MAKALAH DESIGN PRIMER

MATA KULIAH BIOLOGI MOLEKULER II

Jenis-Jenis Primer

1. Primer random (hexamer)

Primer acak/random adalah campuran oligonukleotida yang mewakili semua urutan

heksamer yang mungkin. Urutan primer acak adalah 5´ – d (NNNNNN) –3´ N = G, A, T atau C.
Oleh karena itu, primer acak dapat digunakan untuk amplifikasi DNA untai tunggal atau RNA
oleh DNA polimerase atau reverse transcriptase, masing-masing. Selain itu, campuran primer
acak mampu mengamplifikasi semua daerah RNA untuk menghasilkan cDNA. Dengan demikian,
ia menghasilkan berbagai panjang cDNA. Yang terpenting, campuran primer acak tidak
menunjukkan spesifisitas template. Ia tidak mampu membedakan mRNA dan spesies RNA
lainnya. Dan, itu menyatu dengan spesies RNA apa pun dalam sampel. Namun, campuran primer
acak cocok untuk transkripsi balik RNA tanpa ekor poli(A), seperti rRNA, tRNA, RNA non-
coding, RNA kecil, mRNA prokariotik, dll., RNA terdegradasi, dan RNA dengan struktur
sekunder yang diketahui.
2. Oligo(dT)

Oligo dT primer adalah rangkaian 12 – 18 deoxythymine (dT). Urutan primer dapat

direpresentasikan sebagai 5´-d (TTT TTT TTT TTT TTT TTT)-3. Ini digunakan untuk produksi
cDNA dari mRNA yang mengandung ekor poli(A). Pada dasarnya, ia bertindak sebagai primer
untuk reaksi yang dikatalisis oleh reverse transcriptase. Selama transkripsi terbalik, primer oligo
dT menyatu dengan ekor poli-adenilasi yang ditemukan di ujung 3 dari sebagian besar mRNA
eukariotik dan memulai prosesnya. Tidak seperti primer acak, primer oligo dT tidak cocok untuk
RNA terdegradasi atau RNA yang tidak memiliki ekor poli(A), termasuk RNA prokariotik dan
mikroRNA.

Apa Persamaan Antara Primer Acak dan Oligo dT?

  Primer acak dan primer oligo dT adalah dua jenis primer yang digunakan dalam
transkripsi balik dan pembuatan cDNA.
 Menggunakan primer acak dan primer oligo dT bersama-sama meningkatkan sensitivitas
sintesis cDNA.
 Mereka adalah urutan nukleotida pendek beruntai tunggal.

Apa Perbedaan Antara Primer Acak dan Oligo dT?

Primer acak adalah urutan oligonukleotida pendek yang terdiri dari urutan acak.
Sementara itu, oligo dT primer adalah untai pendek yang terdiri dari 12 hingga 18
deoxythymidines. Jadi, inilah perbedaan utama antara primer acak dan oligo dT. Urutan primer
acak adalah 5´ – d (NNNNNN) –3´ N = G, A, T atau C. Sedangkan urutan primer oligo dT adalah
5´-d (TTT TTT TTT TTT TTT TTT)-3´ . Oleh karena itu, kita dapat menganggap ini sebagai
perbedaan lain antara primer acak dan oligo dT.
Selain itu, primer acak tidak menunjukkan spesifisitas template, dan mereka menyatu
dengan spesies RNA apa pun, sementara primer oligo dT menunjukkan spesifisitas untuk ekor
poli(A) mRNA eukariotik.

3. Primer universal

Primer universal bersifat komplementer terhadap sekuens nukleotida yang sangat umum
dalam seperangkat molekul DNA dan vektor kloning tertentu. Dengan demikian, primer-primer
ini mampu mengikat berbagai macam templat DNA.

Berikut beberapa contoh primer universal :

No Primer Name Primer Sequence

1 M13 Reverse (-27) 5'-GGA AAC AGC TAT GAC CAT G-3'
2 M13 Forward (-41) 5'-GGT TTT CCC AGTC ACG AC-3'
3 M13 Forward (-20) 5'-GTA AAA CGA CGG CCA GTG-3'
4 M13 Forward (-21) 5'-TGT AAA ACG ACG GCC AGT-3'
5 M13 Reverse (-48) 5'-AGC GGA TAA CAA TTTC ACA C-3'
6 SP6 5'-TAC GAT TTA GGT GAC ACT ATA G-3'
7 T3 5'-CAA TTA ACC CTC ACT AAA GG-3'
8 T7 5'-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3'
9 T7 EEV 5'-ATGTCGTAATAACCCCGCCCCG-3'
10 T7 Reverse 5'-TAGTTATTGCTCAGCGGTGG-3'
11 T7 Term 5'-GCT AGT TAT TGC TCA GCG G-3'
12 pBluescript KS 5'-TCG AGG TCG ACG GTA TC-3'
 13 pBluescript SK 5'-CGC TCT AGA ACT AGT GGA TC-3'
14 3'pGEX 5'-CCG GGA GCT GCA TGT GTC AGA GG-3'
15 5'pGEX 5'-GGG CTG GCA AGC CAC GTT TGG TG-3'
16 GST-Tag 5'-ACC CAA TGT GCC TGG ATG CG-3'
17 pTrcHis-Forward 5'-GAG GTA TAT ATT AAT GTA TCG-3'
18 pTrcHis-Reverse 5'-GAT TTA ATC TGT ATC AGG
19 CMV-Forward 5'-CGC AAA TGG GCG GTA GGC GTG-3'
20 CMV-Reverse 5'-AGT AGG AAA GTC CCG TAA GG-3'
21 EGFP-C 5'-CAT GGT CCT GCT GGA GTT CGT G-3'
22 EGFP-N 5'-CGT CGC CGT CCA GCT CGA CCA-3'
23 BGH-Reverse 5'-TAG AAG GCA CAG TCG AGG-3'
24 pQEproseq 5'-CCC GAA AAG TGC CAC CTG-3'
25 pQErevseq 5'-GTT CTG AGG TCA TTA CTG G-3'
26 Intein Forward 5'-CCC GCC GCT GCT TTT GCA CGT GAG-3'
27 5'-pBabe-Seq 5'-CTT TAT CCA GCC CTC AC-3'
28 3'-pBabe-Seq 5'-ACC CTA ACT GAC ACA CATT CC-3'
29 -96 glll Sequencing Primer 5'-CCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3'
30 GAL1 Forward 5'-AAT ATA CCT CTA TAC TTT AAC GTC-3'
31 pBAD Forward 5'-ATG CCA TAG CAT TTT TAT CC-3'
32 pBAD Reverse 5'-GAT TTA ATC TGT ATC AGG
33 pTRE 3' 5'-CCA CAC CTC CCC CTG AAC-3'
34 pTRE 5' 5'-CGC CTG GAG ACG CCA TCC-3'
35 pYESTrp Forward 5'-GAT GTT AAC GAT ACC AGC C-3'
36 pYESTrp Reverse 5'-GCG TGA ATG TAA GCG TGA C-3'
37 RVprimer3 5'-CTA GCA AAA TAG GCT GTC CC-3'
38 Rvprimer4 5'-GAC GAT AGT CAT GCC CCG CG-3'
39 GLprimer 1 5'-TGT ATC TTA TGG TAC TGT AAC TG-3'
40 GLprimer 2 5'-CTT TAT GTT TTT GGC GTC TTC CA-3'
41 SeqL-A (ATTL1) 5'-GCG AGA GTA GGG AAC TGC-3'
42 SeqL-B (ATTL2) 5'-AAC ATC AGA GAT TTT GAG ACA C-3'
43 SV40-pArev 5'-CCT CTA CAA ATG TGG TAT GG-3'
44 SV40-Promoter 5'-GCC CCT AAC TCC GCC CAT CC-3'
45 U6 Primer 5'-GGG CAG GAA GAG GGC CTA T-3'
46 Xpress Forward 5'-TAT GGC TAG CAT GAC TGG T-3'
47 EBV-Rev primer 5'-GTG GTT TGT CCA AAC TCA TC-3'
48 hU6-01 5'-GAG GGC CTA TTT CCC ATG ATT-3'
49 hU6-02 5'-TAA TTA GAA TTA ATT TGA CT-3'

Contoh primer untuk mengamplifikasi sekuen gen 16S rRNA (7F-149R), gen spesifik
pengidentifikasi spesies bakteri. Primer universal 16S rRNA merupakan suatu jenis RNA yang
digunakan untuk produksi protein. Gen 16S rRNA berupa polinukleotida besar yang berukuran
1500- 2000 pasangan basa dan merupakan bagian dari subunit kecil dari ribosom serta penting
dalam proses translasi. Teknik RNA ribosomal merupakan teknik yang paling sering digunakan
sebagai penanda molekuler. Sekuen gen 16S rRNA dapat digunakan untuk identifikasi bakteri
yang mengalami penyimpangan strain fenotip.

4. Primer spesifik gen (gene-specific primers)

Primer spesifik gen adalah komponen PCR dan qPCR siap pakai yang memungkinkan
deteksi gen tertentu. Set oligonukleotida siap pakai ini biasanya berpasangan, termasuk primer
maju dan mundur. Dalam menghilangkan langkah merancang urutan primer secara manual untuk
gen yang menarik, primer ini dapat mempercepat eksperimen molekuler dalam ekspresi gen dan
dalam mendeteksi biomarker, mikroba, dan virus.

Berikut contoh Primer spesifik gen :

5. Primer degenerate
Degenerate primer dipergunakan apabila sekuen DNA template tidak diketahui dengan
pasti. Degenerate primer tidak spesifik, tapi sangat sensitif. Primer yang mengalami degenerasi
didefinisikan sebagai: “Campuran sekuens oligonukleotida di mana beberapa posisi mengandung
sejumlah basis yang memungkinkan, memberikan populasi primer dengan sekuens serupa yang
mencakup semua kemungkinan kombinasi nukleotida untuk sekuens protein tertentu”.
Sebagai contoh:
ATCGTT [GC] AAGT [AGC] ATC
mengacu pada serangkaian primer di mana nukleotida ketujuh dan kedua belas mengalami
degenerasi. Jumlah degenerasi ditentukan oleh jumlah kombinasi primer yang berbeda dalam
campuran. Contoh di atas memiliki nilai degenerasi enam.
Berikut contoh Degenerate primer :
 Hal Yang Perlu Dihindari Dalam Desing Primer

Keberhasilan dalam melakukan analisis PCR (Polimerase Chain Reaction)  sangat

ditentukan dari primer yang digunakan. Perancangan/desain primer harus memperhatikan
beberapa hal agar hasil PCR (Polimerase Chain Reaction) sesuai dengan target yang diinginkan.
Adapun hal-hal yang harus diperhatikan dalam mendesain primer adalah sebagai berikut :

a. Panjang Primer PCR

Primer PCR idealnya memiliki panjang antara 18 sampai 30 oligonukleotida. Panjang

tersebut diharapkan cukup untuk dapat mengikat DNA template pada suhu annealing dan
mendapatkan sequen yang spesifik. Panjang primer ideal berkisar 18 -30 basa didasarkan pada
pertimbangan kombinasi acak yang mungkin ditemukan pada satu urutan genom. Probabilitas
menemukan 1 basa A, G, C atau T pada satu basa adalah 1/4 (4-1), probabilitas menemukan 2
urutan basa nitogen (AG, AC, CG, dll) adalah 1/16 (4 -2), probabilitas menemukan 4 urutan basa
nitrogen (ACGT, CGAT, dll) adalah 1/256 (4 -4). Sehingga 17 basa primer secara statistik akan
ditemukan sekali dalam setiap 417 urutan basa nitrogen. Penggunaan primer lebih dari 30 basa
tidak disarankan karena tidak akan menunjukkan spesifisitas yang lebih tinggi. Selain itu, primer
PCR yang terlalu panjang dapat berakibat terhibridasi dengan primer lain sehingga tidak terjadi
polimerisasi DNA.

b. Primer Melting Temperature (Tm)

Primer Melting Temperature (Tm) adalah  suhu  yang diperlukan oleh primer PCR untuk
mengalami disosiasi / lepas ikatan. Idealnya, Tm berkisar antara 52-58 oC. Primer PCR dengan
Tm yang terlalu tinggi  akan mengurangi efektifitas anealing sehingga proses amplifikasi DNA
kurang berjalan baik. Sedangkan Tm yang terlalu rendah menyebabkan primer menempel
ditempat lain sehingga menghasilkan produk yang tidak spesifik. Terdapat beberapa rumus yang
dipakai untuk menentukan Tm suatu primer, salah satunya adalah Rumus Wallace. Rumus
Wallace merupakan rumus yang sering dipakai karena perhitungannya cukup mudah.

Adapun perhitungan rumus Wallace adalah sebagai berikut :

Tmw (P) = (nG + nC) *4 + (nA+nT) *2

Keterangan :                  
Tmw (P)      = Suhu Tm berdasarkan rumus Wallace                    
nG            = Jumlah basa nitrogen G pada primer                    
nC            = Jumlah basa nitrogen C pada primer                               
nA            =  Jumlah basa nitrogen A pada primer

c. Primer Annealing Temperatur (Ta)

Primer Annealing Temperature (Ta) merupakan suhu ideal  agar primer dapat berkaitan
dengan DNA template dengan stabil. Suhu annealing yang terlalu tinggi akan menyulitkan
terjadinya ikatan primer PCR sehingga menghasilkan produk PCR yang kurang efisien.
Sebaliknya, suhu anneling yang terlalu rendah menyebabkan terjadinya penempelan primer pada
DNA di tempat yang tidak spesifik.

Perhitungan Ta adalah sebagai berikut :     

Ta = 0.3 * Tm (primer) + 0.7 * Tm (produk)            

Keterangan :            
Ta                    :  Primer Annealing Temperatur            
Tm (primer)     : Tm primer PCR            
Tm (produk)    : Tm hasil PCR

d. Jumlah basa GC dalam primer PCR

Jumlah basa GC merupakan banyak basa Guanin (G) dan Sitosin (C) yang terdapat dalam
suatu primer PCR. Jumlah basa ideal dalam suatu primer adalah 40%-60%. Primer PCR dengan
jumlah GC yang rendah dapat menurunkan efisiensi proses PCR yang disebabkan karena primer
PCR tidak mampu berkompetisi untuk menempel secara efektif pada DNA template.

e. GC Clamp dalam primer PCR

GC clamp adalah jumlah basa Guanin (G) dan Sitosin (C) yang terdapat pada 5 basa
terakhir (3’). GC clamp yang bagus adalah sekitar 3 basa G atau C. Keberadaan basa G dan C
pada ujung 3’ sangat membantu terjadinya stabilitas ikatan antara primer PCR dengan DNA
template.
f. Secondary Structures dalam primer PCR

Secondary structures adalah terjadinya interaksi antar primer PCR yang menyebabkan

primer PCR tidak bisa berikatan dengan DNA template sehingga secondary Structures harus
dihindari. Secondary structures disebabkan karena antara primer atau basa dalam sebuah primer
saling komplementer  dan membentuk suatu ikatan. Ada beberapa macam  secondary structures
dari primer, yaitu :

1. Haiprin

Hairpin adalah struktur yang dibentuk oleh basis pasangan asam polynucleic antara
urutan komplementer untai tunggal baik DNA maupun RNA. Terbentuknya struktur
loop/hairpin pada primer sebaiknya dihindari, namun sangat sulit untuk memperoleh primer
tanpa memiliki struktur haripin. Hairpin pada ujung 3' dengan ΔG (energi yang dipelukan
untuk memecah struktur hairpin) = -2 kcal/mol dan hairpin internal dengan ΔG = -3 kcal/mol
masih dapat ditoleransi. Kedua primer sebaiknya tidak memiliki basa nukleotida T pada ujung
3’-nya karena dapat menyebabkan mismatch/ketidakcocokan. Banyaknya mismatch pada
ujung 3’-primer juga dapat menyebabkan hairpin.

Gambar 3. Struktur Haiprin

2. Self Dimer dalam primer PCR

Self Dimer adalah terjadinya ikatan antar primer PCR

yang sejenis. Forward primer berikatan dengan forward primer
lain atau reverse primer berikatan dengan reverse primer lain.

3. Cross Dimer dalam primer PCR

Cross Dimer adalah  terjadinya ikatan antara forward primer dan  reverse primer dalam primer
PCR.
 Daftar Pustaka

Chamoisinstitute.org(13 Januari 2020).Perbedaan Antara Primer Acak dan Oligo dT.Diakses pada
15 Oktober 2022.https://chamoisinstitute.org/difference-between-random-primers-and-oligo-dt

LSLAB Genetic Sequencing(2022).Universal Primer List.Diakses pada 15 Oktober

2022.http://www.lslabs.com/resources/universal-primer-list

Referensi Biologi(2019).Design Primer Untuk PCR (Polimerase Chain Reaction).Diakses pada

15 Oktober 2022.https://www.referensibiologi.com/2019/03/design-primer-untuk-pcr.html

Sasmito, Dinda E.K., Kurniawan.R., Muhimmah,I.(2014).Karakteristik Primer Pada Polimerase

Chain Reaction (PCR )untuk Sekuensing DNA:Mini Review.Seminar Nasional Informatika
Medis (SNIMed),V.94-97