Analisis Data RAPD

Hasil amplifikasi DNA (PCR) yang didapatkan pada praktikum sebelumnya

adalah fragmen DNA hasil PCR acak menggunakan primer RAPD. Sehingga analisis
hasil PCRnya juga merupakan analisis fingerprinting DNA untuk melihat hubungan
kekerabatan menggunakan metode RAPD. Pita-pita yang timbul pada agarose
merupakan representasi dari fragmen DNA yang teramplifikasi. Setiap pita yang
terbentuk pada agarose mempunyai panjang DNA yang berbeda. Panjang urutan basa
DNA dapat diketahui dengan membandingkan jarak migrasi DNA yang standar
digunakan. Grafik log panjang basa standar DNA terhadap jarak migrasi,
menghasilkan persamaan regresi. Persamaan regresi selanjutnya digunakan untuk
menjadi acuan dasar menentukan panjang fragmen DNA pada setiap pita yang
muncul.

Data kualitatif didapatkan dari pita-pita yang tervisualisasi dan tidak

tervisualisasi. Data tersebut dikuantifikasi dalam bentuk matriks biner. Pita yang
terlihat memiliki arti numerik satu (1) dan pita yang tidak terlihat memiliki arti
numerik nol (0). Pita yang dapat dianalisis merupakan pita yang dapat dibedakan
secara nyata dengan menggunakan bantuan computer. Pita-pita tersebut ditampilkan
dalam matriks biner dan selanjutnya akan dianalisis untuk mencari hubungan
kekerabatan sampel ikan uji.

Hubungan kekerabatan dapat diketahui dengan menghitung indeks kesamaan

menggunakan program Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System
(NTSYS) pada komputer. Hasil yang diperoleh berupa diagram pohon kekerabatan
(Phylogenetic tree). Berikut ini merupakan langkah-langkah yang ditempuh untuk
mendapatkan pohon kekerabatan dari gabungan analisis beberapa software
diantaranya CorelDraw X7, Microsoft Excel dan NTSYSpc 2.02.

Tahapan analisis data

1) Tahap Microsoft Word atau Corel Draw
a. Masukan terlebih dahulu data data yang sudah ditentukan berdasarkan
kelompok dan kelas ke dalam microsoft word atau corel draw.
b. Setelah data berupa foto tersebut dimasukkan ke microsoft word atau
correl draw, Tarik foto ke atas atau ke bawah (perpanjang ukuran foto),
caranya tinggal ditarik foto tersebut dengan kursor. Tujuannya untuk
mempermudah pembacaan data.
c. Buat garis garis secara manual pada pita dalam setiap data yang
diambil (garis horizontal dan vertikal mengikuti garis pada data).
d. Warnai garis yang telah dibuat untuk mempermudah proses analisis.
e. Buat garis pada sumur datanya.
f. Tarik garis dari sumur ke pita lalu warnai dengan warna hitam. Cek
ukurannya contoh dari data pada video tingginya 15,3 cm dan lebarnya
0.
g. Save file.
2) Tahap-tahap pada Microsoft Excel:
a. Buka aplikasi microsotf excel.
b. Buat tabel dengan format yang sudah ditampilkan yang berbeda hanya
sampel datanya saja.
c. Ukur jarak antara pita dan sumur pada masing masing sampel lalu
ukuran tersebut ubah dari cm ke mm.
d. Mengubah pita-pita yang telah tersedia pada microsotf word mejadi
bentuk binner dengan cara melihat keberadaan pita pada masing-
masing sampel, jika terdapat pita maka masukan angka 1 pada excel
dan lihat apakah ada pita lain yang sejajar dengan pita tersebut, jika
tidak ada maka tulis angka 0 dan begitupun seterusnya. Data pita
tersebut harus sinkron dengan data jarak dari suur ke pita.
e. Menghitung nilai BP dengan cara melihat jarak pita dengan sumur
yang berdasarkan data atau standar yang ada (standar yang ada di
video adalah standar yang telah ditetapkan oleh perusahaan).
f. Menghitung nilai log BP dengan rumus =log (jarak fragmen)→ enter.
g. Membuat tabel baru yang letaknya berada di sebelah kanan tabel awal
dengan format jarak fragmen, log BP dan ukuran BP.
 h. Untuk menentukan ukuran BP dengan cara =log BP^10.
i. Membuat diagram dengan cara blok jarak fragmen dan log BP → klik
scatter → klik tanda panah di kanan atas tabel → klik Trendline →
klik more option → klik display equation on chart → klik display R-
squared value on chart.
j. Arti R2 = apabila nilainya semakin mendekati satu (1) maka nilainya
mendekati benar.
k. Mengubah data menjadi pohon dengan cara Klik kanan di sheet
manapun→ Klik move or copy →Pilih new book dan klik arahan di
bawah kolom → Klik ok.
l. Hapus tabel nilai bp logbp jarak fragmen sampai ukuran pita.
m. Tulis angka 1 di atas jarak fragmen.
n. Klik 11 di pinggir kanan angka 1 yang merupakan jumlah baris dari
jarak fragmennya.
o. Tulis 11 lagi di sebelah kanan 11 yang tadi yang menandakan jumlah
data sampel kita.
p. Save di laptop masing masing dengan nama Test_B_OPA → pilih
jenis dokumennya excel 97-2003 workbook.
3) Tahap-tahap pada Aplikasi NTSYS:
a. Buka file NTSYS yang telah didownload
b. Klik proram → klik ntedit (membuka ntedid harus memakai NTSYS
2.03i) → klik file→ klik import excel → pilih file yang sebelumnya
telah disiapkan → klik file → klik save file as → beri nama
test_B_opa32
c. Klik program → klik NSYS 2.11a → klik ntsys → pilih similarity →
klik qualitative data → input file harus klik 2 kali → coefficient pilih
DICE →Output data renama lagi jadi Test_B_OPA 3 → klik compute
d. Klik SAHN → input file dengan cara klik 2 kali → output file diubah
nama lagi menjadi Test_B_OPA 4 → in case of trees pilih find → klik
compute → klik overwrite
e. Klik tombol kiri bawah lalu data kita akan terinpretasikan dalam
bentuk pohon.
f. Untuk menyempurnakannya kita klik option → klik plot option → klik
options→ klik x-Axis→ ubah Min menjadi 0,00→ klik ok
g. Selesai.