“Investigation

of developmental toxicity and

teratogenicity of cyclosporine A, tacrolimus and their
combinations with prednisolone”
Oleh :
Nadire Unver Dogan * , Ismihan Ilknur Uysal , Zeliha Fazliogullari , Ahmet Kagan Karabulut , Hasan
Acar
Nomor Jurnal : 231-222
Istihazah Putri
Nora Handayani
Di presentasikan oleh : Kelompok 7
Nurlika Nuarti
Nurul Susianti
Rinda Hernis

Dosen Pengampu : Dra. Syilfia Hasti, M.Farm.,Apt

Program Studi S1 Farmasi

Sekolah Tinggi Ilmu Farmasi Riau
Pekanbaru
2020
 1. Abstract dan pendahuluan

2. Metode Penelitian
SUB
BAHASAN
3. Hasil

4. Kesimpulan
 penelitian ini bertujuan untuk menyelidiki efek toksik dan
teratogenik dari siklosporin A dan tacro-limus serta
kombinasinya dengan prednisolon menggunakan teknik
A kultur embrio tikus in vitro.
B Siklosporin A (4-40µg/ml), tacrolimus (1-20 µg/ml) dan
S kombinasi obat ini dengan prednisolon (20 µg/ml) diuji
T pada konsentrasi berbeda . Siklosporin A di kombinasi
R dengan prednisolon memiliki efek toksik pada
A pertumbuhan embrionik pada dosis 10 mg / ml. Ketika
C digunakan sendiri, dosis terendah tacrolimus memiliki
T efek embriotoksik. Ditentukan lagi bahwa siklosporin A
menyebabkan hematoma pada 4 mg / ml dan tacrolimus
pada 20 mg / ml menyebabkan tabung saraf terbuka di
samping hematoma. Diamati bahwa siklosporin A pada
dosis 40 mg / ml memiliki efek apoptosis pada tingkat
yang sangat rendah, tacrolimus menyebabkan apoptosis
 Tinjauan Umum
• Imunosupresi tujuannya adalah untuk mencegah penolakan
dan memberikan kekebalan antimikroba, di samping itu,
melindungi embrio dari efek toksik dan teratogenik penekan
kekebalan selama kehamilan diperlukan. Obat utama yang
digunakan dalam imunosupresi adalah inhibitor kalsineurin, dan
glukokortikoid juga direkomendasikan dalam "Panduan Praktik
Terbaik Eropa" untuk digunakan selama kehamilan.

• Namun perawatan ibu hamil dengan obat-obatan ini dapat

mencapai konsentrasi yang cukup tinggi dalam sirkulasi janin
yang secara teoritis berdampak pada fungsi adrenal janin dan
pembentukan struktur janin.
 Seleksi dan kawin tikus

• Seleksi dan kawin tikus Empat betina dan dua jantan tikus Wistar
(Rattus norvegicus), beratnya berkisar antara 150 hingga 200 g dan
dilengkapi dengan kebutuhan air dan nutrisi pada suhu lingkungan
21 C dan lingkungan terang / gelap 12 jam, dimasukkan ke dalam
kandang perkawinan pada jam malam dan disimpan bersama pada
malam hari di Pusat Penelitian Pengobatan Eksperimental Universitas
Selcuk. Pagi berikutnya, tikus betina menjalani pemeriksaan vagina.
Betina yang terdeteksi dengan sperma dimasukkan ke dalam
sangkar lain dengan asumsi mereka hamil selama 0,5 hari. Tikus
ditempatkan di fasilitas penelitian hewan dan dirawat sesuai dengan
pedoman kelembagaan.
 Metode Penelitian
Seleksi dan
kawin tikus

Analisis Penjelasan
statistik embrio

Culture
Uji tunel of
embryos
Evaluasi
morfometrik
dan
morfologis
 Ekplantasi Embrio

• Embrio dikeluarkan pada hari ke 9,5 kehamilan dengan pemberian

eter-anestesi setelah sampel darah mereka dikumpulkan dari aorta
abdominal. Konseptus dieksplorasi dengan membedah uterus,
desidua dan membran Riechert, dan dikultur dengan metode New
Diseksi dilakukan dalam larutan garam seimbang dalam kondisi
aseptik. Embrio diacak dan dipindahkan ke dalam botol kaca steril
(volume 60 ml) yang berisi 1 ml media kultur yang terdiri dari serum
tikus per embrio. Setiap embrio yang rusak dibuang.
 Culture of embryos
• Ada empat atau lima embrio di setiap botol. Serum tikus dikumpulkan kemudian
didistribusikan ke kelompok kontrol dan masing-masing kultur yang dirawat
disiapkan dengan sentrifugasi segera dan inaktivasi panas pada 56 C selama 30
menit, setelah itu darah dikeluarkan dari tikus hamil. 100 IU / ml penisilin dan 100
mg / ml streptomisin ditambahkan ke media kultur untuk mencegah kontaminasi
Sementara serum tikus normal digunakan pada kelompok kontrol, kombinasi biner
dari prednisolon dengan siklosporin A dan tacrolimus pada berbagai konsentrasi
digunakan dalam serum tikus untuk kelompok uji. Setidaknya 10 embrio digunakan
untuk setiap kondisi eksperimental. Jika jumlah embrio yang dieksplorasi pada hari
yang sama kurang dari yang dibutuhkan, percobaan direplikasi dengan kontrol dan
semua dosis agen (4 grub) untuk mencapai jumlah yang diperlukan.
• Grup 1; Variasi konsentrasi siklosporin A ditambahkan ke dalam serum tikus (4 mg /
ml, 10 mg / ml, 20 mg / ml, 30 mg / ml, 40 mg / ml).
• Grup 2; Kombinasi biner dari dosis siklosporin A dalam kelompok 1 dan prednisolon
(20 mg / ml) ditambahkan.
• Grup 3; Memvariasikan konsentrasi tacrolimus (1 mg / ml, 5 mg / ml, 10 mg / ml,
15 mg / ml, 20 mg / ml) ditambahkan.
• Grup 4; Kombinasi biner dari dosis tacrolimus pada kelompok 3 dan prednisolon (20
mg / ml) ditambahkan.
 Evaluasi morfometrik dan morfologis

• Embrio dievaluasi secara morfologis di bawah microscope setelah 48

jam periode kultur yang sesuai dengan 11,5 hari kehamilan
berdasarkan sistem penilaian. Dalam sistem ini, evaluasi dilakukan
dengan memberikan skor numerik 0 - 5 untuk setiap parameter
morfologis. Parameter morfologi; panjang mahkota-pantat, nomor
somites, fleksi(lengkungan) embrio, perkembangan ke depan, otak
tengah, otak belakang dan tabung saraf kaudal, sistem optik, otic
dan olfaktorius, proses rahang atas dan rahang bawah, batang
cabang, batang depan dan belakang dievaluasi . Kelainan yang
diamati pada embrio selama penilaian dicatat dan difoto.
 Uji tunel

• Untuk teknik TUNEL,menggunakan In-Situ Cell Death Detection Kit

dengan fluorescein. Embrio yang evaluasi morfologisnya selesai
setelah kultur embrio dioleskan ke dalam 3 persiapan berbeda
(kontrol negatif, kontrol positif dan kelompok eksperimen) dengan
memotongnya menjadi potongan-potongan dengan pisau bedah dan
mendapatkan suspensi sel terpisah dari masing-masing konsentrasi
obat. Kontrol positif diinkubasi dengan DNase1 selama 10 menit pada
suhu kamar untuk menginduksi istirahat untai DNA. Kontrol negatif
diinkubasi dengan solusi label saja (tanpa terminalase). Setiap
persiapan dievaluasi dengan mikroskop fluoresensi. 500 sel yang
diwarnai dengan DAPI (40, 6-diamidino-2-phenylindole) dihitung pada
setiap sampel, dan jumlah sel positif TUNEL (pewarnaan fluorescent
hijau) diberikan sebagai persentase.
 Analisis statistik

Skor morfologis dan bilangan somit yang tidak terdistribusi normal

dianalisis dengan menggunakan analisis satu arah varians (ANOVA)
non-parametrik Kruskalle Wallis. Jika ada perbedaan signifikan yang
ditemukan dalam data, ManneWhitney U-tes selanjutnya digunakan
untuk menunjukkan di mana letak perbedaannya. Variabel
pertumbuhan lainnya seperti diameter kantung kuning telur dan
panjang mahkota pantat dianalisis dengan ANOVA satu arah dan uji
rentang ganda Duncan( didasarkan pada sekumpulan nilai beda nyata
yg ukurannya semakin besar) untuk beberapa perbandingan. Insiden
malformasi dianalisis dengan uji eksak Fisher antara kelompok
eksperimen dan kontrol. Data dianggap signifikan secara statistik pada
P <0,05, P <0,01 dan P <0,001.
 Hasil
Diamati berdasarkan antara kelompok kontrol
dan empat kelompok eksperimen.
Hasil Grup 1
Dengan Dosis siklosporin A yang berbeda
(4 - 40 mg / ml) ditambahkan ke dalam
serum tikus, efek toksik tergantung dosis
pada dosis lebih dari 10 mg / ml pada
pertumbuhan dan perkembangan embrio
diamati. (Siklosporin A lebih dari 10 mg /
ml ditentukan untuk menginduksi
hematoma di lokasi yang berbeda
Pertumbuhan dan perkembangan
embrionik dengan adanya siklosporin A (4-
40 mg / ml). WRS, serum tikus utuh. Nilai
rata-rata ± SEM. Tanda bintang
menunjukkan perbedaan yang signifikan
dari nilai kontrol pada * P <0,05, ** P
 Pandangan lateral embrio tikus pada usia
kehamilan 11,5 hari, setelah kultur 48 jam
dengan adanya serum tikus utuh dan
konsentrasi siklosporin A yang berbeda (4-40
mg / ml).
 Hasil Grup 2

Ketika embrio dikultur dengan

peningkatan dosis siklosporin A (4-
40 mg / ml) dan kombinasi
prednisolon (20 mg / ml) diperiksa,
toksisitas diamati pada semua
parameter perkembangan pada
kelompok eksperimen. Efek toksik ini
ditentukan lebih tinggi daripada efek
dosis siklosporin A yang sama saja.
Ditetapkan bahwa siklosporin A (4 - 40
mg / ml) dan kombinasi prednisolon tidak
memiliki teratogenik yang signifikan efek
kecuali hematoma di lokasi yang
Pandangan lateral embrio tikus pada usia kehamilan 11,5
hari, setelah kultur 48 jam dengan adanya serum tikus
utuh dan konsentrasi siklosporin A (4-40 mg / ml) yang
berbeda þ prednisolon (20 mg / ml).
 Hasil Grup 3

Ketika embrio dikultur dengan berbagai

konsentrasi tacrolimus dalam peningkatan
dosis (1-20 mg / ml) diperiksa, efek
embriotoksik diamati pada jumlah total skor
morfologi dan beberapa dari dosis terendah
obat (1 mg / ml) dalam tes kelompok, dan
pada pengukuran panjang mahkota-pantat
dari dosis 5 mg / ml .Hematoma terdeteksi
dalam embrio di berbagai lokasi dari dosis
tacrolimus terendah (1 mg / ml) tergantung
pada dosis. Pada dosis tertinggi (20 mg / ml),
tabung saraf terbuka terdeteksi
Pandangan lateral embrio tikus pada usia
kehamilan 11,5 hari, setelah kultur 48 jam
dengan adanya serum tikus utuh dan
konsentrasi tacrolimus yang berbeda
(1-20 mg / ml).
Hasil Grup 4
Pandangan lateral embrio tikus pada
usia kehamilan 11,5 hari, setelah kultur
48 jam dengan adanya serum tikus utuh
dan konsentrasi tacrolimus yang
berbeda (1-20 mg / ml) þ prednisolon
(20 mg / ml).

Hematoma di otak depan (panah)

disebabkan oleh tacrolimus (10 mg / ml)
(a) odema dalam tabung saraf caudal
(panah) yang disebabkan oleh tacrolimus (5
mg / ml) þ prednisolon (20 mg / ml)
(b), dan tabung saraf terbuka (panah) yang
disebabkan oleh tacrolimus (15 mg / ml) þ
prednisolon (20 mg / ml)
(c) pada embrio tikus yang dikultur selama
48 jam in vitro. 
 Hasil apoptosis

A. efek apoptosis diamati

dimulai dengan dosis 40 mg /
ml pada tingkat yang sangat
rendah (1,7%), dan efek ini
meningkat (10,1%) dengan Pewarnaan TUNEL dari siklosporin A (30
penambahan prednisolon ke mg / ml) dan prednisolon (20 mg / ml)
dalam medium. (a) dan takrolimus (20 mg / ml)
(b) apoptosis yang diinduksi dalam sel
embrionik in vitro (100).
B. morfologi sel berubah dari 5
mg / ml, dan setelah 15 mg / ml
apoptosis diamati pada tingkat
tinggi (78%) ketika tacrolimus
ditambahkan ke dalam media
kultur
 Kesimpulan

Peneliti menarik kesimpulan :

Bahwa dosis harus ditentukan dengan hati-hati ketika siklosporin A dan
tacrolimus diperlukan untuk diberikan kepada wanita hamil dengan
kombinasi prednisolon, karena prednisolon meningkatkan efek toksik
siklosporin A, dan meningkatkan efek teratogenik dari tacrolimus.