BIOKIMIA: PENENTUAN KADAR MALONDIALDEHID DALAM DARAH Garnisa Arsyi A.

Latar Belakang Malondialdehid (MDA) adalah hasil produk alami yang terbentuk di seluruh sel mamalia sebagai produk dari peroksidasi lipid. Reactive oxygen species (ROS) mendegradasi polyunsaturated lipid untuk membentuk MDA. MDA adalah 3-karbon-dialdehid yang sangat reaktif yang merupakan hasil produksi dari peroksidasi polyunsaturated lipid dan metabolisme asam arachidonat. MDA tersedia berkombinasi dengan beberapa grup fungsional pada molekul termasuk protein, lipoprotein, dan DNA. MDA bereaksi dengan DNA untuk membentuk adduct dengan deoksiguanosin dan deoksiadenosis. Adduct utama dengan DNA adalah suatu pyrimidopurinone yang dinamakan MIG, yang diketahui merupakan adduct DNA endogen utama pada manusia yang mungkin berkontribusi secara signifikan terhadap kanker yang berhubungan dengan lifestyle dan factor diet. Malondialdehid kebanyakan tersedia dalam bentuk enol CH2(CHO)2 HOCH=CH-CHO Dalam pelarut organik, MDA ada terutama dalam bentuk cis isomer, sedangkan dalam air bentuk yang dominan adalah trans isomer. MDA adalah compound yang sangat reaktif dan biasanya tidak diamati dalam bentuk murninya. Dalam laboraturim, MDA bisa didapatkan secara in situ dengan menghidrolisis 1,1,3,3-tetramethoxypropane yang tersedia secara komersil. Bahan ini mudah untuk di-deprotonasi untuk mendapatkan garam natrium enolate. MDA dengan protein termodifikasi dapat menunjukkan perubahan perilaku fisikokimia dan antigenisitas. MDA adalah toksik dan dianggap terlibat dalam penuaan (aging), mutagenesis, carcinogenesis, diabetic nephropathy, dan kerusakan akibat radiasi. Produksi aldehid ini digunakan sebagai biomarker untuk mengukur kadar stress oksidatif pada oragnisme. MDA adalah salah satu substansi asam thiobarbiturat reaktif (Thiobarbituric acid reactive substances, TBARS), jadi, metode untuk menentukan MDA disebut metode TBARS. Bahan dan Metode 1. Reagen TBA a. 40,5 ml asam asetat 20%, buffer hingga pH 3,5 dengan 1 N NaOH b. 13,2 ml SDS 8,2% c. 40,5 ml TBA 0,8% d. Aquadest hingga volume 100 ml 2. Larutan Ekstraksi Butanol Campuran N-butanol, aquadest, dan pyridine (15:31, v/v) 3. Prosedur o a. Sample 1 ml ditambahkan 4 ml reagen TBA, vortex. Inkubasi pada suhu 90 selama 80 menit. b. Dinginkan dalam es selama 10 menit. Tambahkan 4 ml larutan ekstraksi butanol, vortex. c. Sentrifugasi campuran selama 15 menit pada 3000 g. d. Ambil supernatan, baca absorbansinya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 510, 532, dan 560 nm. e. Tentukan pula absorbansi blanko (aquades) dan standar MDA (1,1,3,3-tetramethoxypropanone, 10 mmol/L). Kalkulasi TBARS sesungguhnya dihitung dengan rumus berikut: A532 sesungguhnya = 1,22 [(A532)-(0,56) x (A510) + (0,44) x (A560)]

Mikrobiologi: Pemeriksaan Sputum untuk Diagnosis Tuberkulosis (TB)

By: Claradyka dan Arsyi A. Tuberkulosis

TB adalah penyakit dengan kepentingan global. Sepertiga populasi dunia diperkirakantelah terinfeksiMycobacterium tuberculosisdan delapan juta kasus baru TB muncul setiaptahunnya. Mayoritas pasien TB berusia 15-45 tahun, yaitu orang-orang pada masa palingproduktifnya. TB membunuh lebih dari dua juta orang di seluruh dunia per tahun, lebih banyakdibandingkan penyakit menular lainnya. Transmisi TB melalui nuclei droplet yang terbentukmelalui batuknya seseorang dengan pulmonary TB (bentuk paling sering) pada lingkunganterbatas. Droplet yang terinfeksi tetap tersisa di udara untuk beberapa saat, dan dapat terhirupoleh orang-orang yang rentan. Pulmonary TB biasanya terjadi pada apex pulmo, berkembang menjadi cavitas yang berisipopulasi besar tubercle bacilli yang dapat dideteksi pada specimen sputum. Pulmonary TBditandai dengan batuk produktif persisten selama 3 minggu atau lebih, penurunan berat badan,berkeringat saat malam, dan nyeri dada.Diagnosis

hanya dapat ditegakkan apabila ditemukantubercle bacilli pada sputum secara mikroskopik dan/atau kultur di lab. Langkah pertama diagnosis lab untuk TB adalah pemeriksaan mikroskopik direk terhadapspecimen sputum yang telah diwarnai sesuai untuk pemeriksaan tubercle bacilli. Antara 5000-10.000 tubercle bacilli per mL sputum dibutuhkan pada mkroskopik direk untuk hasil positif danhanya sebagian pasien TB yang punya segitu banyak bakteri buat dideteksi dengan cara ini. Jugatidak mungkin untuk membedakan spesies-spesies mycobacterium dengan mikroskopi. Pasiendengan apusan positif berarti dia mempunyai banyak banget tubercle bacilli -> paling infeksiusdan merupakan pasien terpenting untuk dideteksi dini karena mereka yang paling responsiblebuat nyebarin TB. Pemeriksaan sputum dengan mikroskop relative cepat, mudah dan murah danharus dilakukan pada kasus suspek TB. Mikroskopik apusan juga digunakan untuk memonitorkemajuan treatment dan mengontrol hasil perawatan. Pemeriksaan dengan kultur bakteriologis memberikan diagnosis definitive TB. Sedikitnya10 tuberkel bacilli yang viable dapat terdeteksi tergantung pada metode dekontaminasi dan tipemedia kultur yang digunakan. Namun, teknik mikrobiologi yang biasa dilakukan yaitu mengkulturmaterial klinis pada media kultur selektif atau diferensial dan subkultur untuk mendapatkankultur murni tidak dapat diterapkan pada bakteriologi tuberculosis. Dibandingkan dengan bakterilain yang biasanya bereproduksi dalam hitungan menit,M. tuberculosisberproliferasi sangatlambat (waktu generasi 18-24 jam). Kebutuhan untuk pertumbuhannya juga sedemikian rupasehingga mereka ga bakal tumbuh pada isolasi primer pada media yang ditentukan secara kimia.Satu-satunya media yang bisa digunakan untuk menumbuhkan cukup banyakM. tuberculosisadalah media yang diperkaya telur berisi gliserol dan asparagines, dan medium agar atau liquisyang disuplemen dengan serum atau bovine albumin. Kultur meningkatkan jumlah kasusditemukannya Tb, sekitar 30-5-%, dan mendeteksi lebih dini sebelum mereka jadi infeksius.Karena teknik kultur bisa mendeteksi sedikit bacilli, efisiensi kegagalan diagnosis pada akhirperawatan dapat ditingkatkan. Kultur juga menyediakan material yang dibutuhkan untuk tessuseptibilitas obat. Namun Kultur specimen jauh lebih mahal dibandingkan mikroskopi dan membutuhkanfasilitas untuk persiapan media dan juga tenaga ahli.

1. Mycobacterium tuberculosis(disingkat MTB aja yah :)

Dalam jaringan, MTB terlihat berbentuk batang lurus tipis, berukuran sekitar 0.4x3 mikrometer.Pada media artificial, terlihat bentuk filament dan coccoid dengan morfologi bervariasi darispesies satu ke spesies lainnya. Mycobacteria tidak dapat diklasifikasikan sebagaiGram positifatau negative. Pada pewarnaan dasar mereka tidak dapat di-dekolorisasi dengan alcoholmeskipun udah di treatment dengan iodine.Tubercle bacilli ditandai dengan acid fastness(kemampuan untuk resisten terhadap dekolorisasi bila diberi asam). Acid fastness tergantungpada integritas selubung lilinnya. Teknik pewarnaan Ziehl Nielssen digunakan untkmengidentifikasi bakteri acid-fast. Mycobacterium adalah aerob obligatdan mendapat energy dari oksidasi berbagai senyawakarbon sederhana. Peningkatan tekanan CO2 mempercepat pertumbuhan, aktivitas biokimiabukanlah suatu karakteristik, dan laju pertumbuhan jauh lebih lambat dibandingkan kebanyakanbakteri. Doubling time tubercle bacilli sekitar 18 jam. Bentuk saprofitik cenderung tumbuh lebihcepat, berproliferasi baik pada suhu 22-23 C, menghasilkan lebih banyak pigmen, dan cenderungkurang acid-fast daripada bentuk patogenik.

2. Diagnosis MTB a. Pengambilan specimen

Adanya bacilli acid-fast pada specimen klinis dapat dikonfirmasi melalui mikroskop ataukultur. Namun karena spesies mycobacterial individual tidak dapat diidentifikasi denganpemeriksaan apusa, diagnosis definitive TB hanya dapat ditegakkan bila MTB diisolasidari specimen klinis. Pada bakteriologi TB perhatian biasanya difokuskan pada masalahmikroskopi, kultur dan identifikasi, sementara masalah yang sering kelupaan adalahgimana caranya ngedapetin specimen yang adekuat (cukup). Keuntungan dari teknikdekontaminasi yang baik, media kultur sensitive dan skema identifikasi sederhana tidakakan dicapai sepenuhnya kecuali bila spesimen diambil dengan hati-hati dan ditransportdengan baik ke lab. Spesimen Sputum Meskipun MTB mampu menyebabkan penyakit pada hamper seluruh organ tubuh, lebihdari 85% TB di Negara dengan prevalensi tinggi adalah TB pulmonary. Karena itu, sputumadalah specimen yang dipilih dalam investigasi TB dan harus selalu diambil. Kalaupenyakit ekstrapulmonari dicurigai, sputum tetep harus diambil selain pengambilanspecimen ekstrapulmonari. Specimen sputum yang baik terdiri atas matrial yang barusaja dikeluarkan dari bronchial, dengan jumlah material nasal atau oral minimum.Kualitasnya dibilang memuaskan bila terdapat material mucoid atau mucopurulent danmerupakan hal yang lebih penting dari volumenya. Idealnya, specimen sputum harusbervolume 3-5ml, meskipun jumlah lebih kecil dapat diterima bila kualitasnya baik.Mengambil specimen sputum yang baik juga berarti pasiennya diberikan instruksi yangjelas. Aerosol yang mengandung tubercle bacilli dapat terbentuk ketika pasienmemproduksi specimen sputum. Karena itu, pasien harus memproduksi specimen entahdiluar pada udara terbuka atau jauh dari orang lain dan ngga di tempat

tertutup sepertitoilet. Di beberapa Negara, pasien kadang langsung datang ke lab untuk diagnosisnya, gake dokter dulu. Oleh karena itu sebaiknya staf lab mengetahui cara yang benar untukmengambil specimen sputum. Prosedur ini dijelaskan pada Annex 2. Waktu paling baik untuk pengambilan sputum adalah pagi hari sebelum pasien makanatau minum ibat (yang dapat mengganggu pertumbuhan tubercle bacilli). Bila specimensputum diambil untuk kepentingan diagnosis, kemoterapi TB tidak boleh dimulai sampaispecimen diambil. Karena meningkatnya sensitivitas terhadap kultur, satu specimensputum dengan kualitas yang baik sudah cukup. Beberapa pasien mengeluarkanmycobacteria secara ireguler dan jumlahnya dikit; untuk pasien-pasien seperti inikemungkinan untuk mendapatkan hasil kultur positif dapat meningkat bila lebih banyakspecimen yang dikultur. Specimen harus dibawa ke lab secepatnya setelah pengambilan.Kalo keterlambatan ngga bisa dihindari, specimen harus didinginkan untuk menginhibisipertumbuhan mikroorganisme lain yang tidak diinginkan. Specimen lain Bila pasien batuk-batuk produktif, ngedapetin specimen sputum adalah prosedur yangcocok. Tapi bila pasien kesulitan memproduksi sputum, metode lain dapat digunakanuntuk mendapat sekresi pulmonary untuk diagnosis. Teknik pengambilan tidak akandibahas. Namun, sputum yang diinduksi akan tampak seperti saliva dan specimen iniharus ditandai INDUKSI agar tidak dibuang karena dipikir ngga bagus spesimennya.Karena MTB dapat menginfeksi hamper seluruh organ, lab harus siap menerimaberbagai macam specimen ekstrapulmonari seperti cairan tubuh, jaringan, pus, dan urin.Specimen-spesimen ini dapat dibagi jadi 2 grup: Specimen yang diambil secara aseptic, biasanya bebas dari mikro organism lain Specimen yang diketahui mengandung kontaminasi flora normal atau specimenyang tidak diambil secara aseptic. Cairan yang diambil secara aseptik Cairan tubuh (spinal, pleural, pericardial, synovial, ascitic, darah, pus, sumsumtulang) harus diambil dan disimpan secara aseptik dalam kontainer steril oleh tenaga medis menggunakan teknik aspirasi atau prosedur bedah.

b. pewarnaan Ziehl-Neelsen
Persiapan apusan: Tandai slide yang baru pada satu ujungnya transfer sebagian spesimen ke slide menggunakan loop bakteriologi buat apusan berukuran sekitar 2x3 cm. Biarkan mengering, jangan dipanaskan. fiksasi apusan: lewatkan slide ke api 3 atau 4 kali dengan apusan menghadap atas. Jangan dididihkan. Biarkan dingin sebelum pewarnaan. 5. masukkan loop ke disinfektan atau tempat biohazard, dan gunakan yang baru untuk tiap specimen. Buang partikel sputum yang adheren (bila sampel berupa sputum) dari loop dengan menggerakkannya naik turun dalam tabung berisi pasir dan alcohol 70% atau klorin 5%. Bakar loop setelah penggunaan. Api harus tidak berwarna atau biru karena api yang berwarna oranye atau merah biasanya kurang panas.

1. 2. 3. 4.

Prosedur pewarnaan Ziehl-Neelsen (ZN)

1. letakkan slide pada rak staining dalam barisan 2. basahi slide dengan pewarnaan ZN yang A 3. panaskan slide perlahan dengan pembakar Bunsen hingga beruap dan mendidih, pertahankan penguapan selama 4. 5. 6. 7. 8. 9.
1. 2. 3. 4. 3-5 menit menggunakan panas rendah atau intermiten. Pada langkah ini bakteri acid-fast dan non acid-fast akan berwarna merah cuci slide dengan air mengalir hingga semua sisa pewarna luntur cuci slide dengan ZN yang B sampai pewarna pertama (ZN A) telah terdekolorisasi. Pada langkah ini ZN A tidak akan dekolorisasi pada bakteri acid-fast. Selnya warnanya masih merah. Sedangkan pada non acid-fast, ZN A akan dekolorisasi dan sel tampak tidak berwarna. Cuci seluruh slide dengan air. Buang kelebihan air dari slide Basahi slide dengan ZN yang C (counter-stain). Biarkan apusan terwarna selama 1-2 menit. Bakteri acid-fast tidak akan mengambil wana ZN C. warnanya akan tetap merah. Sedangkan bakteri non acid-fast akan berwarna biru karena mengambil warna ZN C. cuci slide dengan air, buang kelebihannya. Biarkan sampel kering sendiri periksa dengan mikroskop perbesaran 1000. Pemeriksaan mikroskopik teteskan setets minyak imersi pada apusan amati dengan perbesaran 100x objektif dengan 10x okuler amati bacilli acid-fast yang terlihat berbentuk batang berderet berwarna merah amati slide pada seikitnya 100 lapang pandang dalam 10 menit dengan menggeser2 slide.

c. Homogenisasi dan dekontaminasi

Teknik mikrobiologi yang biasa yaitu menempatkan material klinis pada media kultur selektif atau diferensial dan subkultur untuk mendapatkan kultur murni tidak dapat diterapkan dalam bakteriologi TB. MTB butuh media khusus yang tidak dapat digunakan organism lain dan dia tumbuhnya lambat, butuh 3-6 minggu untuk membentuk koloni. Kultur biasanya dibuat dalam botol, tidak di cawan petri karena tubercle bacilli hanya berjumlah sedikit dalam kebanyakan specimen; ini membutuhkan inocula besar yang disapukan secara luasa pada permukaan media. Karena butuh waktu inkubasi yang lama, botol-botolnya disumbat rapat untuk menghindari keringnya kultur (yang dapat terjadi pada cawan petri). Mayoritas specimen klinis untuk kultur TB terkontaminasi oleh flora normal yang tumbuh lebih cepat. Ini akan menutupi seluruh permukaan medium dan mencernanya sebelum tubercle bacilli mulai tumbuh. Oleh karena itu kebanyakan specimen harus melewati prosedur digesti dan dekontaminasi sehingga debris organic akan terlikuefaksi dan menghilangkan flora normal yang tidak diinginkan. Semua agen dekontaminasi/digesti yang tersedia saat ini bersifat toxic terhadap tubercle bacilli dalam batas tertentu; karena itu untuk memastikan ketahanan jumlah maksimum bacilli dalam specimen, prosedur digesti/dekontaminasi harus diikuti dengan seksama. Agar cukup tubercle bacilli yang bertahan untuk mngkonfirmasi diagnosis, tidak dapat dihindari bahwa sebagian kultur akan terkontaminasi organism lain. Sebagi peraturan umum, tingkat kontaminasi sebanyak 2-3% adalah dapat diterima dalam lab yang mendapat specimen fresh, bila specimen (terutama sputum) butuh beberapa hari untuk sampai ke lab maka kontaminasi mungkin mencapai 5-10%. Juga penting bahwa lab yang tidak terkontaminasi kemungkinan menggunakan metode yang membunuh terlalu banyak tubercle bacilli. Ketika mengkultur tubercle bacilli, tiga (tapi adanya dua, ga ngerti deh) aspek penting harus diingat: Specimen harus dihomogenisasi untuk membebaskan bacilli dari mucus, sel, atau jaringan yang mungkin tertempel. Makin ringan homogenisasi hasilnya makin baik. Baik homogenisasi maupun dekontaminasi tidak boleh mengurangi viabilitas tubercle bacilli.

Prosedur digesti dan dekontaminasi Specimen sputum Spesimen-spesimen sputum tidak boleh dikumpulkan bersama karena resiko cross-contamination. Karena waktu paparan digestan/dekontaminan harus dikontrol secara ketat, lebih baik dilakukan sentrifugasi yang bersamaan (contoh 8 spesimen dalam 1 waktu). Selalu digesti/dekontaminasi seluruh specimen, jangan membagi-bagi porsi specimen. Jika sputum harus dituang, lakukan dengan hati-hati dalam menunag dari container specimen ke tabung sentrifugasi. Jika sputum terlalu kental untuk dituang, digestan/deckontaminan dalam volum yang sama dapat ditambahkan ke sputum dalam container specimen dan campuran lalu dituang ke tabung sentrifugasi yang sesuai. Karena specimen sputum adalah specimen klinis paling umum yang digunakan untuk kultur tuberculosis, prosedur homogenisasi dan dekontaminasi .. Specimen selain sputum membutuhkan perhatian lebih dalam pemrosesan karena sedikitnya jumlah bakteri tuberkel yang ada pada specimen positif. Metode natrium hidroksida (Modified Petroff) Metode ini banyak digunakan di negara-negara berkembang karena praktis/simple dan reagennya mudah didapatkan. NaOH adalah racun bagi dekontaminan dan basil tuberkel, oleh karena itu dibutuhkan ketepatan waktu sesuai dengan waktu yang diindikasikan. Reagen o Larutan natrium hidroksida (NaOH) 4% o 4 g Pellet natrium hidroksida (analytical grade) o 100 ml air distilasi o o NaOH yang dilarutkan dalam air distilasi dan disterilisasi dengan autoclave pada suhu 121 selama 15 menit o Salin steril o 0,85 g Pellet natrium hidroksida (analytical grade) o 100 ml air distilasi o o NaOH yang dilarutkan dalam air distilasi dan disterilisasi dengan autoclave pada suhu 121 selama 15 menit Metode alternatif dalam preparasi NaOH 4% adalah sebagai berikut: Tambahkan pellet NaOH 250 g ke dalam 500 ml air distilasi dan isi air hingga tanda 625 ml. Hati-hati terhadap panas yang dihasilkan reaksi ini. Jika dibutuhkan, siapkan larutan NaOH 4% fresh dengan menambahkan NaOH 40% ke air distilasi steril dengan perbandingan 1:10.

Prosedur o Masukkan 2x ml NaOH 4% ke dalam x ml sputum. Tutup rapat kontainer lalu kocok untuk digesti o Biarkan selama 15 menit pada suhu ruang, kocok sesekali. Sentrifugasi pada 3000 x g selama 15 menit, buang supernatan. Tambahkan 15 ml salin steril atau air distilasi dan resuspend sediment / sentrifugasi pada 3000 x g selama 15 menit.

o d.

Tuang supernatan dan segera inokulasi ke media kultur

Pemeriksaan Kultur dan Identifikasi Seluruh kultur harus diperiksa 72 jam setelah inokulasi untuk mengecek apakah cairan telah evaporasi seluruhnya, untuk mengencangkan tutup dan menghindari kekeringan media, dan untuk mendeteksi adanya kontaminan. Selanjutnya kultur diperiksa setiap minggu atau, jika ini tidak dapat dilakukan, setidaknya 3 kali pada: o Setelah 1 minggu untuk mendeteksi rapidly growing mycobacteria yang bisa disalahartikan sebagai M. tuberculosis o Setelah 3-4 minggu untuk mendeteksi kultur positif M. tuberculosis dan slow-growing mycobacteria yang tumbuh lambat lainnya yang bisa saja merupakan saprofit atau patogen potensial o Setelah 8 minggu untuk mendeteksi very slow-growing mycobacteria, termasuk M. tuberculosis, sebelum menyatakan kultur sebagai kultur negatif Pelabelan kultur dengan tanggal pemeriksaan dan penempatan kontainer di inkubator dalam urutan secara kronologis penting untuk dilakukan. Kultur terkontaminasi dapat ditemukan selama pemeriksaan dengan penampakan permukaaan yang seluruhnya sudah terkontaminasi atau medium yang sudah mencair atau berubah warna, dan kultur ini harus disterilisasi dan dibuang. Organisme pengkontaminasi tertentu menghasilkan asam dari konstituen medium dan penurunan pH melepaskan sebagian malachite green dari telur (terindikasi dari perubahan warna medium menjadi hijau tua). Basil tuberkel tidak akan tumbuh dalam kondisi-kondisi tersebut dan kultur harus dibuang. Kultur dengan separuh kontaminasi harus dilanjutkan sampai minggu ke-8. Late contamination tidak meniadakan keberadaan M. tuberculosis; oleh karena itu disarankan untuk melakukan preparasi smear dari permukaan medium. Jika pemeriksaan mikrokopis mengindikasikan adanya acid-fast bacilli, harus dilakukan re-dekontaminasi dan reinokulasi kultur. Pembacaan kultur Tipe koloni M. tuberculosis adalah kasar, mengumpul, waxy, tidak berpigmen (warna krem) dan tumbuh lambat; baru muncul 3 minggu setelah inokulasi. Jika kultur meragukan atau pemeriksa kultur kurang berpengalaman, pemeriksaan acid-fast dengan Ziehl-Neelsen (ZN) harus dilakukan untuk konfirmasi. Sejumlah kecil kultur diambil dengan menggunakann loop dan diulas ke dalam 1 tetes salin steril di slide. Perhatikan organisme membentuk emulsi dalam cairan: basil tuberkel tidak membentuk suspensi halus, berbeda dari mycobacteria lain. Smear dibiarkan kering, difiksasi dengan panas, lalu diwarnai dengan metode ZN. Untuk identifikasi preliminary basil tuberkel harus terdapat karakteristik berikut: o Basil tuberkel tidak tumbuh pada kultur primer dalam waktu kurang dari 1 minggu dan biasanya membutuhkan waktu 3-4 minggu untuk menampakkan pertumbuhan yang terlihat o Koloni berwarna buff (tidak pernh kuning) dan kasar, memiliki penampakan seperi remah roti atau kol o Tidak membentuk emulsi pada salin untuk pembuatan smear tapi membuat suspensi granular o Secara mikroskopis sering terlihat tersusun dalam serpentine cords dengan panjang beragam atau gumpalan linear yang berdempet. Sel individual panjangnya 3m-4m. e. Diferensiasi M. tuberculosis Meskipun diagnosis presumptif tuberculosis dapat dibuat dengan teknologis laboraturium berpengalaman berdasarkan karakteristik dasar basil tuberkel yang dideskripsikan sebelumnya, lebih baik lagi jika dilakukan tes konfirmasi. Sayangnya tidak ada satu tes pun yang benar-benar dapat membedakan M. tuberculosis dari mycobacteria lainnya. Namun, tes-tes dibawah ini, jika dikombinasikan dengan karakteristik yang dijelaskan sebelumnya, dapat mengidentifikasi strain M. tuberculosis dengan ketepatan >95%. 1. Tes niacin Niacin (nicotinic acid) memainkan peran penting pada reaksi reduksi-oksidasi yang muncul selama proses metabolik di seluruh mycobacteria. Meskioun smeua mycobacteria menghasilkan niacin, Studio komparatif menunjukkan bahwa, karena jalur metabolik yang diblok, M. tuberculosis mengumpulkan jumlah nicotinic acid terbanyak dan pendeteksiannya berguna untuk diagnosis definitif. Strain M. tuberculosis dengan niacin negatif sangat jarang ada, sedangkan beberapa spesies mycobacteria lainnya memberikan hasil positif pada tes niacin. Kultur yang ditumbuhkan pada medium telur memberikan hasil yang paling konsisten terhadap tes niacin dan oleh karena itu medium LJ direkomendasikan sebagai media penumbuh. Kultur harus berumur 3-4 minggu dan harus memiliki cukup pertumbuhan (>50 koloni). Karena M. tuberculosis mengekskresikan niacin ke dalam media penumbuh, kultur dengan pertumbuhan confluent dapat memberikan hasil reaksi niacin negatif palsu karena cairan pengekstraksi tidak kontak dengan medium kultur. Jika ini terjadi, ekspos permukaan medium dengan scraping atau menusukkan kultur ke medium. Aeration kultur yang akan dites niacin sangatlah penting. Tutup dapat lepas selama periode inkubasi dan stopper spesial cap-o-test direkomendasikan. Tes niacin dengan reagen kimia

Kontrol Kontrol reagen dengan mengetes ekstrak dari medium tabung uninoculated (kontrol negatif) dan gunakan ekstrak dari kultur M. tuberculosis H37Rv sebagai kontrol positif. Reagen o Larutan aniline 4% Anilinee merupakan oncogenic dan dapat penetrasi ke dalam kulit. Gunakan gloves dan berhati-hati dalam menangani bahan ini Aniline dapat berubah warna ketika terpapar udara dan cahaya; siapkan larutan fresh jika dibutuhkan o 4 ml aniline fresh, tidak berwarna o 96 ml etanol 95% Campur aniline dengan etanol dalam botol amber dan simpan dalam gelap di dalam refrigerador. Jangan gunakan larutan jika berubah warna menjadi kuning. o Larutan cyanogen bromide 10% Cyanogen bromide adalah lacrimator beratdan berbahaya (toksik)jika dihirup; kerjakan dalam ruangan berventilasi baik ketika preparasi larutan ini dan lakukan testing kultur dalam biological safety cabinet Cyanogen bromide merupakan oncogenic dan dapat penetrasi ke dalam kulit. Gunakan gloves dan berhatihati dalam menangani bahan ini Dalam larutan asam, cyanogen bromide menghidrolisis asam hidrosianat, yang sangat beracun. Taruh seluruh tabung reaksi ke dalam larutan disinfektan yang terbuat dari alkalin dan NaOH o 5 g kristal cyanogen bromide o 50 ml air distilasi o Tambahkan cristal cyanogen bromide ke dalam air distilasi di dalam beaker glass o Lapisi beaker glass dengan foil dan tempatkan dalam fume cupboard pada suhu ruang. Cristal membutuhkan waktu 24 jam untuk larut pada suhu ruang o Jangan memanaskan arrutan di atas bunsen flame o Tuang ke dalam botol amber bertutup rapat lalu taruh di dalam refrigerador o Hangatkan hingga mencapai suhu ruang untuk melarutkan endapan yang terbentuk selama pendinginan o Siapkan dalam jumlah kecil karena cyanogen bromide voltil dan kehilangan kekuatannya selama penyimpanan. Larutan yang lemah memberikan hasil negatif palsu. Untuk menghindari paparan memanjang cyanogen bromide yang tidak dibutuhkan selama menimbang Prosegur berikut dapat dilakukan: Tulis berat beaker kosong yang dilapisi alumunium foil Hilangkan kuantitas kira-kira (contoh: 1/10 dari konten 100 g botol untuk 10% larutan) cristal cyanogen bromide putih pada beaker, tutup, dan catat beratnya Hitung perbedaan antara 2 oembacaan untuk mendapatkan berat pasti cristal di dalam beaker Tambahkan sejumlah air distilasi yang diperlukan untuk menghasilkan konsentrasi 10% Prosedur o Tambahkan 1 ml air steril ke culture slant. Jika pertumbuhan confluent, tusuk medium dengan pipet Pasteur untuk membuat air konyak dengan medium o Tempatkan tabung secara horizontalagar cairan menutupi seluruh permukaan medium o Biarkan selama 30 menit untuk optimalisasi ekstraksi niacin. Waktu ekstraksi dapat menjadi lebih lama jika koloni yang ada pada kultur sedikit. o Tegakkan slant selama 5 menit agar cairan bisa mencapai bagian bawah medium o Pindahkan 0,5 ml cairan ekstrak ke tabung screwcap bersih o Secara berurutan, tambahkan 0,5 ml larutan aniline 4% dan o,5 ml cyanogen bromide 10% o Tutup tabung dan amati pembentukan warna kuning (= hasil positive) pada larutan dalam waktu 5 menit. Warna kuning muncul berbentuk cincin di pertemuan 2 reagen atau, jika larutan dikocok, sebagai kolom kuning pada cairan o Tambahkan 2-3 ml NaOH 4% ke setiap tabung lalu buang Hasil dan interpretasi o Negatif: tidak terbentuk warna o Positif: warna kuning muncul dalam waktu 5 menit. Warna muncul dalam bentuk cincin di pertemuan 2 reagen atau, jika tabung dikocok, sebagai kolom kuning pada cairan Tes niacin dengan paper strip Kertas strip tes untuk deteksi niacin tersedia di pasaran. Jika dibandingkan dengan reagen kimia, tes ini cukup baik dalam mendeteksi produksi niacin. Metode paperstrip menghindarkan kita dari menyimpan dan menyiapkan bahan kimia berbahaya yang digunakan untuk mendemonstrasikan keberadaan niacin, namun, paperstrip ini lebih mahal.

Hasil dan interpretasi o Negatif: tidak terbentuk warna o Positif: cairan kuning di dasar tabung. Acuhkan warna pada strip; bisa saja itu terjadi karena oksidasi kimia , terutama di bagian atas strip Precaution o Selalu cek tanggal kadaluarsa strip tes o Untuk menghindari hasil negatif palsu, segera tutup kembali tabung estela memasukkan paper strip; jika tabung dibiarkan terbuka gas yang berubah menjadi campuran kimia pada strip akan lepas ke atmosfir. 2. Pertumbuhan pada medium yang mengandung p-nitrobenzoic acid (PNB) Pada laboratorium dimana fasilitas dan reagen untuk tes niacin dan nitrat tidak tersedia, identifikasi basil tuberkel dapat dilakukan dengan kombinasi satu atau lebih tes katalase yang dijelaskan sebelumnya dengan kultur pada suhu o o 25 C pada medium LJ dan kultur pada medium LJ yang mengandung p-nitrobenzoic acid at 37 C. Permasalahan o mengenai inkubasi pada suhu 25 C mungkin didapati di daerah tropis. Inkubator pendingin harus digunakan jika tersedia; sebagai alternative, water bath dalam refrigerator atau dalam ruangan dingin dapat digunakan. PEMERIKSAAN DAN INDENTIFIKASI KULTUR Prosedur o Inokulasi dua slope medium LJ yang mengandung gliserol dan satu tabung medium LJ yang mengandung nitrobenzoic acid (PNB) pada konsentrasi 500mg/liter o o Inkubasi satu slope LJ dan slope PNB pada suhu 37 C pada inkubator dengan lampu didalamnya dan Amati pada hari ke-3, 7, 14, dan 21. Ketika pertumbuhan terlihat pada slope LJ, periksa pigmennya. Jika inkubator dengan lampu di dalamnya tidak tersedia, longgarkan tutup untuk mengekspos terhadap oksigen dan sinar matahri (tapi bukan sinar langsung) atau tempatkan 1 m dari lampu bench laboratorium selama 1 jam. Reinkubasi dan Amati adanya pigmen keesokan harinya o o Inkubasi slope LJ lainnya pada suhu 25 Cdan Amati pada hari ke-3, 7, 14, dan 21. Hasil dan interpretasi o o M. tuberculosis tidak tumbuh dalam 3 hari pada suhu 37 C dan tidak tumbuh sama sekali pada suhu 25 C atau pada medium PNB. M. tuberculosis juga tidak menghasilkan pigmen kuning atau jingga di dalam gelap atau setelah terpapar sinar. RINGKASAN IDENTIFIKASI M. tuberculosis o Laju pertumbuhan lambat o o o Suhu pertumbuhan hanya pada 35 -37 C o Tidak ada pigmentasi o Nicacin (+) o Nitrate (+) o o Katalase (-) pada suhu 68 C o Tidak ada pertumbuhan pada medium LJ yang mnengandung p-nitrobenzoic acid B. NTM (Non Tuberculosis Mycobacteria) Infection Non tuberculosis mycobacteria (mycobacteria selain M. tuberculocic dan M. leprae) biasanya merupakan organisme yang bebas hidup di lingkungan. Mereka hidup di eprmukaan air, air keran, tanah, binatang, susu, dan produk makanan.NTM juga dapat menginhabitasi kulit atau sekresi tanpa menyebabkan penyakit. Baru-baru ini ini NTM menjadi penting bagi manusia karena jumlah individu dengan immunocompromising meningkat, terutama mereka dengan acquired immunodeficiency syndrome (AIDS). Beberapa sndrome disebabkan non tuberculosis mycobacteria (NTM). Pada anak-anak, sindrom yang paling sering terjadi adalah cervical lymphadenitis yang disebabkan karena Mycobacterium avium complex (MAC) (termasuk Mycobacterium avium dan Mycobacterium intracellulare), Mycobacterium scrofulaceum, Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium kansasii, dan Mycobacterium marinum. Meskipun banyak orang terekspos NTM, hanya beberapa yang berkembang menjadi infeksi kronis atau penyakit. Infeksi yang kurang sering terjadi antara lain adalah infeksi cutan, osteomielitis, otitis media, dan penyakit paru. Infeksi tersebar (disseminated) hampir selalu berkaitan dengan immunodeficiendy yang dikarakterisasi oleh impaired cell-mediated immunity. Infeksi endogen pada pasien HIV biasanya disebabkan oleh MAC. Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium chelonae, dan Mycobacterium abscessus yang sebut sebagai rapidly growing mycobacterium karena dapat diidentifikasi di laboratorium dalam waktu 3-7 hari. Rapidly growing mycobacteria terakadang diimplikasian dengan luka, jaringan lunak, tulang, pulmonari, dan infeksi telinga tengah. Manifestasi dari infeksi disseminated NTM tergantung pada spesies dan rute infeksi termasuk demam, keringat malam, penururnan berat badan, abdominal pain, fatigue, diare, dan anemia. Mycobacterium avium complex pada traktus respirasi dan gastrointestinal biasa ada pada orang dengan infeksi HIV. Non tuberculosis mycobacteria, biasanya MAC, juga dapat recovered pada 10%-20% remaja dan dewasa muda dengan cystic fibrosis. Portal yang biasa menjadi tempat masuk infeksi NTM dipercaya adalah abrasi kulit (misal: lesi

kutan karena M. marinum), mukosa orofaringeal (presumed portal untuk cervical lymphadenitis), GIT atau resporatory tract untuk MAC, dan respiratory tract (termasuk tympanostomy tubes) untuk otitis media dan kasus langka mediastinal adenitis dan penyakit endobronchial. Kebanyakan infeksi merupakan local hanya di portal tempat masuknya saja atau di limfonodi regional. Severe pulmonary disease dan dissemination to distal sites umumnya muncul di host dengan immunocompromising, terutamapada orang dengan AIDS. Tidak ada bukti definitif adanya transimi NTM manusia-ke-manusia; namun, pengumpulan (clustering) pasien dengan strain M avium yang sama dilaporkan dapat dan merepresentasikan common enviromental exposure atau penyebaran manusia-ke-manusia. Kasus otitis media dikarenakan M abscessus diasosiasikan dengan penggunaan alat terkontaminasi dan air. Rute transimisi melalui air dicurigai Uruk infeksi MAC pada host immunodeficient. Secara garis besar, NTM dibagi menjadi 2 grup; mycobacteria yangmenyebabkan penyakit tuberculosis-like (M kansasii, M avium-intracellular complex, M scrofulaceum), dan yang menyebabkan infeksi jaringan lunak ( M marinum, M ulcerans) (Ryan dan Ray, 2004) Nation wide Surrey terhadap 32.000 mycabacteria terisolasi di USA pada tahun 1979-1980 membuktikan bahwa 1/3 infeksi mycobacteria disebabkan oleh NTM. Spesies yang paling sering dikenali adalah M. avium-intracelluare complex (MAC) (61%), M. fortuitum complex (19%) dan M. kansasiii (10%). Menurut American Thoracic Society rekomendasi untuk management penyakit paru MAC adalah terapi inisal untuk pasien yang terdiri dari minimal 3 regimen obat: clarithromycin (atau azithromycin), rifampin (atau rifabutin), dan ethambutol. Intermitten streptomycin utnuk terapi 2-3 bulan pertama direkomendasikan untuk penyakit ekstensif. Randomized trial baru-baru ini membuktikan bahwa respon mikrobiologi yang lebih baik diobservasi pada pasien yang diberikan treatment regimen termasuk streptomycin. Untuk treatment penyakit paru M. abscessus, kombinasikan terapi antibiotik intravena termasuk amikacin dan cefoxitin untuk 2-4 minggu untuk peningkatan klinis dan mikrobiologi direkomendasikan sebagai tambahan antibiotik oral, termasuk clarithromycin (atau azithromycin). Translate PA Limfo Nodi dan Mikrobiologi TB By - Claradyka 1. Non Hodgkins Lymphoma (tipe diffuse) Istilah lymphoma mendeskripsikan sebuah grup malignansi heterogen dengan biologi, sifat klinis dan prognosis yang berbeda. Secara umum lymphoma dibagi menjadi 2 grup besar neoplasma, yaitu Non Hodgkin lymphoma (NHL) dan Hodgkin disease. Sekitar 85% dari keseluruhan lymphoma malignant adalah NHL. Umur rata2 saat terdiagnosis adalah 60an, dengan beberapa pengecualian. NHL mencakup banyak subtype klinikopatologi, masing-masing dengan epidemiologi berbeda; etiologi; morfologi; immunophenotipik; genetic; dan fitur klinis; dan respon terhadap terapi. Klasifikasi WHO menjelaskan lebih jauh tentang pendekatan REAL. Klasifikasi ini membagi NHL menjadi yang berasal dari sel B, sel T dan sel NK. NHL adalah neoplasma hematopoietic paling sering, sedikitnya 4% dari keseluruhan diagnosis kanker dan peingkat 7 dalam frekuensi diantara semua kanker. NHL 5x lebih umum dibandingkan Hodgkin disease. Insidensi bervariasi tergantung ras; kulit putih berisiko lebih tinggi disbanding kulit hitam dan orang asia amerika. Secara umum, insidensi lebih tinggi pada pria disbanding wanita, dengan rasio pria:wanita 1.4:1. Rasio ini mungkin berubah tergantung subtype NHL, contohnya primary mediastinal diffuse large B cell lymphoma terjadi lebih sering pada wanita. Umur median terlihatnya presentasi NHL semua subtype adalah lebih tua dari 50 tahun, kecuali pada pasien dengan high-grade lymphoblastic lymphoma dan small noncleaved lymphoma, yang merupakan tipe paling sering dari NHL pada anak-anak dan remaja. Pada diagnosis, low-grade lymphoma berjumlah 37% dari semua NHL pada pasien berumur 35-64 tapi hanya 16% pada pasien berumur dibawah 35 tahun. Informasi Klinis Seorang pria berusia 70 tahun dengan massa lobulus, multiple, tidak nyeri, besar, solid di leher, axilla dan inguinal sejak 6 bulan lalu. Lesi-lesi ini menempel pada jaringan sekitarnya. dia merasa lemah dan pucat. Dilakukan biopsy. Pemeriksaan makroskopik Jaringan enkapsulasi solid diameter 3 cm, warna putih kecoklatan Fitur mikroskopik Specimen terdiri atas dua macam sel besar terdifusi. Sel-sel yang besar berukuran 4-5 kali ukuran limfosit normal. Sel-sel tsb memiliki nucleus cleaved dan non-cleaved (cleave= semacam celah/terbelah), dengan nucleoli prominen dan sitoplasma relative banyak. Terdapat sel varian immunoblastik. Sel ini memiliki nucleus vesicular besar multilobulus atau nucleus bulat dengan nucleoli prominen yang terletak di sentral. Sitoplasma terwarna atau jernih. Mitosis banyak ditemukan. Hasil pewarnaan immunohistochemistry

Pewarnaan LCA: positif Pewarnaan CD 20: positif Pewarnaan CD3: negatif 2. Hodgkins Lymphoma (Mixed-Cellularity type) Istilah Hodgkin lymphoma (HL), sebelumnya dikenal sebagai Hodgkins disease, meliputi sekelompok neoplasma lymphoid yang berbeda dari NHL dalam beberapa hal. Bila NHL biasanya muncul pada situs ektranodal dan tersebar dengan pola yang tidak dapat diprediksi, HL muncul pada nodus tunggal atau sejalur nodus dan menyebar pertama kali ke nodus yang secara anatomi bersebelahan. HL ditandai secara morfologi dengan adanya sel raksasa neoplastik disebut sel Reed-Sternbergyang menginduksi akumulasi limfosit reaktif, histiosit (makrofag), dan granulosit. Sel Reed-Sternberg biasanya menyusun sebagian kecil (1-5%) dari total massa tumor, membuat HL lebih sulit dipelajari daripada NHL. Namun, sekarang jelas bahwa dalam mayoritas kasus, sel Reed-Sternberg neoplastik berasal dari centrum germinale atau post centrum germinale dari sel B, menandakan bahwa kebanyakn HL adalah tumor tidak lazim yang berasal dari sel B. ini adalah salah satu bentuk malignansi pada remaja muda, dengan umur rata2 saat diagnosis adalah 32 tahun. Banyak kemajuan yang telah dibuat mengenai treatment kasus ini dan sekarang dapat disembuhkan dalam sebagian besar kasus. Klasifikasi Klasifikasi WHO adalah 5 subtipe HL: nodular sclerosis, mixed cellularity, lymphocyte-rich, lymphocyte depletion, lymphocyte predominance. Pada 4 subtipe pertama nodular sclerosis, mixed cellularity, lymphocyte-rich, lymphocyte depletion sel Reed-Sternberg memiliki immunophenotype yang sama, sebagai hasilnya subtipe2 ini sering disebut bentuk klasik HL. Pada HL lymphocyte predominance, sel Reed-Sternberg memiliki karakteristik immunophenotype sel B yang berbeda dari bentuk klasik HL. Informasi klinis Pria 50 tahun dengan massa berlobul dan multiple, tidak nyeri, solid, besar, pada leher, axilla, inguinal. Lesi ini menempel pada jaringan sekitarnya. dia juga mengalami demam dan hepatomegaly. Dilakukan biopsy. Pemeriksaan makroskopik Jaringan solid enkapsulasi, diameter 8 cm, warna putih kecoklatan. Gambaran mikroskopik Specimen terdiri atas beberapa sel Reed-Sternberg yang tersebar merata dalam massa sel neoplastik lymphositic dengan eosinofil, histiosit, dan sel plasma yang matur dan prominen. Sel Reed-Sternberg adalah sel-sel besar dengan sitoplasma agak eosinofilik dan banyak, juga memiliki nucleus multilobus atau multinucleus dengan nucleoli prominen, bulat, dan besar. Karakteristik yang khusus adalah dua nucleus mirror image(aku ga ngerti emang sebutannya gitu atau bisa diartikan sebagai dua nucleus seperti cermin), masing-masing berisi nucleolus besar (seperti inklusi) acidofilik dikelilingi zona jernih yang tampak berbeda. Berdua, mereka tampak seperti mata burung hantu. Membrane nucleus jelas. Sejumlah mitosis ditemukan. Mungkin ada nekrosis fokal, tapi fibrosis minimal atau tidak ada. 3. Chronic Non Spesific Lymphadenitis Klinis: wanita 24 tahun dengan lymphadenopathy di leher, diameter 1 cm, mobile, sejak 2 minggu lalu Makroskopik: jaringan enkapsulasi, firm, diameter 1 cm, warna putih kecoklatan Gambaran mikroskopik: specimen terdiri atas jaringan lymphoid dengan hyperplasia folikular, prominensia venula post kapiler, jumlah immunoblast meningkat, sel plasma, dan histiosit, dan fibrosis. Kapsul mungkin terlihat inflamasi dan atau fibrosis, dan prosesnya dapat meluas ke jaringan perinodal. Bangunan limfo nodi masih terjaga, dengan jaringan lymphoid normal diantara centrum germinale-nya folikel. Nodulus lymphoid bervariasi bentuk dan ukurannya. Pada centrum germinale, terdapat campuran populasi limfosit dalam stage transformasi blast yang bervariasi, dan aktivitas fagositik yang prominen. 4. Metastatic Undifferentiated Carcinoma of The Lymph Node Klinis: seorang laki-laki 48 tahun dengan massa multiple solid di leher. Pasien juga mengalami tuli danepistaxis. Foto scan menunjukkan tumor terdifusi pada nasofaring. Biopsy lesi dilakukan. Makroskopik: jaringan solid enkapsulasi dengan diameter 2 cm, warna putih kecoklatan.

Mikroskopik: specimen terdiri atas jaringan limfoid dengan sel tumor epithelial. Selnya atipikal danpolimorfik, dengan nucleus berbentuk spindle hiperkromatik atau nucleus vesicular dengan nucleoliprominen. Banyak mitosis dapat ditemukan