DESAIN PRIMER

PRIMER BLAST NCBI

Nama :
NIM : P3.73.34.2.21.05
Kelompok : 10

A. Tujuan pembelajaran praktikum

Setelah mengikuti kegiatan praktikum ini, mahasiswa mampu:

1. Mendesain primer menggunakan primer BLAST

2. Menganalisis kesesuaikan kandidat primer dengan kriteria primer

B. Pendahuluan
Desain primer merupakan salah satu proses yang dilakukan untuk memperoleh primer yang
sesuai dengan target amplifikasi pada PCR. Primer yang diperoleh kemudian dievaluasi dengan
kriteria meliputi panjang primer, panjang amplikon, konten G/C, GC clamps, runs, repeats, dan
struktur sekunder (hairpin, self-dimer, cross-dimer). Desain primer dapat dilakukan dengan
program berbasis website seperti Primer Blast atau primer3. Program-program tersebut telah
dilengkapi dengan fitur untuk melakukan analisa secara bioinformatika terkait primer yang
dirancang.

C. Metode Praktikum
Pada praktikum ini, praktikan diminta melakukan desain primer terhadap gen yang telah
ditetapkan sesuai kelompok praktikum, kemudian melengkapi informasi yang diminta. Berikut
uraian pembagian gen untuk setiap kelompok praktikum.

Kelompo Gen Spesies Titik Mutasi

k
Kel. 1 EGFR Homo sapiens Exon 1, titik 270
Kel. 2 JAK2 Homo sapiens posisi basa 1000
Kel. 3 BRAF Homo sapiens posisi basa 250
Kel. 4 BRCA1 Homo sapiens posisi basa 150
Kel. 5 BRCA2 Homo sapiens posisi basa 1000
Kel. 6 rpoB Mycobacterium tuberculosis posisi basa 500
Kel. 7 pncA Mycobacterium tuberculosis posisi 500 (amplifikasi keseluruhan)
Kel. 8 parC Salmonella typhi posisi 230-330
 DESAIN PRIMER
PRIMER BLAST NCBI

Kel. 9 gyrA Salmonella typhi posisi 1000

Kel. 10 gyrB Salmonella typhi posisi 1000

Desain Primer
1. Temukan GenBank record terkait gen target
 DESAIN PRIMER
PRIMER BLAST NCBI

2. Akses program Primer BLAST melalui halaman GenBank record dengan mengklik menu
pick primers

3. Setelah berpindah pada halaman Primer-BLAST, gunakan setting default yang ada,
kecuali pada ‘# of primers to return’ disesuaikan menjadi 5. Selain itu, rentang target
primer forward dan reverse juga disesuaikan dengan target masing-masing titik mutase.
 DESAIN PRIMER
PRIMER BLAST NCBI

4. Kemudian centang ‘show results in a new window’ yang berada di bawah halaman dan
klik ‘Get Primers’

5. Perhatikan hasil yang diterima dan lakukan pengecekan terhadap kriteria primer
 DESAIN PRIMER
PRIMER BLAST NCBI

Kriteria Primer Kondisi Optimal

Panjang primer 18-24 bp
Panjang amplikon 300-1000bp (menyesuaikan target amplifikasi)
Konten G/C 40-60%
Tm (suhu melting) 52-60 derajat Celcius
Self-complementary (homodimer) > -5 kcal/mol
Self-3’ complementary (hairpins) > -2 kcal/mol
Ada produk non-spesifik Tidak ada

Hasil Analisis Primer

 DESAIN PRIMER
PRIMER BLAST NCBI
A. Primer Pair 1
Forward Primer : 5’ GCTCGACAATTTCCGGCATC 3’
Reverse Primer : 5’ AGTACAACCCGGACAAGCTG 3’

No. Kriteria Primer Kondisi Optimal Hasil

Forward Reverse

1. Panjang primer 18-24 bp 20 bp 20 bp

2. Panjang amplikon 300-1000bp 126 bp

(menyesuaikan
target amplifikasi)

3. Konten G/C 40-60% 55% 55%

4. Tm (suhu melting) 52-60°C 59.97°C 59.97°C

5. Perbedaan TM < 5 °C 0° C

6. Self-complementary > -5 kcal/mol 4 kcal/mol 4 kcal/mol

(homodimer)

7. Self-3’ complementary > -2 kcal/mol 1 kcal/mol 2 kcal/mol

(hairpins)

8. Ada produk non-spesifik Tidak ada Ada Ada

9. Run 4 (ATC GGGGATT) <4 <4

10. Repeat 4 (ATATATAT) 0 0

Catatan : 1. Tulisan yang diblok merupakan syarat yang tidak memenuhi kriteria ideal
 DESAIN PRIMER
PRIMER BLAST NCBI
primer
2. Terdapat keterangan “Produk on Potentially Unintended Templates ” pada
primer yang ditemukan

B. Primer Pair 2
Forward Primer : 5’ CAGCTTGTCCGGGTTGTACT 3’
Reverse Primer : 5’ GTCCGAACTGTACCTGGTGG 3’

No. Kriteria Primer Kondisi Optimal Hasil

Forward Reverse

1. Panjang primer 18-24 bp 20 bp 20 bp

2. Panjang amplikon 300-1000bp 214 bp

(menyesuaikan
target amplifikasi)

3. Konten G/C 40-60% 55% 60%

4. Tm (suhu melting) 52-60°C 59.97°C 60.04°C

5. Perbedaan TM < 5 °C 0.07°C

6. Self-complementary > -5 kcal/mol 4 kcal/mol 4 kcal/mol

(homodimer)

7. Self-3’ complementary > -2 kcal/mol 2 kcal/mol 2 kcal/mol

(hairpins)

8. Ada produk non-spesifik Tidak ada Ada Ada

9. RUN 4 (ATC GGGGATT) 2-3 2

 DESAIN PRIMER
PRIMER BLAST NCBI

10. REPEAT 4 (ATATATAT) 0 0

Catatan : 1. Tulisan yang diblok merupakan syarat yang tidak memenuhi kriteria ideal
primer
2. Terdapat keterangan “Produk on Potentially Unintended Templates ” pada
primer yang ditemukan

C. Primer Pair 3
Forward Primer : 5’ CTTCACTTTGTACAGCGGCG 3’
Reverse Primer : 5’ GCGCTTCGACAAGATGCTTT 3’

No. Kriteria Primer Kondisi Optimal Hasil

Forward Reverse

1. Panjang primer 18-24 bp 20 bp 20 bp

2. Panjang amplikon 300-1000bp 247 bp

(menyesuaikan
target amplifikasi)

3. Konten G/C 40-60% 55% 50%

4. Tm (suhu melting) 52-60°C 59.84 °C 59.83°C

5. Perbedaan TM < 5 °C 0.01°C

6. Self-complementary > -5 kcal/mol 6 kcal/mol 4 kcal/mol

 DESAIN PRIMER
PRIMER BLAST NCBI

(homodimer)

7. Self-3’ complementary > -2 kcal/mol 3 kcal/mol 2 kcal/mol

(hairpins)

8. Ada produk non-spesifik Tidak ada Ada Ada

9. RUN 4 (ATC GGGGATT) 2-3 2

10. REPEAT 4 (ATATATAT) 0 2

Catatan : 1. Tulisan yang diblok merupakan syarat yang tidak memenuhi kriteria ideal
primer
2. Terdapat keterangan “Produk on Potentially Unintended Templates ” pada
primer yang ditemukan

D. Primer Pair 4
Forward Primer : 5' AAGAAGGTCAACAGCAGCGT 3'
Reverse Primer : 5' TCCGAACTGTACCTGGTGGA 3'

No. Kriteria Primer Kondisi Optimal Hasil

Forward Reverse

1. Panjang primer 18-24 bp 20 bp 20 bp

2. Panjang amplikon 300-1000bp 290 bp

(menyesuaikan
target amplifikasi)

3. Konten G/C 40-60% 50.00 % 55.00 %

 DESAIN PRIMER
PRIMER BLAST NCBI

4. Tm (suhu melting) 52-60°C 60.18 °C 60.18 °C

5. Perbedaan TM < 5 °C 0 °C

6. Self-complementary > -5 kcal/mol 3 kcal/mol 5 kcal/mol

(homodimer)

7. Self-3’ complementary > -2 kcal/mol 3 kcal/mol 3 kcal/mol

(hairpins)

8. Ada produk non-spesifik Tidak ada ada ada

9. RUN 4 (ATC GGGGATT) 2 2

10. REPEAT 4 (ATATATAT) 0 0

Catatan : 1. Tulisan yang diblok merupakan syarat yang tidak memenuhi kriteria ideal
primer
2. Terdapat keterangan “Produk on Potentially Unintended Templates ” pada
primer yang ditemukan

E. Primer Pair 5
Forward Primer : 5’ TTGTCCGGGTTGACTCGTC 3’
Reverse Primer : 5’ TACCTGCTGGAAGGACTC 3’

No. Kriteria Primer Kondisi Optimal Hasil

Forward Reverse

1. Panjang primer 18-24 bp 20bp 20bp

 DESAIN PRIMER
PRIMER BLAST NCBI

2. Panjang amplikon 300-1000bp 200bp

(menyesuaikan
target amplifikasi)

3. Konten G/C 40-60% 55% 60%

4. Tm (suhu melting) 52-60°C 59.69 °C 60.25 °C

5. Perbedaan TM < 5 °C 0.56°C

6. Self-complementary > -5 kcal/mol 4 kcal/mol 5 kcal/mol

(homodimer)

7. Self-3’ complementary > -2 kcal/mol 1 kcal/mol 3 kcal/mol

(hairpins)

8. Ada produk non-spesifik Tidak ada Ada Ada

9. Run 4 (ATC GGGGATT) 2-3 2

10. Repeat 4 (ATATATAT) 0 0

Catatan : 1. Tulisan yang diblok merupakan syarat yang tidak memenuhi kriteria ideal
primer
2. Terdapat keterangan “Produk on Potentially Unintended Templates ” pada
primer yang ditemukan

D. Hasil Praktikum
1 Range target primer yang
digunakan pada Primer-
BLAST
2 Primer yang ditemukan Primer 1
Primer 2
Primer 3
Primer 4
Primer 5
3 Primer yang terpilih Tidak ada primer yang memenuhi kriteria
 DESAIN PRIMER
PRIMER BLAST NCBI
sehingga tidak layak digunakan untuk PCR