa diam dalam
kromatografi partisi.
• Selulosa memiliki panjang serat bervariasi dari 2-20 µ. Serat pendek menyebabkan
difusi rendah selama pengembangan dan menghasilkan noda lebih kecil. Pada KLT
selulosa digunakan untuk pemisahan senyawa hidrofil
Fasa gerak
 Jika sebagai fasa gerak digunakan sistem pelarut campuran, pada lapisan fasa
diam susunan pelarut itu dapat mengalami perubahan sedikit demi sedikit. Hal ini
akan menghasilkan kedpat-ulangan agak jelek. Oleh karenanya sistem dua pelarut
lebih disenangi.

Air n-Amil alkohol

Formamida Etil asetat
Metanol Eter
Asam asetat n-Butil asetat
Etanol Kloroform
Isopropanol Benzena
Aseton Toluena
n-Propanol Sikloheksana
tert-Butanol Eter protelium
Fenol Proteleum
n-Butanol Minyak parafin

Penyusunan sistem pelarut dapat dipilih sesuai dengan kemampuannya

membentuk ikatan hidrogen dalam satu seri dari hidrofil sampai ke hidrofob.
Kombinasi pelarut yang mempunyai sifat berbeda memungkinkan didapatkannya
sistem pelarut yang cocok.
Pada sistem partisi air sebagai fasa diam, terikat oleh pendukung, dan fasa
geraknya digunakan yang tidak bercampur dengan air. Sistem ini biasanya dibuat
dengan mencampur air dengan pelarut organik dalam corong pisah. Setelah kedua fasa
itu terpisah keduanya digunakan untuk penjenuhan bejana pengembangan dan fasa
organik bertindak sebagai fasa gerak.
Metodologi
a. Pembuatan lempeng
Ukuran lempeng gelas yang biasa digunakan 20 x 20, 20 x 10 dan 20 x 5 cm.
Sebelum dilapisi lempeng kaca ini dibersihkan dengan air dan deterjen, kemudian
dikeringkan. Cuci lagi dengan aseton dan permukaan kaca yang bersih jangan samapi
tersentuh.
30 gram silika gel atau penyerap lain dibuat bubur dengan sejumlah air atau
pelarut lain, dan segera dipindahkan dalam alat perata. Ratakan bubur itu untuk 4-5
 lempeng (20x20 cm) dalam waktu 4 menit jika digunakan bahwa pengikat dalam
bubur penyerap itu dapat juga ditambahkan dapar untuk membuat keasaamn tertentu
atau kandungan air pada lapisan fasa diam. Pindahkan lempeng itu dengan hati-hati
pada rak dan setelah 30 menit keringkan pada 100-120o selama 1 jam untuk
mengaktifkan fasa diam. Dinginkan dan simpan lempeng itu dalam desikator. Tebal
lapisan fasa diam biasanya 0,25 mm, sedangkan untuk pemisahan preparatif
digunakan tebal 0,5-2,0 mm.
Perbandingan bahan dan pelarut untuk pembuatan lempeng

Nama Perbandingan bahan dan air

Silika gel 1 : 1,5

Silika gel G atau GF 1:2
Alumina 1 : 1,1
Alumina oksida G 1:2
Serbuk selulosa MN 300 1:5
Serbuk selulosa MN 300G 1:6
Keiselguhr G 1:2
Serbuk poliamida 1:9

b. Penotolan cuplikan
Pada lempeng lapis tipis konvensional (20 x 20 cm, 10 x 20 cm, 5 x 20 cm,
tebal 0,2 mm) cuplikan biasanya di totolkan sebagai bercak bulat atau garis, 1,5-
2,0ncm dari tepi bawah. Bercak sebaiknya berukuran sama dan mempunyai
diameter 3-6 mm.
Pentotolan dapat dilakukan dengan mikropipet atau dengan “microsyringe”,
biasanya diperlukan 1-20 ul. Volume lebih besar dari itu dapat ditotolkan terhadap
dalam bagian-bagian kecil dengan pengeringan di antara penotolan itu. Kelebihan
beban menyebabkan bercak asimetri dan peruabahan harga R f, yang dapat
dihindari jika cuplikan kurang dari 10-20 µg.
Pada lempeng kromatografi lapis tipis efesiensi tinggi (KLTET) (biasanya
10x10 cm atau 10x20 cm) hanya diperlukan dalam nano sampai samapai
pikogram setiap bercak. Diameternya tidak harus lebih 1-1,5 mm dan volume
cuplikan tidak lebih 0,2 ul. Diperlukan tehnik penotolan khusus, yaitu dengan
 syringe 1 µl yang dihubungkan dengan sekrup mikrometer, atau dengan sebuah
kapiler platina iridium dalam aplikator otomatis.
c. Pengembangan kromatogram
Kromatogram biasanya dikembangkan dengan tehnik naik linier dengan
menggunakan bejana pengembang gelas atau logam. Pada bejana itu diberi kertas
saring dan fasa gerak sampai kedalaman 0,5 cm. Supaya kedapat-ulangya baik,
jarak antar permukaan fasa gerak dan garis batas harus sama (1-2 cm). Harga Rf
sering tidak sama karena perbedaan kejenuhan.
Pengembangan menurun atau horisontal dapat dapat digunakan dalam
beberapa kasus, yaitu pada lapisan tebal atau dengan fasa gerak kental. Fasa gerak
dialirkan pada lapisan melalui kertas saring. Pengembangan horisontal biasanya
digunakan pada KLTET. Untuk memperbaiki pemisahan dapat dilakukan tehnik
Pengembangan berkelanjutan. Fasa gerak dialirkan pada bagian atas dari
lempeng pengembangan horisontal dan dihisap oleh fasa diam. Tehnik ini
terutama dilakukan untuk senyawa yang mempunyai harga Rf 0,05-0,2 setelah
pengembangan pertama.
Pengembangan dua dimesi. Cuplikan di totolkan pada lempeng 3-4 cm
dari salah satu pojok dan dikembangkan seperti biasanya. Lempeng kemudian
diputar 90o sehingga pita pemisahan dari hasil pengembangan pertama terletak
pada bagian bawah lempeng, dan kemudian dilakukan pengembangan kedua.
Fasa gerak harus diganti sehingga diperoleh pengaruh pemisahan berbeda pada
arah kedua. Tehnik ini berguna untuk cuplikan yang mengandung banyak
senyawa penyusun.
Pengembangan sirkuler. Pada kromatografi sirkuler fasa gerak dialirkan
dengan sebuah sumbu atau pompa melalui pipa kapiler ditengah lapisan fasa
diam.senyawa terlarut bergerak cepat dari tengah penotolan menghasilkan
lingkaran-lingkaran sempit.
Pengembangan beberapa kali. Fasa gerak biasanya mudah menguap dapat
diuapkan setelah pengembangan dan lempeng itu dapat dikembangkan lagi dengan
fasa gerak sama atau fasa gerak lain. Tehnik ini dinamakan pengembangan
beberapa kali. Bercak cuplikan berbentuk bulat telur dengan aksisi pendek kepada
arah fasa gerak bergerak.

d. Metode identifikasi
 Untuk melihat senyawa tak berwarna pada lempeng, biasanya digunakan
metode sebagai berikut:
1. Melihat kromatogram dibawah sinar ultraviolet (245 atau 366 nm)
a. Pada lapisan berfluoresensi, misalnya silica gel GF245, bercak muncul
sebagai noda hitam.
b. Untuk senyawa berfluoresensi digunakan lapisan biasa, bercak terlihat
berfluoresensi.
2. Menyemprot dengan pereaksi yang menghasilkan warna dan atau
berfluoresensi.
Metode yang sering digunakan adalah deteksi asam sulfat. Reaksi ini dapat
terbentuk dalam keadaan dingin atau dengan pemanasan lempeng pada 100-
200o. Cara ini tidak dapat digunakan pada fasa diam organik atau dimana
sebagai pengikat digunakan pati. Pereaksi lain yang banyak digunakan adalah
uap yodium.
Data batas deteksi yang tertera dalam buku sering sukar dicapai karena
jumlah terkecil suatu senyawa yang masih dapat diamati tergantung pada harga
Rf-nya.
e. KLT preparatif
Pemisahan preparatif sering dilakukan pada lapisan yang agak tebal (0,5-2,0
mm). Cuplikan ditotolkan sebagai garis sempit dengan alat yang sesuai.
Ukuran maksimum cuplikan tergantung pada jumlah relatif senyawa penyusun,
perbedaan Rf-nya dan lebar lempeng. Jika selisih harga R f lebih besar dari 0,2
dapat ditotolkan 50-100 mg cuplikan pada lempeng 20 cm.

c. Analisis kuantitatif
Analisis kuantitatif dari suatu senyawa yang telah dipisahkan KLT biasanya
dilakukan dengan densitometer langsung pada lempeng KLT (insitu). Alat ini dapat
bekerja secara serapan atau fluoresensi. Kebanyakan densitometer mempunyai sumber
cahaya, monokromator untuk memilih panjang gelombang yang cocok, sistem untuk
memfokuskan sinar pada lempeng, pengganda foton dan rekorder.
Pada sistem serapan dapat dilakukan dengan model pantulan atau transmisi.
Cairan transmisi dilakukan dengan menyinari bercak dari satu sisi dan mengukur sinar
yang diteruskan pada sisi lain. Pada kenyataannya hanya sinar tampak yang dapat
digunakan untuk metode ini. Pada cara pantulan, yang diukur sinar pantulan.
Gangguan utama pada sistem serapan adalah fluktuasi latar belakang yang dapat
dikurangi dengan beberapa cara , misalkan dengan menggunakan alat berkas ganda,
sitem transmisi dan pantulan secara bersamaan atau sistem dua panjang gelombang.
Pada cara pantulan dapat digunakan sinar tampak maupun ultraviolet.
Kurva baku dibuat setiap lempeng dan kadar senyawa dihitung seperti pada
metode spektofotometri. Ketelitian penetapan termaksud penolakan cuplikan,
pengembangan kromatogram dan pengukuran, 2-5 %.
Sistem fluoresensi biasanya lebih disenangi jika senyawa itu dapat dibuat
berfluoresensi. Batas deteksi sistem ini lebih rendah dan kelinieran respon dan
selektifitasnya lebih tinggi. Gangguan fluktuasi latar belakang juga lebih rendah.
Bercak yang diukur dengan sistem fluoresensi, serapan ultraviolet atau sinar
tampak dapat ditetapkan lebih teliti daripada bercak yang disemprot dengan pereaksi
warna. Faktor keseragaman pada penyemprotan merupakan hal yang sangat
menentukan.
Pengambilan senyawa dari fasa diam biasanya digunakan tabung Craig dengan
cara penyarian. Hal ini snagat berguna terutama untuk KLT preparatif karena senyawa
yang dipisahkan membentuk suatu pisah dan jumlah serbuk yang agak banyak ini
diambil dengan penyedotan.
Cara lain, bercak dikerok dan disinari dengan pelarut polar misalnya etanol.
Untuk menghindari kontaminasi minyak dan serabut pada penyaringan fasa diam
digunakan penyaring kaca masir. Karena jumlah yang disarig kecil, semua alat harus
benar-benar bersih. Kemudian dilanjutkan pengukuran secara spektofotometri. Cara
ini memerlukan waktu cukup lama, lagi pula kepekaanya tidak setinggi densitometri.

d. Penggunaan
KLT biasaya merupakan metode pilihan pertama jika seseorang ingin
memisahkan suatu campuran. Hal ini disebabkan metode ini sederhana dan cepat.
Berikut ini contoh penggunaan KLT pada pemisahan alkaloida kinina, kinidina,
sinkonina dan sinkonidina dalam kulit kina.
a. Larutan cuplikan
0,1 gram serbuk kulit kina dibahasi dengan 2 tetes amonia 25 % f dan dikocok
dengan 5 ml kloroform selama 10 menit. Saring dan uapkan filtrat samapi kering.
Larutan dalam 1,0 ml metanol, totolkan 5 -10 ul larutan ini 2 cm dari tepi bawah.
b. fasa diam
 Silika gel GF254 atau lempen jadi silika gel F254 20x20 cm.
c. fasa gerak
Ada beberapa sistem fasa gerak yang telah banyak digunakan untuk pemisahan
alkalida utama kulit kina

No Sistem fasa gerak

S1 Kloroform-dietilamina (9:1)
S3 Kloroform-aseton-dietilamina (5:4:1)
S6 Kloroform-etilasetat-isopropanol-dietilamina (20:70:4:6)
S9 Minyak tanah-aseton-dietilmina (23:9:9)
S14 Toluena-dietil-eter-dietilamina (20:12:5)

Kromatogram dikembangkan dalam bejana kromatografi, pada dinding dalam

ditaruh kertas saring. Bejana ini dijenuhi dengan fasa gerak selama 30 menit.
Lempeng dielusi dengan jarak 10 cm.
d. Deteksi
Pertama panaskan lempeng KLT pada 100° selama 10 menit untuk
menghilangkan amina.

Deteksi alkaloida utama kina

Pereaksi Kepekaan Warna bercak Warna latar belakang
Penyinaran pada 254 0,1 Biru -
nm
Fluoresensi 366 nm 0,01 Biru -
(asam sulfat -
metanol)
Uap yod 0,1 Coklat Kuning
Yod dalam metanol 0,1 Coklat Kuning
Iodoplatinat 0,01-0,1 Violet, biru violet

e. Analisis kuantitatif
Bercak pada KLT dapat disari dengan kloroform, etanol mutlak, asam klorida
0,1 N, atau asam sulfat 0,1 N, kemudian dilanjutkan pengukuran secara
fluorimetri atau spektofotometri. Pada fluorimetri digunakan juga gelombang
 eksitasi 350 nm dan emisi diukur pada 450 nm untuk kinidina dan 455 nm untuk
kinina dalam asam encer. Pada spektofotometri kinina diukur pada panjang
gelombang 332 nm, 324 nm dan 366 nm sedangkan sinkonia pada 316 nm.
Pada fluorimetri dengan desitometer, lempeng KLT disemprot dengan
asam sulfat dalam metanol lebih dulu. Untuk kinina panjang gelombang eksitasi
361 nm atau 345 nm dan emisi pada 438 nm dan 430 nm. Panjang gelombang
eksitasi kinidina 335 nm atau 365 nm dengan emisi 455 nm atau 430 nm.
Sinkinina dan sikkinidina dapat ditetapkan tanpa terganggu kinina dan kinidina
jika dieksitasi pada 313 nm dan emisi diukur pada 390 nm. Batas deteksi cair ini 1
ng.
Penetapan densitometri secara serapan dapat juga dilakukan setelah
lempeng KLT disemprotkan asam sulfat-etanol. Serapan maksimum kinina dan
kinidina pada 330 nm sedangkan sinkonina dan sinkonidina pada 288 nm, dengan
batas deteksi 100 ng.

3. Inti Sari
Metode pemisahan suatu senyawa yang didasarkan atas migrasi differensial
komponen zat diantara 2 fasa yaitu fasa diam (fasa stasioner) dan fasa gerak (fasa
mobile). Fasa diam dapat berupa cair atau padat, Fasa gerak dapat berupa gas atau cair
𝑗𝑢𝑚𝑙𝑎ℎ 𝑚𝑜𝑙𝑒𝑘𝑢𝑙 𝑑𝑎𝑙𝑎𝑚 𝑓𝑎𝑠𝑎 𝑔𝑒𝑟𝑎𝑘
Fraksi dalam fasa gerak = 𝑗𝑢𝑚𝑙𝑎ℎ 𝑚𝑜𝑙𝑒𝑘𝑢𝑙 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙

Kromatografi kertas adalah teknik pemisahan yang menggunakan pita selebar 2-5cm dimana
lembaran panjangnya dapat dengan mudah digunting sedangkan kromatografi lapisan tipis
adalah (TLC) merupakan teknik pemisahan yang menggunakan lembaran tipis aluminium
oksida, gel silika, selulosa atau suatu bahan lain yang didukung oleh suatu lembaran logam
atau suatu polimer.
Kromatografi kertas maupun lapisan tipis menggunakan sedikit bahan yang diletakkan
pada daerah terbatas didekat ujung selembar kertas saring atau lapis tipis. Suatu pelarut
dibiarkan berdifusi dari ujung kertas atau lapis tipis melalui kerja kapiler ; pada kondisi selang
beberapa waktu (1-30 jam), campuran akan dijumpai telah berpindah kedaerah penotolan dan
telah terpisah sebagian atau seluruhnya menjadi komponen-komponen dengan zona yang
yang jelas. Zona –zona dalam bentuk noda-noda atau pita-pita dapat ditentukan letaknya
dengan menggunakan reagensia kimia yang sesuai.atau menggunakan pendaran fluor ultra-
violet
4. Latihan
1. Jelaskan prinsip dasar yang mendasari semua proses kromatografi
2. Klasifikasikan jenis kromatografi berdasar atas fasa gerak dan fasa diam

5. Evaluasi
1. Ciri khas dari pemisahan dengan kromatografi adalah :
a. Fasa gerak bergerak diskontinyu
b. Perbedaan migrasi berbagai senyawa dalam cuplikan
c. Penyebaran sepanjang kolom dari molekul senyawa tertentu
d. Hasil distribusi keseimbangan dari senyawa-senyawa di antara fasa diam dan fasa
gerak
e. b, c dan d benar
2. Resolusi dari 2 puncak senyawa dalam suatu kromatografi ,
a. Berbanding lurus dengan luas puncak
b. Berbanding lurus dengan waktu retensi senyawa pertama
c. Berbanding terbalik dengan jumlah luas kedua puncak
d. Berbanding terbalik dengan jumlah lempeng teori
e. Berbanding lurus dengan panjang kolom

3. Berikut pernyataan yang benar pada kromatografi kertas, kecuali :

a. Kertas saring berfungsi sebagai padatan pendukung
b. Yang berperan sebagai fasa diam adalah udara dalam pori-pori kertas
c. Ruang kromatografi harus dijenuhkan dengan uap pelarut
d. Menggunakan lembaran tipis aluminium oksida sebagai fasa diam
e. Nilai Rf pada teknik descending dan ascending harus sama

4. Berikut pengertian dari factor retensi (Rf).

a. Jarak yang ditempuh senyawa terlarut dibagi jarak yang ditempuh pelarut
b. Jumlah mol senyawa terlarut dalam fasa gerak dibagi mol total senyawa terlarut di
dalam dua fasa.
c. Rf adalah bentuk modifikasi dari tetapan keseimbangan
d. a , b dan c adalah pernyataan yang benar
e. a, b dan c adalah pernyataan yang salah
 5. Pada kromatografi lapis tipis, fasa diam yang paling sering digunakan adalah :
a. Silika gel
b. Alumina
c. Selulosa
d. Sephadex
e. Keiselguhr

Cocokkanlah jawaban Anda dengan Kunci Jawaban Tes Formatif 2 yang terdapat di
bagian akhir modul ini. Hitunglah jawaban yang benar. Kemudian, gunakan rumus
berikut untuk mengetahui tingkat penguasaan Anda terhadap materi Kegiatan Belajar 2.
𝐽𝑢𝑚𝑙𝑎ℎ 𝐽𝑎𝑤𝑎𝑏𝑎𝑛 𝑌𝑛𝑎𝑔 𝐵𝑒𝑛𝑎𝑟
Tingkat penguasaan: 𝑥 100%
𝐽𝑢𝑚𝑙𝑎ℎ 𝑆𝑜𝑎𝑙

Arti tingkat penguasaan:

90 - 100% = baik sekali
80 - 89% = baik
70 - 79% = cukup
< 70% = kurang