Nama: Mimma Amalia

NIM : 190332722011

Pertanyaan untuk sekuensing DNA dan videonya

1. a. Apa yang dimaksud dengan` sekuensing DNA`? b. Mengapa suatu DNA perlu
disekuensing?
Jawab:
a. Sekuensing DNA adalah adalah teknik/proses untuk mengurutkan nukleotida
penyusun suatu DNA.
b. Karena urutan nukleotida tersebut merupakan informasi paling mendasar suatu gen
atau genom dan mengandung instruksi yang dibutuhkan untuk pembentukan tubuh
makhluk hidup. Sekuensing DNA dapat dimanfaatkan untuk menentukan kerabatan
antar organisme, mendesain primer dalam PCR, maupun identitas fungsi gen atau
fragmen DNA lainnya dengan cara membandingkan sekuens-nya dengan sekuens
DNA lain yang sudah diketahui.

2. Misalkan dingiinkan untuk mensekuens suatu fragmen DNA berikut (X adalah

nukleotida yang belum diketahui):
5’XXXXXXXXXXXXXXXXXXXCCGGTAC3’
a. Alat dan bahan-bahan apa saja yang diperlukan?
Jawab:
Alat-Alat yang digunakan:
- Mikrotub digunakan untuk wadah dalam mencampurkan berbagai komponen
- Mikropipet berfungsi untuk mengambil atau memindahkan cairan dalam ukuran
mikro
- 96 plate well berfungsi untuk menampung antara puluhan nanoliter hingga
beberapa mililiter cairan.
- Tabung reaksi berfungsi sebagai tempat mereaksikan bahan kimia
- PCR berfungsi untuk mengamplifikasi atau menggandakan fragmen-fragmen
spesifik pada DNA ( untuk squensing manual)
- Mesin automated capillary sequencer (untuk squensing otomatis)
Bahan-Bahan yang digunakan
- DNA utas tunggal dalam jumlah cukup sebagai template DNA
- Primer yang sesuai (sepotong kecil DNA yang berpasangan dengan DNA template
yang bertindak sebagai titik mulai untuk replikasi)
- DNA polymerase (suatu enzim yang meng-kopi DNA, menambahkan nukleotid
baru pada ujung 3’ dari template)
- Sejumlah nukleotida normal
- Sejumlah kecil dideoxynucleotide yang dilabel (radioaktif atau dengan pewarna
fluoresent)

b. Jelaskan Tahapan Percobaan Sekuensing DNA tersebut secara rinci (boleh

secara manual atau secara automatik)
Jawab:
Tahapan sekuensing DNA secara manual menggunakan Metode Sanger :
a) Tahapan sekuensing DNA yang pertama adalah menyediakan dsDNA
(Double Strand DNA)

b) Memotong dsDNA (double strand DNA) menjadi ssDNA (single strand

DNA)
c) Mengambil template (cetakan) DNA dari ssDNA hasil potongan dari dsDNA
tadi

d) Menyediakan seluruh alat dan bahan untuk sekuensing DNA. Bahan untuk
sekuensing adalah template (cetakan) DNA, primer, dNTP, ddNTP dan enzym
 polymerase. 

 Template DNA berfungsi sebagai cetakan. 

 Primer berfungsi sebagai landasan/pijakan yang mengenal situs
spesifik pada DNA template untuk memulai proses polymerase. 
 dNTP (deoksi nukleotida tri phospat) berfungsi sebagai sumber
nukleotida pada proses polymerase sekuensing. dNTP ada 5 jenis,
yaitu dATP (deoksi adenin tri phospat), dGTP (deoksi guanin tri
phospat), dUTP (deoksi urasil tri phospat), dCTP (deoksi citosin tri
phospat), dan dTTP (deoksi timin tri phospat).
 ddNTP (dideoksi nukleotida tri phospat) berfungsi untuk
menghentikan/terminasi proses enzim polymerase, sehingga proses
perbanyakan nukleotida terhenti.
 Enzym polymerase berfungsi untuk reaksi polimerisasi atau
perbanyakan nukleotida.
e) Menyiapkan 4 tabung reaksi. Masing-masing tabung reaksi diisi dengan
ddNTP yang berbeda. Tabung pertama diisi dengan ddGTP, tabung kedua
diisi dengan ddCTP, tabung ketiga diisi dengan ddATP, dan tabung
keempat diisi dengan ddTTP.
f) Setelah masing-masing tabung diisi dengan ddNTP, kemudian masing-masing
tabung diisi dengan dNTP, sebagai sumber nukleotida pada proses polimerasi.
Yaitu dGTP, dCTP, dATP, dan dTTP.

g) Kemudian memasukkan primer ke dalam tabung reaksi. Primer berfungsi

mengenali situs spesifik pada DNA template, juga berfungsi sebagai
landasan/pijakan untuk memulai polimerisasi.

h) Setelah pemberian primer, juga dimasukkan enzim polimerase (taq-

polymerase). Enzim polimerase memulai proses polimerisasi
i) Enzim polymerase terus mengkatalisis pembentukan polinukleotida dari
nukleotida dNTP (deoksi nukleotida tri phospat)

j) Pada saat enzim taq-polymerase mengkatalisis pembentukan ikatan antara

nukleotida, deoksi-nukleotida (ddNTP) hadir berikatan dengan polimer
nukleotida sebelumnya
k) Kehadiran ddNTP (deoksinukleotida) mengakibatkan terhentinya/terminasi
proses polimerase, sehingga dihasilkan rantai polinukleotida yang berbeda
panjangnya

a). Berikut ini gambar perbedaan struktur dNTP (deoksinukleotida tri phospat)
dan ddNTP (dideoksinukleotida tri phospat). 

b). Keberadaan ddNTP menghalangi terbentuknya ikatan phospodiester antara

 satu nukleotida dengan nukleotida berikutnya, sehingga mengakibatkan
terminasi/pengakhiran proses polimerisasi

l) Kehadiran ddNTP menghasilkan beberapa rantai polinukleotida berbeda.

m) Kegiatan nomor 9 sampai nomor 13 dilakukan pada semua tabung reaksi

n) Keempat tabung reaksi tersebut dipersiapkan untuk di alirkan pada gel

agarosa.
o) Perbedaan panjang polinukleotida tersebut, mengakibatkan perbedaan letak
pada gel agarosa. Polinukleotida yang paling pendek
bermigrasi/pergerakannya paling cepat pada gel agarosa.

p) Hasil pembacaan sekeuensing dari arah 5’ ke 3’ adalah rantai kompemen,

yaitu 5’ AGCCGATCC 3’. Sehingga DNA templatenya adalah 5’
 GGATCGGCT 3’ 

c. Berapa pita yang terbentuk setelah elektroforesis?

Jawab :
Pita yang terbentuk adalah 26 pita

3. Sebutkan 3 macam persamaan dan dan 5 macam perbedaan antara Sekuensing

manual dan sekuensing otomatis
Jawab:
Persamaan Sekuensing manual dan sekuensing otomatis
- Menggunakan DNA polymerase
- Menggunakan pelabelan
- Menggunakan gel elektroforesis
Perbedaan Sekuensing manual dan sekuensing otomatis
Sekuensing manual Sekuensing otomatis
(cycle sequencing)
Menggunakan PCR Menggunakan mesin automated
capillary sequencer
Pemisahan fragmen dan pembacaan Pemisahan fragmen dan pembacaan
urutan basa DNA dapat dilakukan urutan basa DNA dapat dilakukan
lambat dengan lebih cepat
Membutuhkan DNA template yang Membutuhkan DNA template yang
banyak sedikit
Pewarnaan menggunakan isotop Pewarnaan menggunakan fluoresen
radioaktif
Transfer membutuhkan waktu yang Transfer langsung dari fotosel ke
lama komputer sehingga dapat dilakukan
analisis, rekaman, dan presentasi hasil
secara otomatis