Journal Reading

“The Cyclin Dependent Kinase Inhibitor Protein 21 Cytoplasmic Expression Depressing the
Apoptosis of Human Bronchial Epithelial Cell”

Yulia Putri (207008014)

Latar Belakang
Apoptosis dan peradangan berhubungan satu sama lain dalam perkembangan penyakit paru-
paru. Apoptosis adalah prosedur kompleks yang diatur oleh banyak orang faktor termasuk cyclin-
dependent kinase (CDK) inhibitor protein 21 (P21) dan sitokin sebagai transformation growth
factor β1 (TGF-β1). Pada kanker dan sel prematur lainnya P21 menghambat siklus sel untuk
membuat sel apoptosis dan kematian, ketika ekspresinya sangat tinggi dalam inti sel dan
menghambat apoptosis sel saat diekspresikan tinggi di sitoplasma sel. Dalam penelitian
sebelumnya P21 ditemukan sangat tinggi ekspresinya pada alveolar makrofag dan sel epitel jalan
napas perokok, serta pada sel epitel pendrita bronkial asma dan ekspresi P21 berkorelasi dengan
apoptosis sel-sel ini. Penelitian sebelumnya tidak mempelajari hubungan apoptosis sel dengan
ekspresi P21 dalam sitoplasma atau di inti sel paru-paru. Protein TGF-β adalah sitokin multifungsi
yang telah terlibat di patogenesis berbagai proses biologis termasuk pertumbuhan sel dan
kelangsungan hidup, diferensiasi sel dan jaringan, perkembangan, peradangan, kekebalan,
hematopoiesis, renovasi dan perbaikan jaringan. TGF-β1 dapat menginduksi apoptosis melalui P21.
Belum ada studi tentang hubungan ekspresi P21 sitoplasma dengan apoptosis sel yang distimulasi
oleh TGF-β1. Penelitian ini mempelajari hubungan antara ekspresi P21 sitoplasma dengan
apoptosis sel epitel bronkus manusia 16HBE dengan stimulasi oleh TGF-β1.
 Masalah : Bagaimanakah pengaruh P21 sitoplasma terhadap regulasi
apoptosis sel epitel bronkus pada manusia?
 Tujuan : Untuk mengetahui pengaruh P21 sitoplasma terhadap regulasi
apoptosis sel epitel bronkus pada manusia
 Manfaat : mengetahui pengaruh P21 sitoplasma terhadap regulasi
apoptosis sel epitel bronkus pada manusia
Metodologi Penelitian
 Pengambilan dan Kultur Sel
Epithelial cell line manusia 16HBE (The Experimental Medical Research Center, Guangzhou
Medical University, China) yang disimpan dalam nitrogen cair, kemudian dikultur menggunakan
media Eagle yang telah dimodifikasi Dulbecco (tinggi glukosa)dengan penambahan 10% serum
janin sapi (Gibco) pada suhu 37 ° C dan 5% CO2.
 Preparasi Plasmid
Plasmid PEGFP-N1-p21 dibeli dari Shang Hai Invitrogen Corporation yang telah di perbanyak pada
E. Coli dan diekstraksi sesuai dengan struktur endotoksin bebas pada kit ekstraksi plasmid
(OMEGA Corporation).
 Transfeksi dan Analisis Ekspresi dari Plasmid PEGFP-N1-p21
Kelompok percobaan dibagi menjadi 2 kelompok yaitu kontrol (plasmid kosong) dan
plasmid PEGFP-N1-p21. Proses transfeksi dilakukan sesuai dengan struktur dari kit tranfeksi
Lipofactamine 2000 (American Invitrogen Corporation) yang telah dimodifikasi. Setelah
ditranfeksi maka diperiksa dengan menganalisis mRNA dan protein dari P21 yang berada di inti dan
sitoplasma
 Stimulasi TGF- β1pada Sel Line Epitel Manusia 16HBE
The 1-5×106 16HBE sel telah kultur pada 6 lubang kultur palet. Sebelum
distimulasi, sel dikultur pada DMEM dengan 0,5% FBS dalam 12 jam. TGF-β1 akan
ditambahkan pada kultur sel 5×106 16HBE dengan konsentrasi 0ng/ml, 3ng/ml, 10ng/ ml
 Menganalisis Apoptosis Sel dengan Menggunakan Sitometri Flow
Suspensi singel sel dari 16HBE disetrifugasi pada 2000rpm dalam 5mnt.
Sesuai dengan kit apoptosis, agregasi se akan dicampur dengan 500ul Buffer pengikat, 5ul
Annexin-FITC, 5ul PI. Campuran dari larutan tersebut kemudian diinkubasi pada suhu
ruang selama 10mnt. Apoptosis akan dideteksi dengan sitometri flow.
 Pemeriksaan Ekspresi dari P21 di Sitoplasma dan Inti
Protein sitoplasma dan inti akan diekstraksi sesuai dengan kit ekstraksi protein
sitoplasma dan inti (Sigma). Ekspresi dari P21 akan dideteksi dengan menggunakan metode
Western-blot.
 Analisis Data
Analisis data menggunakan SPSS 17.0. Data singel faktor varian akan
menggunakan metode T-test dan ONE WAY ANOVA untuk data faktor multivariat. Data
yang berada di bawah dan di antara akan dianalisis menggunakan metode LSD.
Hasil
 Ekspresi Gen dari Plasmid PEGFP-N1-p21 Setelah ditrankesi pada 16HBE
Setelah transfeksi maka ekspresi dari akan diperiksa menggunakan RT-PCR. Dapat dilihat
bahwa terdapat ekspresi dari PEGFP-N1-p21 dan β-aktin

 Ekspresi Protein dari Plasmid PEGFP-N1-p21 Setelah Ditransfeksikan pada 16HBE

Setelah transfeksi maka sitoplasma dan inti dari plasmid P EGFP-N1-p21 ,plasmid PEGFP dan
plasmid kosong akan diperiksa dengan menggunakan metode western-blot.
 Analisis Apoptosis 16HBE setelah Transfeksi Plasmid P21
Setelah ditransfeksi dengan plasmid selama 24&48 jam, sel 16HBE dikumpulkan untuk
menganalisis apoptosis dengan sitometri flow. Hasil menunjukkan bahwa apoptosis sel 16HBE
setelah tranfeksi PEGFP-N1-p21 menurun. Apoptosis sel 16HBE menurun seiring dengan penurunan
transfeksi PEGFP-N1-p21, tetapi juga menurun pada sel yang tidak ditransfeksi P EGFP-N1-p21

Tabel menunjukkan bahwa hasil signifikan antara ketiga kelompok dengan persentase
terendah pada PEGFP-N1-p21 , sedangkan kelompok PEGFP dan blank sama. Selain itu pada
kelompok PEGFP-N1-p2 hasil apoptosis paling rendah terjadi pada sel yang telah ditransfeksi 48
jam.
 Analisis Apoptosis 16HBE setelah Stimulasi TGF-β1
Setelah distimulasi dengan TGF-β1 selama 12 jam dan 24 jam, sel dikumpulkan dan
dianalisis persentase apoptosisnya menggunakan sitometry flow. Hasil akan menunjukkan
bahwa pada waktu stimulasi yang sama persentase dari apoptosis meningkat seiring dengan
konsentrasi yang diberikan dan pada konsentrasi yang sama persentase apoptosis meningkat
seiring dengan meningkatnya waktu stimulasi.
dari tabel dapat dilihat bahwa stimulasi TGF-β1 meningkatkan persentase apoptosis jika
ekspresinya meningkat.
 Ekspresi dari Protein P21 setelah stimulasi 16HBE dengan TGF-β1
Setelah stimulasi dengan TGF-β1 selama 24 jam, sitoplasma dan inti Protein P 21 dari
kelompok 0ng/ml TGF-β1, 3ng/ml TGF-β1 and 10ng/ml TGF-β1 akan diekstraksi dan diuji
menggunakan Western-blot.

Dan dapat dilihat bahwa ekspresi dari protein P21 terdapat dalam sitoplasma dan inti namun
paling banyak terdapat pada sitoplasma kelompok 3ng/ml TGF-β1.
 Analisa Hubungan Ekspresi dari Protein P21 dan apoptosis dari 16 HBE setelah stimulasi
TGF-β1
Kombinasi dari hasil point 4 dan 5, dapat dikatakan bahwa protein P 21 paling tinggi
diekspresikan pada sitoplasma dari sel setelah stimulasi dengan TGF-β1, dan apoptosis dari sel
16HBE meningkat saat ekspresi P21 sitplasma menurun setelah kontensentrasi dari stimulasi
TGF-β1 meningkat.
Kesimpulan
Apoptosis dari sel 16HBE akan dihambat dengan tingginya ekspresi P21 sitoplasma
dengan mentransfeksi PEGFP-N1-p21. Stimulasi TGF-β1 akan menjadi promoter apoptosis sel
16HBE dengan menghambat eksprsi P21 sitoplasma. Sehingga dapat dikatakan bahwa ekspresi
P21 sitoplasma dapat menekan apoptosis sel 16HBE
Terimakasih....