PRAKTIKUM BIOKIMIA & BIOLOGI MOLEKULER, Laboratorium Biologi Farmasi

ANALISIS DNA & AMPLIFIKASI

DNA DENGAN METODE PCR
CAPAIAN PEMBELAJARAN PRAKTIKUM

● Melakukan analisis isolat DNA dengan Biodrop

● Menjelaskan dan memahami metode Polymerase Chain Reaction

(PCR)

● Melakukan preparasi komponen PCR

Kasus:
Anda adalah seorang apoteker yang bekerja di bagian Quality Control (QC)
industri herbal PT Herbagene yang akan melakukan pemeriksaan autentikasi
bahan baku herbal X yang akan digunakan dalam produksi sediaan Obat Herbal
Terstandar. Karakteristik herbal X tidak menunjukkan spesifitas pada hasil
pengujian morfologi, anatomi maupun kandungan kimia sehingga perlu
dilakukan pengujian karakterisasi DNA. Hasil isolasi DNA menunjukkan
kualitas yang murni (A260/A280= 1,85) dengan konsentrasi 100 μg/ml,
sehingga dapat dilakukan amplifikasi DNA dengan Polymerase Chain Reaction
(PCR).

Instruksi Praktikan:
Buatlah skema kerja amplifikasi DNA dengan PCR
Berapa melting temperature (Tm) untuk setiap jenis primer pada PCR?
Berapa jumlah molekul primer, jika konsentrasi primer untuk PCR yang
diinginkan adalah 0,5 µM , volume reaksi PCR = 100 µL?
Berapa volume larutan stok primer yang harus dipipet ke dalam tabung
reaksiminggu
Praktikum PCR 100 µL, Amplifikasi
ke-12, jika konsentrasi larutan
DNA dengan stok
PCR, FF primer untuk
Universitas PCR adalah
Surabaya
 LEMBAR HASIL PENGUJIAN

Kondisi Amplifikasi DNA dengan Polymerase Chain Reaction (PCR)

Komposisi PCR:
Reaksi PCR (total volume 25 μl) menggunakan 1x buffer PCR yang mengandung
75mM Tris, pH 8,8; 20mM (NH4)2SO4; 1,5 mM MgCl2; 0,01% Tween 2; masing-
masing dNTPs 0,2 mM, 10 ng//μL DNA isolat, primer forward dan reverse masing-
masing sebanyak 0,4 μM (jenis primer ada pada Tabel 1.), dan Taq DNA
polymerase 10 U/μL.

Tabel 1. Jenis Primer yang Digunakan untuk Amplifkasi DNA Herbal X

No Primer Arah Urutan Primer (5’-3’) DNA Suhu
Primer ampliko Annealing
n (bp) (°C)

1 Pgi_F1 Forward GGCAGTTGGCTAATGAAAGGTTGTA 88 64

Panax_R1 Reverse AAGCACCGCTATGCGCGAA

2 Pgi_SPF1 Forward TGTCGGGCAAGGCCAAAAATG 121 64

Panax_R1 Reverse AAGCACCGCTATGCGCGAA

3 Panax_F1 Forward GGTGCTTTGAGTGCTGCTGA 191 64

Panax_R1 Reverse AAGCACCGCTATGCGCGAA

4 Pgi_F2 Forward TGAAAGGTTGTAATAGTTT 249 48

Pgi_R1 Reverse AATGAAAAGGAATGAAAG

5 Pgi_F3 Forward ACGGTTGCTTTTCCATCATTGTGT 311 64

Panax_R1 Reverse AAGCACCGCTATGCGCGAA

Program PCR:
Amplifikasi dengan PCR dilakukan sebanyak 35 siklus dengan tahapan sebagai
berikut: Proses denaturasi pada suhu 95°C selama 30 detik, proses penempelan
pada suhu annealing sesuai jenis primer pada Tabel 1. selama 20 detik, dan
proses pemanjangan pada suhu 72°C selama 30 detik. Tahap dilanjutkan dengan
final extension pada 72°C selama 5 menit.

LEMBAR KERJA
Kelompok: E4

2
 Nama NRP
1. A. Soni Abimanyu 110119354
2. Jannati Ong W 110122092
3. Fiona Ng 110122168
4. Dinda Assyfa Putri Santoso 110122184
5. Vernon Daren J. Pattipeilohy 110122243
6. - -

Skema Kerja Amplifikasi DNA Herbal X dengan PCR:

Rancanglah skema kerja amplifikasi DNA Herbal X dengan PCR

Perkiraan Suhu Annealing tiap Primer:

3
Tuliskan hasil perhitungan melting temperature (Tm) tiap jenis primer di Tabel 1,
berdasarkan perhitungan pada OligoAnalyzer. Sertakan screenshoot nilai TM di
salah satu pasang primer.
(https://www.idtdna.com/pages/tools/oligoanalyzer)

Primer 1:
● Forward = 65.3°C

● Reverse = 67.1 °C

Hasil Screenshoot nilai TM:

Forward:

Reverse:

4
Primer 2:
● Forward = 66.1°C

● Reverse =67.1 °C
Hasil Screenshoot nilai TM:
Forward:

Reverse:

5
Primer 3:
● Forward = 65,1 °C

● Reverse = 67,1 °C

Hasil Screenshoot nilai TM:

6
Primer 4:
● Forward = 52,1 °C

● Reverse = 50,6 °C
Hasil Screenshoot nilai TM:

7
Primer 5:
● Forward = 65,7°C

● Reverse = 67,1°C
Hasil Screenshoot nilai TM:

Perhitungan Konsentrasi PRIMER

1. Berapa jumlah molekul primer, jika konsentrasi primer untuk PCR yang
diinginkan adalah 0,5 µM , volume reaksi PCR = 100 µL?

Ekivalensi Konsentrasi:

8
0,5 µM x 100µL = 0,5 pmol/ µL
0,5pmol/µL x 100 µL = 50 pmol*

2. Berapa volume larutan stok primer yang harus dipipet ke dalam tabung
reaksi PCR 100 µL, jika konsentrasi larutan stok primer untuk PCR adalah
10 pmol/ µL (10 µM), konsentrasi primer untuk PCR adalah 0,1 µM,?

Rumus Perhitungan:

Larutan stok Campuran Reaksi PCR

(V1.M1) = (V2.M2)

Volume stok µL . Konsentrasi stok = Volume reaksi µL . Konsentrasi primer dalam PCR µM
x . 10 pmol/ µL = 100 µL . 0,1 µM
x . 10 pmol/ µL = 10
x=1
jadi volume stock primer yg harus dipipet adalah 1 µL

9
Pencampuran Komponen PCR

Laporkan dokumentasi tahap-tahap pencampuran komponen PCR sesuai urutan

dalam praktikum.

1. —------->
PCR MIX 12,5 µL PCR MIX setelah Ditambahkan pada tabung PCR kosong

2. -------->
Primer 2,3 µL primer setelah ditambahkan pada tabung yang berisi Pcr MIx

3.

Setelah ditambahkan DNA Template 1 µL

10
 4. ------------------------>

Nuclease-free Water 9 μl setelah ditambahkan WFH

5. ------>

Dilakukan Thermolyne Setelah Thermolyne dilakukan centrifuge

selama 3 detik selama 3 detik

11
 6.

Setelah itu lalu PCR diletakkan pada BIO-RAD

Analisis Isolat DNA dengan Biodrop

Laporkan dokumentasi tahap-tahap analisis DNA dengan Biodrop sesuai urutan

dalam praktikum.

Tahap 1:

----->

Diambil DNA isolat 1µL. Diteteskan ke Biodrop µLite

--------------->

Amati Absorbansi pada lambda Biodrop µLite dicuci dengan

260 nm dan 280 nm nuclease-free water

Tahap2 :

12
 ------>

Diambil DNA isolat 1µL. Diteteskan ke Biodrop µLite

--->

Amati Absorbansi pada lambda Biodrop µLite dicuci dengan

260 nm dan 280 nm nuclease-free water

Tahap 3:

------->

Diambil DNA isolat 1µL. Diteteskan ke Biodrop µLite

13
 ------->

Amati Absorbansi pada lambda Biodrop µLite dicuci dengan

260 nm dan 280 nm nuclease-free water

Hasil analisis DNA: (dilakukan 3 kali oleh mahasiswa yang berbeda, hitung rata-
rata dan RSD. RSD = SD/rata-rata x 100%)

1. Hasil Screenshoot pembacaan Biodrop

2. a. Kualitas DNA = (1,421 + 1,386 + 1,381) : 3 = 1,396

14
 b. Kuantitas DNA = (175.6 + 145.0 + 136.5) : 3 = 61.36

1. Sebutkan fungsi masing-masing komponen PCR!

● DNA template
DNA template (DNA cetakan) mengandung urutan (sequence) target yang
akan diamplifikasi, dimana DNA cetakan dapat berasal dari DNA
kromosom, DNA plasmid, DNA mitokondria, atau produksi hasil
amplifikasi sebelumnya
● Primer
Primer atau Oligonukleotida, biasanya 1 pasang yaitu forward dan reseve,
yang mengarahkan sintesis DNA atau perpanjangan rantai DNA pada
urutan yang spesifik. Primer akan berkaitan dengan urutan DNA target
yang spesifik dan diperpanjang oleh DNA polimerase hingga membentuk
rantai yang komplementer dengan rantai DNA cetakan
● DNA Polimerase
DNA polimerase berfungsi mengkatalis reaksi polimerase DNA yang
berlangsung dari ujung 5’ ke 3’ sehingga untai DNA yang baru dapat
dihasilkan seperti halnya proses replikasi DNA secara alami
● Buffer
Buffer adalah larutan yang berfungsi untuk menjaga keseimbangan

2. Pada pencampuran komponen PCR, tahap apakah yang paling menentukan

keberhasilan PCR?
Keberhasilan proses PCR dipengaruhi oleh beberapa faktor seperti suhu dan
waktu penempelan oligonukleotida primer

15
16