TEKNIK DASAR BAKTERIOLOGI

Ni’matul Murtafi’ah, S.Pd., M.Sc.

ASEPTIK DAN TEKNIK ASEPTIK

• ASEPTIK  prinsip mempertahankan keadaan bebas

mikroorganisme.
• Suasana yang steril harus terus di lakukan supaya menghindari
infeksi bakteri patogen.

ANTISEPTIK
Keadaan bbs bakteri patogen
 TEKNIK ASEPTIK

• Cara untuk memperoleh kondisi bebas dari mikroorganisme.

• Teknik didalam memindahkan atau menstranfer kultur bakteri dari
satu tempat ke tempat lain secara aseptis agar tidak terjadi
kontaminasi oleh mikroba lain ke dalam kultur.

• KENAPA SANGAT DIPERLUKAN???

Untuk menghindarkan mikroorganisme dari kontaminan yang
dapat menghambat pertumbuhan mikroba

• APA SAJA YANG PERLU MENGGUNAKAN TEKNIK INI?

ALAT, BAHAN, & LINGKUNGAN
SYARAT KONDISI ASEPTIK

Bahan awal yang steril

Alat yang steril

Lingkungan yang terkontrol

Wadah steril

Teknik yang sesuai

STERIL & STERILISASI

Sterilsuatu keadaan dimana suatu bahan bebas

dari mikroba.
Steralisasi  suatu cara untuk membebaskan
suatu benda dari semua, baik bentuk vegetatif
maupun bentuk spora.
 Hal-hal yang perlu diperhatikan dalam steralisasi
di antaranya :
• Sterilisator (alat untuk mensteril) harus siap pakai, bersih, dan masih
berfungsi
• Peralatan yang akan di sterilisasi harus dibungkus dan diberi label yang
jelas dengan menyebutkan jenis peralatan, jumlah dan tanggal
pelaksanaan sterilisasi
• Penataan alat harus berprinsip bahwa semua bagian dapat steril
• Tidak boleh menambah peralatan dalam sterilisator sebelum waktu
mensteril selesai
• Memindahklan alat steril ke dalam tempatnya dengan korentang steril
• Saat mendinginkan alat steril tidak boleh membuka pembungkusnya,
bila terbuka harus dilakukan sterilisasi ulang.
Prinsip kerja autoklaf

• Biasanya untuk mesterilkan media digunakan suhu 1210C dan

tekanan 15 lb/in2 (SI = 103,4 Kpa) selama 15 menit.

• Sumber panas dinyalakan → air dalam autoklaf lama kelamaan

akan mendidih dan uap air yang terbentuk mendesak udara yang
mengisi autoklaf → Katup uap atau udara ditutup → saat tercapai
tekanan dan suhu yang sesuai → proses sterilisasi dimulai
→ timer mulai menghitung waktu mundur.

• Setelah proses sterilisasi selesai, sumber panas dimatikan →

tekanan dibiarkan turun.
Prinsip kerja autoklaf

• Cara mengetahui apakah Autoklaf bekerja dengan sempurna

→ dengan Bacillus stearothermophillus.

• Mikroba ini tersedia secara komersial dalam bentuk spore strip

→ Kertas spore strip ini dimasukkan dalam autoklaf dan
disterilkan → ditumbuhkan pada media

• Bila media tetap bening → autoklaf telah bekerja dengan

baik.
Zat Kimia pengendali Mikroorganisme

• Setiap zat kimia mempunyai keterbatasan dalam keefektifannya.

Bila digunakan dalam kondisi praktis, keterbatasan-keterbatasan
ini perlu diamati. Lagi pula, tujuan yang dikehendaki dalam
pengendalian mikroorganisme tidak selalu sama.

• Dengan demikian pemilihan suatu bahan kimia untuk penggunaan

praktis dipengaruhi juga oleh hasil antimikrobial yang diharapkan
dari padanya.
Teknik sterilisasi

 Mekanik
 Fisika
 Kimiawi
1. Sterilisai Secara Mekanik (Filtrasi)

• Cara ini dipakai untuk sterilisasi yang tidak tahan pemanasan.

Ex: urea broth, untuk mensterilisasi vaksin, enzim, vitamin dan antibiotika
• Menggunakan suatu saringan yang berpori sangat kecil (0.22 mikron atau 0.45
mikron).
• filter yang digunakan adalah filter berkefeld, filter chamberland, dan filter
seitz.
• Penyaringan dapat dilakukan dengan mengalirkan gas atau cairan melalui
suatu bahan penyaring yang memilki pori-pori cukup kecil untuk menahan
mikroorganisme dengan ukuran tertentu.
 2. Sterilisasi Secara Fisik
PEMANASAN
KERING
Cara ini dapat digunakan
untuk sterilisasi alat-alat
yang berupa logam (ose,
pinset dll) dan gelas (ujung
pipet, bibir tabung, mulut
Erlenmeyer dll) pada
penuangan media. Alat yang
digunakan adalah lampu
spiritus / Bunsen.
Sterilisasi Fisika
BASAH
a. Dengan cara merebus
Sterilisasi dilakukan dengan
cara mendidihkan alat selama
30-60
b. Dengan uap air panas
Sterilisasi ini dikerjakan
dengan pemanasan 100oC
selama 60’.
c. Dengan uap air bertekanan
Sterilisasi dikerjakan dengan
autoklaf pada suhu 120oC
selama 10-20’.
PENYINARAN
• Jenis radiasi yang dapat digunakan
misalnya sinar UV, sinar gamma, sinar
X dan sinar katoda (electron
berkecepatan tinggi).
• Sinar UV mempunyai panjang
gelombang 15-390 nm dan yang paling
tinggi daya bakterisidanya adalah UV
dengan panjang gelombang 265 nm.
3. Sterilisasi secara kimiawi
Proses yang menggunakan suatu bahan (kimia)yg dpt
membunuh mikroorganisme patogen kecuali spora bakteri,
virus & beberapa strain bakteri resisten.

Basanya sterilisasi secara kimiawi menggunakan

senyawa desinfektan antara lain alkohol.
DESINFEKSI
Pemilihan antiseptik terutama tergantung pada kebutuhan
daripada tujuan tertentu serta efek yang dikehendaki.

Zat-zat kimia yang dapat dipakai untuk sterilisasi antara lain

yaitu halogen (senyawa klorin, iodium),
alkohol,fenol,hidrogen feroksida,zat warna ungu kristal,
derivat akridin, rosanalin, detergen, logam berat
(hg,Ag,As,Zn), aldehida, dll.
CIRI DESINFEKTAN YANG IDEAL

• Aktivitas antimicrobial : Memiliki aktivitas antimikrobial dengan spektrum luas.

• Kelarutan : Dapat larut
• Tidak bersifat racun bagi manusia maupun hewan lain.
• Keserbasamaan (homogeneity).
• Tidak bergabung dengan bahan organic.
• Aktivitas antimikrobial pada suhu kamar atau suhu tubuh.
• Kemampuan untuk menembus.
• Tidak menimbulkan karat dan warna.
• Kemampuan menghilangkan bau yang kurang sedap.
• Berkemampuan sebagai detergen.
• Ketersediaan dan biaya.
LANJ...

Beberapa hal yang harus diperhatikan dalam memilih bahan

antimikrobial kimiawi dengan tujuan praktis :
• Sifat bahan yang akan diberi perlakuan
• Tipe mikroorganisme.
• Keadaan lingkungan.
LNJT..
Menurut Lay dan Hastowo (1992), bahan yang menjadi rusak bila
disterilkan pada suhu yang tinggi dapat disterilkan secara kimiawi
dengan menggunakan gas. Bahan kimia yang sering digunakan antara
lain :
- Alkohol
- Chlor
- Yodium
- Formaldehid 8%
- Glutaraldehide
- Gas etilen oksida
- Na. Diklorosasioanurat
- Kloramina
- Klordioksida
- dll
indikator
Indikator Biologi
(Biological
Indicator)
Prinsip kerja indikator
biologi adalah mensterilkan
spora hidup mikroorganisme
yang non-patogenik dan
sangat resisten dalam jumlah
tertentu.
Jenis yang digunakan adalah:
 Bacillus subtilis (sterilisasi
gas ETO dan panas
kering),
 Bacillus pumilus (radiasi
ionisasi)
 Bacillus
stearothermophyllus
(sterilisasi uap).
Indikator Kimia
(Chemical Indicator)
Indikator kimia adalah indikator
yang menandai terjadinya paparan
sterilitas (uap panas atau gas ETO)
pada objek yang disterilkan dengan
adanya perubahan warna. Indikator
kimia diproduksi dalam bentuk strip,
kartu, dan vial.
Beberapa Jenis Indikator Kimia :
 Browne’s sterilizer control tubes
Tabung kecil tertutup yang
mengandung campuran zat dan
indikator. Terjadi perubahan warna
hijau, jika suhu dan waktu
sterilisasi telah tercapai.
 Filter paper strip
 Royce sachet (gas Et-O, etilen
klorhidrin yang terbentuk  kuning
menjadi ungu)
 Dosimeter radiasi (terjadi
perubahan densitas optik karena
radiasi, diukur dengan spektro.UV)
Indikator Fisik
(Physical Indicator)
 Indikator ini digunakan
untuk menilai efesiensi
pompa vakum pada alat
sterilisasi serta untuk
mengetahui adanya
kebocoran udara dalam
ruang sterilisasi.
 Apabila indikator mekanik
berfungsi dengan baik,
maka akan memberikan
informasi segera
mengenai temperatur,
tekanan, waktu, dan
fungsi mekanik lainnya
dari alat.
Inokulum dan inokulasi
Kultivasi pd bioproses
 inokulum

• Kultur mikroba yang diinokulasikan kedalam media

kultivasikultur mikroba aktif yang di panen pada fase
pertumbuhan eksponensial
Kriteria inokulum

• Sehat dalam keadaan aktif

• Tersedia dalam jumlah cukup sehingga memenuhi ukuran inokulum
3-10%
• Berada dalam morfologi yang sesuai
• Bebas dari kontaminasi mikroba lain yg tdk dihendaki
• Dapat mempertahankan kemampuannyauntuk membentuk produk
yang diinginkan dipengaruhi oleh medium kultur
Penyiapan inokulum

• Ditujukan untu perbanyakan sel, bukan pembentukan produk

• Komposisi media untuk inokulum mungkin berbeda gengan media
kultivasi (N tinggiC/N lebih kecil)
• Untuk mempersingkat fase adaptasi sebaiknya midia kultur untuk
inokulum mirip dengan media kultivasi
•
• Pengembangan inokulum– resiko kontaminasi lebih besar—harus
dilakukan secara aseptis dan dilakukan uji kemurnian kultur
mikroskop
inokulasi

• Proses pemindahan biakan murni secara aseptik. jk tekniknya benar

maka yang tumbuh pada hasil pemindahan hanyalah organisme yang
diinginkan saja.
• Biakan murni: biakan yang terdiri dari 1 spesies saja
• Tujuan inokulasi:
1. Untuk pembenihan atau regenerasi mikroorganisme
2. Untuk isolasi dgn maksud memperoleh biakan murni
3. Untuk menyimpan guna keperluan sehari-hari atau dalam waktu lama
4. Untuk mempelajari sifat-sifat pertumbuhan suatu mikroba
Metode inokulasi
Tahap persiapan media

• Cara menuang media pada cawan petri

Inokulasi pada cawan petri
lnj
ljt
Inokulasi pada agar miring

• Untuk memperbanyak koloni bakteri

• Untuk penyimpanan bakteri dalam waktu lama
Inokulasi pada agar miring
Inokulasi pada media semi solid
Inokulasi pada medium cair
Pengamatan
ISOLASI

• Suatu cara untuk memisahkan atau memindahkan mikroba

tertentu dari lingkungannya, sehingga di peroleh kultur murni atau
biakan murni.
• Teknik isolasi mikroorganisme suatu usaha untuk menumbuhkan
mikrobadiluar dari lingkungan alamiahnya
• Tujuannya: u/ memperoleh biakan murni (tdk tercampur) dengan
bakteri lain
• Misal: diisolasi dari tanah, air, udara, darah, sputum dll jumlah
mikroorganisme masih campuran
Teknik kultur

• Spread plate(agar tabur ulas/ sebar)

• Pour plate (tuang)
• Streak plate (gores) 7an: mengisolasi mikroorganisme dari
campuran atau meremajakan kultur kedalam medium baru
Post test

• Jelaskan teknik sterilisas !

• Jelaskan perbedaan isolasi dengan inokulasi!
• Bagaimana cara mensterilisasi alat yang digunakan untuk
pertumbuhan bakteri!
• Sebut dan jelaskan teknik kultur bakteri!
• Jelaskan interpretasi hasil morfologi koloni pada cawan petri,
medium cair dan medium semi solid!