Teknik Dasar Mikrobiologi

Sumber dan Pencegahan

Kontaminasi Pada Biakan Sel
Deajeng Laras H. - 2006541782
Rifdah Hanifah - 2006542021
SUMBER KONTAMINASI

1. Teknik pengoprasian
Contohnya : teknik pipetting
2. Lingkungan
Contohnya : Lingkungan kerja, meja kerja,
3. Penggunaan dan Perawatan Laminar-Flow Hood
- Apabila isi laminar terlalu penuh sehingga menganggu aliran udara dan
pergerakan operator
- Perawatan filter dan kabinet kerja.
1. Kelembaban inkubator
- Apabila kelembaban terganggu
- Sistem pemantauan CO2
Perawatan → Fungisida dan Pembersihan rutin
Sumber Kontaminasi

5. Penyimpanan beku
- Kondensasi yang terbentuk setiap kali pintu dibuka, sehingga udara lembab.
6. Bahan-bahan steril
- Akibat kegagalan saat proses sterilisasi
7. Imported Cell line dan biopsi
- Pemindahan cell line memungkinkan kontaminasi
8. Quarantine
- Pemisahan kultur atau bahan yang baru masuk ke lab.
- Cap disemprot dan diusap dengan alkohol 70% yang mengandung desinfektan
fenolik 2% setelah digunakan.
 Tipe Kontaminasi
1. Bakteri
2. Kapang atau Khamir
3. Mycoplasma

Mikoplasma tidak selalu menunjukkan keberadaannya

melalui perubahan makroskopik sel atau medium.
Banyak kontaminan mikoplasma, terutama pada
Continuous Cell Line, tumbuh lambat dan tidak
menghancurkan sel inang. Namun, mereka dapat
mengubah metabolisme kultur dengan berbagai cara.
Karena mikoplasma mengambil timidin dari media,
kultur yang terinfeksi menunjukkan pelabelan abnormal
dengan timidin [3H].
Pencegahan Kontaminasi
Permukaan dan peralatan yang tidak steril
Tumpahan di leher dan di luar botol dan di permukaan
kerja
Menyentuh atau menahan pipet terlalu rendah,
menyentuh leher botol, di dalam tutup ulir
Splash-back dari gelas limbah
Debu sedimen atau partikel kulit yang menempel pada
biakan atau botol; tangan atau peralatan yang
dipegang di atas piring atau botol terbuka
Bersihkan area kerja dari barang-barang yang tidak
langsung digunakan.
Usap secara teratur dengan alkohol 70%. Jangan
menuangkan cairan. Keluarkan atau transfer dengan
pipet, autodispenser, atau perangkat transfer. Jika
penuangan tidak dapat dihindari: (1) lakukan dengan
satu gerakan halus, (2) buang botol tempat Anda
menuangkan, dan (3) bersihkan tumpahan.
Pegang pipet dengan tepat.
Buang limbah ke dalam gelas kimia dengan corong
atau, lebih disukai, dengan menarik limbah ke dalam
reservoir dengan menggunakan pompa vakum.
Jangan bekerja di atas (aliran laminar vertikal dan
bangku terbuka) atau di belakang dan di atas (aliran
laminar horizontal) botol atau piring terbuka.
Debu dan tumpahan Usap permukaan dengan alkohol 70% sebelum, dan
setelah bekerja.
Segera bersihkan tumpahan.

Debu dari kulit, rambut, atau pakaian jatuh atau tertiup Cuci tangan dengan bersih atau kenakan sarung
ke dalam kultur. tangan. Kenakan jas lab bebas serat dengan manset
ketat dan sarung tangan yang menutupinya.

Aerosol dari berbicara, batuk, bersin, dll.
Tetaplah berbicara seminimal mungkin, dan jauhi
pekerjaan saat Anda berbicara.
Hindari bekerja dengan pilek atau infeksi tenggorokan,
atau kenakan masker.
Ikat rambut panjang ke belakang atau kenakan topi.
Kenakan jas lab yang berbeda dari yang Anda pakai di
area lab umum atau kandang hewan.

Reagen dan media tidak steril Saring atau larutan autoklaf sebelum
menggunakannya.

Kondisi penyimpanan kotor Bersihkan area penyimpanan dan disinfeksi secara

teratur.
Prosedur sterilisasi yang tidak memadai
Pemasok komersial yang buruk
Debu dan spora dari penyimpanan
Sterilisasi yang tidak efektif (misalnya, oven yang terisi
penuh atau botol tertutup rapat, mencegah masuknya
uap).
Sterilisasi tidak efektif
Pantau kinerja autoklaf dengan termometer perekam
atau indikator sterilitas.
Periksa integritas filter dengan titik gelembung atau uji
mikroba setelah menggunakannya.
Uji semua larutan setelah sterilisasi.
Solusi uji; ganti pemasok.
Tutup dengan foil. Bersihkan botol dengan alkohol 70%
sebelum memasukkannya ke dalam kap mesin.
Ganti stok dari bagian belakang rak. Jangan
menyimpan apa pun yang tidak disegel selama lebih
dari 24 jam.
Periksa suhu beban sepanjang siklus. Di dalam
autoklaf, tutup botol kosong tetap kendur. Tumpuk
oven dan autoklaf dengan benar.
Sterilkan barang dengan panas kering sebelum
digunakan.
Pantau kinerja oven.
Kontak dengan permukaan yang tidak steril atau bahan
lain
Debu dan spora dari inkubator atau kulkas
Kondisi penyimpanan atau inkubasi yang kotor
Media di bawah tutup dan menyebar ke luar botol
Draf, pusaran, turbulensi, debu, aerosol
Mensterilkan ulang instrumen. (Gunakan alkohol 70%;
bakar dan dinginkan instrumen.)
Jangan pegang bagian mana pun dari instrumen atau
pipet yang akan masuk ke wadah kultur.
Gunakan tutup sekrup alih-alih sumbat. Usap botol
sebelum dimasukkan ke dalam kap mesin. Piring dan
piring kotak.
Tutup penutup dan leher botol dengan aluminium foil
selama penyimpanan atau inkubasi.
Bersihkan termos dan botol dengan alkohol 70%
sebelum digunakan.
Bersihkan toko dan inkubator secara teratur.
Buang semua botol yang menunjukkan tumpahan di
bagian luar leher. Jangan tuangkan.
Membersihkan udara yang disaring.
Kurangi lalu lintas dan aktivitas asing.
Bersihkan lantai dan permukaan kerja secara teratur.
Filter berlubang
Penggantian filter diperlukan
Tumpahan, terutama di celah-celah atau di bawah
permukaan kerja
Pertumbuhan jamur dan bakteri pada tumpahan
Pertumbuhan jamur dan bakteri di dinding dan rak
dalam suasana lembab
Spora, dll., dibawa pada sirkulasi udara paksa
Periksa filter secara teratur dari lubang dan kebocoran.
Periksa penurunan tekanan pada filter.
Bersihkan di sekitar dan di bawah permukaan kerja
secara teratur. Biarkan alkohol mengalir ke celah-
celah.
Bersihkan tumpahan dengan alkohol 70% pada swab.
Bersihkan inkubator secara teratur.
Bersihkan dengan deterjen diikuti dengan alkohol 70%
Lampirkan piring terbuka dalam kotak plastik dengan
tutup yang pas (tapi jangan tutup tutupnya).
Usap inkubator dengan alkohol 70% sebelum
membukanya.
Masukkan fungisida atau bakteriosida ke dalam air
yang melembabkan (tetapi periksa dulu apakah ada
toksisitas).
Debu pada silinder, pompa, dll
Masuknya tungau, dll., ke dalam kemasan steril
Terinfeksi pada sumbernya atau selama pembedahan
Lap dengan alkohol 70% sebelum dibawa masuk.
Tutup semua kemasan steril.
Hindari furnitur kayu jika memungkinkan; gunakan
laminasi plastik, satu potong, atau atasan bangku
stainless steel.
Jika furnitur kayu digunakan, tutup dengan pernis
poliuretan atau semir lilin dan cuci secara teratur
dengan disinfektan.
Jauhkan hewan dari lab kultur jaringan
Jangan membawa hewan ke dalam lab kultur jaringan.
Masukkan antibiotik ke dalam cairan diseksi.
Celupkan semua sampel jaringan besar yang
berpotensi terinfeksi ke dalam alkohol 70% selama 30
detik.
Terkontaminasi di sumbernya atau selama transit Tangani jalur sel ini sendiri, sebaiknya di karantina,
setelah semua pekerjaan steril lainnya selesai. Usap
ke bawah bangku atau kap mesin setelah digunakan
dengan desinfektan fenolik 2% dalam alkohol 70%, dan
jangan gunakan sampai keesokan paginya.

Periksa kontaminasi dengan menumbuhkan kultur

selama dua minggu tanpa antibiotik. (Simpan kultur
duplikat dalam antibiotik pada subkultur pertama.)

Periksa kontaminasi secara visual, dengan mikroskop

fase kontras dan pewarnaan Hoechst untuk
mikoplasma. Menggunakan sel indikator
memungkinkan penyaringan sebelum subkultur
pertama.
Referensi

I Freshney. Culture of Mammalian Cells 5th edition.

TAHAPAN BIAKAN JARINGAN
Metode Pemeriksaan Virus

1. Pemeriksaan langsung : mikroskopik dan pewarnaan

2. Kultur Virus
3. Enzyme-linked Virus- Inducible System (ELVIS)
4. Deteksi Antigen
5. Immune electron microscopy
6. NAAD (Nucleic Acid Amplification and Detection)
7. Sekuensing asam nukleat
TAHAPAN KULTUR CL DARI SIMPAN BEKU

● Thawing (Pencairan) Sel : pd suhu 37° C, di Inkubator

atau Penangas air
● Suspensi sel dimasukan ke dalam tabung berisi medium
● Pencucian sel dengan sentrifugasi 5 menit pada 1000 rpm
● Perhitungan jumlah sel dengan Neubauer chamber
● Sel siap di kultur di TC flask atau Multi-well dish, di

Incubator 37 °C, CO2 5%