DESAIN PRIMER

PRIMER BLAST NCBI

Nama : Widi Dwi Kuncoro

NIM : P3.73.34.2.21.051
Kelompok : 10

A. Tujuan pembelajaran praktikum

Setelah mengikuti kegiatan praktikum ini, mahasiswa mampu:

1. Mendesain primer menggunakan primer BLAST

2. Menganalisis kesesuaikan kandidat primer dengan kriteria primer

B. Pendahuluan
Desain primer merupakan salah satu proses yang dilakukan untuk memperoleh primer yang
sesuai dengan target amplifikasi pada PCR. Primer yang diperoleh kemudian dievaluasi dengan
kriteria meliputi panjang primer, panjang amplikon, konten G/C, GC clamps, runs, repeats, dan
struktur sekunder (hairpin, self-dimer, cross-dimer). Desain primer dapat dilakukan dengan
program berbasis website seperti Primer Blast atau primer3. Program-program tersebut telah
dilengkapi dengan fitur untuk melakukan analisa secara bioinformatika terkait primer yang
dirancang.

C. Metode Praktikum
Pada praktikum ini, praktikan diminta melakukan desain primer terhadap gen yang telah
ditetapkan sesuai kelompok praktikum, kemudian melengkapi informasi yang diminta. Berikut
uraian pembagian gen untuk setiap kelompok praktikum.

Kelompok Gen Spesies Titik Mutasi

Kel. 1 EGFR Homo sapiens Exon 1, titik 270
Kel. 2 JAK2 Homo sapiens posisi basa 1000
Kel. 3 BRAF Homo sapiens posisi basa 250
Kel. 4 BRCA1 Homo sapiens posisi basa 150
Kel. 5 BRCA2 Homo sapiens posisi basa 1000
Kel. 6 rpoB Mycobacterium tuberculosis posisi basa 500
Kel. 7 pncA Mycobacterium tuberculosis posisi 500 (amplifikasi keseluruhan)
Kel. 8 parC Salmonella typhi posisi 230-330
 DESAIN PRIMER
PRIMER BLAST NCBI
Kel. 9 gyrA Salmonella typhi posisi 1000
Kel. 10 gyrB Salmonella typhi posisi 1000

Desain Primer
1. Temukan GenBank record terkait gen target
 DESAIN PRIMER
PRIMER BLAST NCBI
2. Akses program Primer BLAST melalui halaman GenBank record dengan mengklik menu pick
primers

3. Setelah berpindah pada halaman Primer-BLAST, gunakan setting default yang ada, kecuali
pada ‘# of primers to return’ disesuaikan menjadi 5. Selain itu, rentang target primer
forward dan reverse juga disesuaikan dengan target masing-masing titik mutase.
 DESAIN PRIMER
PRIMER BLAST NCBI

4. Kemudian centang ‘show results in a new window’ yang berada di bawah halaman dan klik
‘Get Primers’

5. Perhatikan hasil yang diterima dan lakukan pengecekan terhadap kriteria primer
 DESAIN PRIMER
PRIMER BLAST NCBI

Kriteria Primer Kondisi Optimal

Panjang primer 18-24 bp
Panjang amplikon 300-1000bp (menyesuaikan target amplifikasi)
Konten G/C 40-60%
Tm (suhu melting) 52-60 derajat Celcius
Self-complementary (homodimer) > -5 kcal/mol
Self-3’ complementary (hairpins) > -2 kcal/mol
Ada produk non-spesifik Tidak ada

Hasil Analisis Primer

A. Primer Pair 1
Forward Primer : 5’ GCTCGACAATTTCCGGCATC 3’
Reverse Primer : 5’ AGTACAACCCGGACAAGCTG 3’

No. Kriteria Primer Kondisi Optimal Hasil

Forward Reverse
 DESAIN PRIMER
PRIMER BLAST NCBI

1. Panjang primer 18-24 bp 20 bp 20 bp

2. Panjang amplikon 300-1000bp 126 bp

(menyesuaikan
target amplifikasi)

3. Konten G/C 40-60% 55% 55%

4. Tm (suhu melting) 52-60°C 59.97°C 59.97°C

5. Perbedaan TM < 5°C 0°C

6. Self-complementary > -5 kcal/mol 4 kcal/mol 4 kcal/mol

(homodimer)

7. Self-3’ complementary > -2 kcal/mol 1 kcal/mol 2 kcal/mol

(hairpins)

8. Ada produk non-spesifik Tidak ada Ada Ada

9. Run ≤ 4 (ATCGGGGATT) <4 <4

10. Repeat ≤ 4 (ATATATAT) 0 0

Catatan : 1. Tulisan yang diblok merupakan syarat yang tidak memenuhi kriteria ideal
primer
2. Terdapat keterangan “Produk on Potentially Unintended Templates” pada
primer yang ditemukan
 DESAIN PRIMER
PRIMER BLAST NCBI
B. Primer Pair 2
Forward Primer : 5’ CAGCTTGTCCGGGTTGTACT 3’
Reverse Primer : 5’ GTCCGAACTGTACCTGGTGG 3’

No. Kriteria Primer Kondisi Optimal Hasil

Forward Reverse

1. Panjang primer 18-24 bp 20 bp 20 bp

2. Panjang amplikon 300-1000bp 214 bp

(menyesuaikan
target amplifikasi)

3. Konten G/C 40-60% 55% 60%

4. Tm (suhu melting) 52-60°C 59.97°C 60.04°C

5. Perbedaan TM < 5°C 0.07°C

6. Self-complementary > -5 kcal/mol 4 kcal/mol 4 kcal/mol

(homodimer)

7. Self-3’ complementary > -2 kcal/mol 2 kcal/mol 2 kcal/mol

(hairpins)

8. Ada produk non-spesifik Tidak ada Ada Ada

9. RUN ≤ 4 (ATCGGGGATT) 2-3 2

10. REPEAT ≤ 4 (ATATATAT) 0 0

 DESAIN PRIMER
PRIMER BLAST NCBI
Catatan : 1. Tulisan yang diblok merupakan syarat yang tidak memenuhi kriteria ideal
primer
2. Terdapat keterangan “Produk on Potentially Unintended Templates” pada
primer yang ditemukan

C. Primer Pair 3
Forward Primer : 5’ CTTCACTTTGTACAGCGGCG 3’
Reverse Primer : 5’ GCGCTTCGACAAGATGCTTT 3’

No. Kriteria Primer Kondisi Optimal Hasil

Forward Reverse

1. Panjang primer 18-24 bp 20 bp 20 bp

2. Panjang amplikon 300-1000bp 247 bp

(menyesuaikan
target amplifikasi)

3. Konten G/C 40-60% 55% 50%

4. Tm (suhu melting) 52-60°C 59.84 °C 59.83°C

5. Perbedaan TM < 5 °C 0.01°C

6. Self-complementary > -5 kcal/mol 6 kcal/mol 4 kcal/mol

(homodimer)

7. Self-3’ complementary > -2 kcal/mol 3 kcal/mol 2 kcal/mol

(hairpins)
 DESAIN PRIMER
PRIMER BLAST NCBI

8. Ada produk non-spesifik Tidak ada Ada Ada

9. RUN ≤ 4 (ATCGGGGATT) 2-3 2

10. REPEAT ≤ 4 (ATATATAT) 0 2

Catatan : 1. Tulisan yang diblok merupakan syarat yang tidak memenuhi kriteria ideal
primer
2. Terdapat keterangan “Produk on Potentially Unintended Templates” pada
primer yang ditemukan

D. Primer Pair 4
Forward Primer : 5' AAGAAGGTCAACAGCAGCGT 3'
Reverse Primer : 5' TCCGAACTGTACCTGGTGGA 3'

No. Kriteria Primer Kondisi Optimal Hasil

Forward Reverse

1. Panjang primer 18-24 bp 20 bp 20 bp

2. Panjang amplikon 300-1000bp 290 bp

(menyesuaikan
target amplifikasi)

3. Konten G/C 40-60% 50.00 % 55.00 %

4. Tm (suhu melting) 52-60°C 60.18 °C 60.18 °C

 DESAIN PRIMER
PRIMER BLAST NCBI

5. Perbedaan TM < 5 °C 0 °C

6. Self-complementary > -5 kcal/mol 3 kcal/mol 5 kcal/mol

(homodimer)

7. Self-3’ complementary > -2 kcal/mol 3 kcal/mol 3 kcal/mol

(hairpins)

8. Ada produk non-spesifik Tidak ada ada ada

9. RUN ≤ 4 (ATCGGGGATT) 2 2

10. REPEAT ≤ 4 (ATATATAT) 0 0

Catatan : 1. Tulisan yang diblok merupakan syarat yang tidak memenuhi kriteria ideal
primer
2. Terdapat keterangan “Produk on Potentially Unintended Templates” pada
primer yang ditemukan

E. Primer Pair 5
Forward Primer : 5’ TTGTCCGGGTTGACTCGTC 3’
Reverse Primer : 5’ TACCTGCTGGAAGGACTC 3’

No. Kriteria Primer Kondisi Optimal Hasil

Forward Reverse

1. Panjang primer 18-24 bp 20bp 20bp

2. Panjang amplikon 300-1000bp 200bp

 DESAIN PRIMER
PRIMER BLAST NCBI

(menyesuaikan
target amplifikasi)

3. Konten G/C 40-60% 55% 60%

4. Tm (suhu melting) 52-60°C 59.69 °C 60.25 °C

5. Perbedaan TM < 5 °C 0.56°C

6. Self-complementary > -5 kcal/mol 4 kcal/mol 5 kcal/mol

(homodimer)

7. Self-3’ complementary > -2 kcal/mol 1 kcal/mol 3 kcal/mol

(hairpins)

8. Ada produk non-spesifik Tidak ada Ada Ada

9. Run ≤ 4 (ATCGGGGATT) 2-3 2

10. Repeat ≤ 4 (ATATATAT) 0 0

Catatan : 1. Tulisan yang diblok merupakan syarat yang tidak memenuhi kriteria ideal
primer
2. Terdapat keterangan “Produk on Potentially Unintended Templates” pada
primer yang ditemukan

D. Hasil Praktikum
1 Range target primer yang
digunakan pada Primer-
BLAST
2 Primer yang ditemukan Primer 1
Forward Primer : 5’ GCTCGACAATTTCCGGCATC 3’
Reverse Primer : 5’ AGTACAACCCGGACAAGCTG 3’
 DESAIN PRIMER
PRIMER BLAST NCBI

Primer 2
Forward Primer : 5’ CAGCTTGTCCGGGTTGTACT 3’
Reverse Primer : 5’ GTCCGAACTGTACCTGGTGG 3’

Primer 3
Forward Primer : 5’ CTTCACTTTGTACAGCGGCG 3’
Reverse Primer : 5’ GCGCTTCGACAAGATGCTTT 3’

Primer 4
Forward Primer : 5' AAGAAGGTCAACAGCAGCGT 3'
Reverse Primer : 5' TCCGAACTGTACCTGGTGGA 3'

Primer 5
Forward Primer : 5’ TTGTCCGGGTTGACTCGTC 3’
 DESAIN PRIMER
PRIMER BLAST NCBI
Reverse Primer : 5’ TACCTGCTGGAAGGACTC 3’

3 Primer yang terpilih Tidak ada primer yang dipilih,dikarenakan tidak ada satupun
primer yang memenuhi standar kreteria standar.