POLYMERASE CHAIN

REACTION

SITI MARYAM
DNA : THE MOLECULE OF LIFE
SEL
DNA
DEVELOPMENT OF MOLECULAR BIOLOGY
TECHNIQUES

DNA
ISOLATION

PURE DNA

IN-VITRO
MANIPULATION

MOLECULAR BIOLOGY
TECHNIQUES
 POLIMERASE CHAIN REACTION (PCR)

• Kary Mullis (1984)

• PENGGANDAAN FRAGMEN SPESIFIK DNA
SECARA INVITRO JUTAAN KOPI
FRAGMEN DNA SECARA CEPAT DAN
AKURAT
• Meniru replikasi in vivo
• Teknik amplifikasi DNA spesifik secara in
vitro
 Prinsip PCR
• PCR: dapat mengamplifikasi urutan DNA spesifik
• Reaksi PCR: mengandung DNA target rantai ganda, dua
primer yang dapat berhibridisasi pada urutan pada
DNA target yang berlawanan, 4 dNTP, dan DNA
polimerase
• Karena, reaksi dipanaskan pada suhu tinggi, PCR
tergantung pada DNA polimerase yang stabil terhadap
panas
• Beberapa DNA polimerasi yang tahan thd panas:
diisolasi dari bakteri termofilik
• Enzim pertama yang digunakan adalah Taq polimerase
(dari Thermus aquaticus)
PCR terdiri dari 3 tahap:
 Denaturasi: campuran reaksi dipanaskan sampai
95oC (15-30 detik) untuk mendenaturasikan DNA
target menjadi rantai tunggal
 Penempelan primer: campuran didinginkan
dengan cepat sampai suhu tertentu yang
memungkinkan dua primer mengikat pada
rantai tunggal DNA target
 Suhu penempelan ini ditentukan dengan hati-hati
untuk menjamin primer hanya mengikat pada
urutan DNA yang diinginkan. Satu primer
mengikat pada masing-masing rantai.
 Elongasi: suhu campuran dinaikkan menjadi 72oC
dan dipertahankan yang memungkinkan DNA
polimerasi mengelongasi primer dengan
mengkopi DNA target rantai tunggal
 Pada akhir inkubasi, DNA target rantai
tunggal menjadi rantai ganda.
 Tiga tahap siklus PCR diulangi. Pada siklus kedua,
empat rantai DNA mengalami denaturasi,
kemudian primer mengikat dan diperluas. Tidak
ada reaktan lain yang perlu ditambahkan.
 Tiga tahap ini diulangi lebih dari sekali untuk
siklus ketiga
 Thermocycler otomatis sekarang ini telah
digunakan untuk mensklus reaksi tanpa interfensi
manual
 Setelah 20 siklus, DNA target (asli) telah
diamplifikasi berjuta kali lipat dan ini akan
meningkat 1000 juta setelah 30 siklus
 Semuanya ini memmerlukan waktu kurang dari
satu jam.
Aplikasi PCR
• PCR dapat mengamplifikasi molekul DNA
tunggal dari campuran kompleks,
menghindari penggunaan kloning DNA
dalam sel untuk mendapatkan molekul DNA
murni yang diinginkan.
• Penentuan urutan basa DNA dapat
disederhanakan dengan PCR, dan aplikasi
ini sekarang sangat umum.
• Dengan menggunakan primer yang sesuai,
melalui PCR dapat dibuat mutasi titik, insersi
dan/atau delesi DNA target yang dapat
membantu analisis ekspresi dan fungsi gen.
• PCR sangat sensitif dan dapat mengamplifikasi DNA dalam
jumlah yang sedikit. Dengan menggunakan primer yang
sesuai, DNA bakteri atau virus dalam jumlah sedikit dapat
dideteksi dalam jaringan. Hal ini menyebabkan PCR tidak
terlalu mahal untuk diagnosa medis.
• PCR cukup murah untuk mengkarakterisasi sampel DNA
secara medis. Misalnya, dalam penentuan penyakit genetik
manusia. Pada penentuan penyakit genetik, PCR didasarkan
pada analisis daerah microsatellites dalam DNA.
Microsatellites ini merupakan urutan di, tri dan tetranukleotida
berulang dalam DNA, yaitu jenis (CA)n atau (CCA)n di mana n
adalah bilangan dari 10 sampai 30. Microsatellites dapat
digunakan sebagai penanda, seperti pada RFLP.
• Karena sensitivitasnya, PCR sangat penting dalam forensik.
PCR mengamplifikasi DNA dari rambut manusia atau tetesan
darah yang tertinggal pada tindakan kriminal untuk
membuktikan tersangkanya.
 Komponen PCR

Templat DNA
Taq DNA polymerase
dNTP (dATP, dGTP, dTTP, dCTP)
Sepasang primer
Buffer (MgCl2)
 Tiga tahap utama dalam PCR

Temperatur

940C
denaturasi
720C
polimerisasi

420C
annealing

Waktu
 Step 1 : Denaturation
Step 2 : Primer Anneals (50 - 65° C)
(separation of double-stranded DNA) by Heat (95° C)

step 3 End of the 1st PCR Cycle

Primer Extension by Taq Polymerase (72° C) Results in 2 Copies of Target Sequence
Polymerase Chain Reaction (PCR)

View
PCR
 A. Double
50º strand DNA

96º B. Denature

50º C. Anneal
primers

Taq
72º D. Polymerase
binds
Taq
1

2
3

4
CYCLE NUMBER AND AMPLICONS
 Detection of PCR Product

• End-Point Detection
Detection of PCR product at the end of the PCR
program
 Gel Based – electrophoresis (agarose or
polyacrylamide gel electrophoresis)
 Real-Time Detection
Detection during the PCR program
 Gel Electrophoresis

Agarose gel

 Pemisahan fragmen DNA berdasarkan ukuran

 Makin kecil ukuran  migrasi makin cepat

 1-2% + ethidium bromide

 Visualized using UV transilluminator

 Gel Documentation

Gel stained with Ethidium bromide Gel Photo

and viewed under UV light.
 Real-Time PCR
Monitors the fluorescence emitted
during the reaction as an indicator of
amplicon production at each PCR
cycle (in real time)
 Real-time Principle

METODE DETEKSI AMPLIFIKASI

1. Hydrolysis probes
(TaqMan, Beacons, Scorpions)
2. Hybridisation probes
(Light Cycler)
3. DNA-binding agents
(SYBR Green)
 SYBR Green®
Jika DNA terdenaturasi
(ssDNA), SYBR Green
tidak berfluoerescensi

SYBR Green® dye

berfluorescensi jika terikat
dengan dsDNA  ada amplicon

Makin banyak terjadi

amplifikasi  makin banyak
amplicon  makin banyak
SYBR Green terikat dengan
dsDNA  intensitas
fluorescensi makin tinggi
Real-time Detection
End-Point
Detection
 Keunggulan PCR

Sensitivitas tinggi (amplifikasi)

Tidak perlu proses pembiakan

Spesifisitas tinggi

Cepat (dalam kurang dari 24 jam)

 APLIKASI PCR
• DIAGNOSTIK
– INFEKSIOUS DISEASE
– GENETIC DISEASES
– DETEKSI MUTASI
• RECOMBINANT TECHNOLOGY
DNA SEQUENSING PATHOGEN DETECTION
The Birth of the Southern Blot, 1975

"Gels used for electrophoresis of nucleic acids and proteins are permeable
This obvious fact didn't dawn on me until I tried to dissolve some agarose
by floating it on a solution of sodium perchlorate and noticed a bead
of liquid form on the top. I reasoned that if DNA molecules were carried
through with the flow it would be possible to capture them on
a nitrocellulose membrane, using the setup shown in the sketch.
The big thrill came when, at the first attempt, I saw genes lit up as
bands after hybridizing with radiolabeled probes.
The Journal of Molecular Biology [initially] rejected the
first manuscript1 as a 'methods paper' and the sketch is
what I sent to people who had heard of the method and
wanted to get on and use it.“

-- Ed Southern, Oxford University

DNA is transferred ("blotted") to filter paper
Filter is exposed to a DNA probe
Probe - single-stranded DNA, base-complementary
to gene of interest
Binds specifically to target DNA immobilized on filter
Radioactively labeled with 32P / 35S-dNTPs
exposes X-ray film
Autoradiogram shows presence / absence & size
of cloned DNA
RFLP differences
[click here for an animation of southern blotting]
DNA probe binds to RNA: "Northern Blot" Is a particular gene
(DNA) expressed as mRNA in a particular tissue?
[Antibody probe binds to protein: "Western Blot"]