Kuantitasi Mikrobe : Hitungan Cawan

KUANTITASI MIKROBE HITUNGAN CAWAN

I. TUJUAN Melatih melakukan pengenceran serial dan menentukan konsentrasi suspensi bakteri dengan metode hitungan cawan.

I. TEORI Mikrobiologi adalah ilmu yang mempelajari organisme hidup yang berukuran sangat kecil sehingga tidak dapat dilihat dengan mata telanjang malainkan dengan bantuan mikroskop. Organisme yang sangat kecil ini disebut sebagai mikroorganisme atau yang sering disebut mikroba atau jasad renik. Dunia mikroorganisme terdiri dari lima kelompok, yaitu bakteri, protozoa, virus, algae, dan jamur. Mikroorhanisme sangat erat dengan kehidupan sehari-hari. Beberapa di antaranya ada yang menguntungkan dan ada yang merugikan (Handymom, 2009). Bakteri merupakan organisme yang paling banyak jumlahnya dan lebih tersebar luas dibandingkan mahluk hidup yang lain. Bakteri memiliki ratusan ribu spesies yang hidup di darat hingga lautan dan pada tempat-tempat yang ekstrim. Bakteri ada yang menguntungkan tetapi ada pula yang merugikan. Bakteri memiliki ciri-ciri yang membedakannya dengan mahluk hidup yang lain. Bakteri adalah organisme uniselluler dan prokariot serta umumnya tidak memiliki klorofil dan berukuran renik (mikroskopis) (Adi, 2008). Ciri-ciri Bakteri Bakteri memiliki ciri-ciri yang membedakannnya dengan mahluk hidup lain yaitu: 1. Organisme multiselluler 2. Prokariot (tidak memiliki membran inti sel ) 3. Umumnya tidak memiliki klorofil

Laboratorium Mikrobiologi Dasar

Kuantitasi Mikrobe : Hitungan Cawan

4. Memiliki ukuran tubuh yang bervariasi antara 0,12 s/d ratusan micron umumnya memiliki ukuran rata-rata 1 s/d 5 mikron. 5. Memiliki bentuk tubuh yang beraneka ragam 6. Hidup bebas atau parasit 7. Yang hidup di lingkungan ekstrim seperti pada mata air panas,kawah atau gambut dinding selnya tidak mengandung peptidoglikan 8. Yang hidupnya kosmopolit diberbagai lingkungan dinding selnya mengandung peptidoglikan Struktur Bakteri Struktur bakteri terbagi menjadi dua yaitu: 1. Struktur dasar (dimiliki oleh hampir semua jenis bakteri) Meliputi: dinding sel, membran plasma, sitoplasma, ribosom, DNA, dan granula penyimpanan 2. Struktur tambahan (dimiliki oleh jenis bakteri tertentu) Meliputi kapsul, flagelum, pilus, fimbria, klorosom, Vakuola gas dan endospora. Struktur dasar sel bakteri

Laboratorium Mikrobiologi Dasar

Kuantitasi Mikrobe : Hitungan Cawan

Struktur dasar bakteri : 1. Dinding sel tersusun dari peptidoglikan yaitu gabungan protein dan polisakarida (ketebalan peptidoglikan membagi bakteri menjadi bakteri gram positif bila peptidoglikannya tebal dan bakteri gram negatif bila peptidoglikannya tipis). 2. Membran plasma adalah membran yang menyelubungi sitoplasma tersusun atas lapisan fosfolipid dan protein. 3. Sitoplasma adalah cairan sel. 4. Ribosom adalah organel yang tersebar dalam sitoplasma, tersusun atas protein dan RNA. 5. Granula penyimpanan, karena bakteri menyimpan cadangan makanan yang dibutuhkan.

Laboratorium Mikrobiologi Dasar

Kuantitasi Mikrobe : Hitungan Cawan

granula Struktur tambahan bakteri : 1. Kapsul atau lapisan lendir adalah lapisan di luar dinding sel pada jenis bakteri tertentu, bila lapisannya tebal disebut kapsul dan bila lapisannya tipis disebut lapisan lendir. Kapsul dan lapisan lendir tersusun atas polisakarida dan air. 2. Flagelum atau bulu cambuk adalah struktur berbentuk batang atau spiral yang menonjol dari dinding sel. 3. Pilus dan fimbria adalah struktur berbentuk seperti rambut halus yang menonjol dari dinding sel, pilus mirip dengan flagelum tetapi lebih pendek, kaku dan berdiameter lebih kecil dan tersusun dari protein dan hanya terdapat pada bakteri gram negatif. Fimbria adalah struktur sejenis pilus tetapi lebih pendek daripada pilus. 4. Klorosom adalah struktur yang berada tepat dibawah membran plasma dan mengandung pigmen klorofil dan pigmen lainnya untuk proses fotosintesis. Klorosom hanya terdapat pada bakteri yang melakukan fotosintesis. 5. Vakuola gas terdapat pada bakteri yang hidup di air dan berfotosintesis. 6. Endospora adalah bentuk istirahat (laten) dari beberapa jenis bakteri gram positif dan terbentuk didalam sel bakteri jika kondisi tidak menguntungkan bagi kehidupan bakteri. Endospora mengandung sedikit sitoplasma, materi

Laboratorium Mikrobiologi Dasar

Kuantitasi Mikrobe : Hitungan Cawan

genetik, dan ribosom. Dinding endospora yang tebal tersusun atas protein dan menyebabkan endospora tahan terhadap kekeringan, radiasi cahaya, suhu tinggi dan zat kimia. Jika kondisi lingkungan menguntungkan endospora akan tumbuh menjadi sel bakteri baru. Bentuk Bakteri Bentuk dasar bakteri terdiri atas bentuk bulat (kokus), batang (basil),dan spiral (spirilia) serta terdapat bentuk antara kokus dan basil yang disebut kokobasil. Berbagai macam bentuk bakteri : 1. Bakteri Kokus :

a. Monokokus, yaitu berupa sel bakteri kokus tunggal b. Diplokokus,yaitu dua sel bakteri kokus berdempetan c. Tetrakokus, yaitu empat sel bakteri kokus berdempetan berbentuk segi empat. d. Sarkina, yaitu delapan sel bakteri kokus berdempetan membentuk kubus e. Streptokokus, yaitu lebih dari empat sel bakteri kokus berdempetan membentuk rantai. f. Stapilokokus, yaitu lebih dari empat sel bakteri kokus berdempetan seperti buah anggur

Laboratorium Mikrobiologi Dasar

Kuantitasi Mikrobe : Hitungan Cawan

2. Bakteri Basil :

a. Monobasil, yaitu berupa sel bakteri basil tunggal b. Diplobasil, yaitu berupa dua sel bakteri basil berdempetan c. Streptobasil, yaitu beberapa sel bakteri basil berdempetan membentuk rantai

Laboratorium Mikrobiologi Dasar

Kuantitasi Mikrobe : Hitungan Cawan

3. Bakteri Spirilia :

a. Spiral, yaitu bentuk sel bergelombang b. Spiroseta, yaitu bentuk sel seperti sekrup c. Vibrio, yaitu bentuk sel seperti tanda baca koma (Adi, 2008)

Bentuk- bentuk bakteri secara sederhana dapat dibandingkan seperti pada gambar berikut ini:

Laboratorium Mikrobiologi Dasar

Kuantitasi Mikrobe : Hitungan Cawan

Sementara pada pengamatan menggunakan mikoroskop, bentuk bakteri dapat dilihat seperti gambar berikut ini

Laboratorium Mikrobiologi Dasar

Kuantitasi Mikrobe : Hitungan Cawan

Berbagai bentuk bakteri

PEMBIAKAN BAKTERI Pada umumnya bakteri hanya mengenal satu macam pembiakan saja, yaitu pembiakan secara aseksual atau vegetatif. Pembiakan ini berlangsung cepat, jika faktor-faktor luar menguntungkan. Pelaksanaan pembiakan yaitu dengan pembelahan diri atau divisio. Pembelahan diri dapat dibagi atas 3 fase, yaitu : a. Fase Pertama, dimana sitoplasma terbelah oleh sekat yang tumbuh tegak lurus pada arah memanjang. b. Sekat tersebut diikuti oleh suatu dinding melintang. Dinding melintang ini tidak selalu merupakan penyekat yang sempurna, di tengah-tengah sering ketinggalan suatu lubang kecil, dimana protoplasma kedua sel baru masih tetap berhubung-hubungan. Hubungan protoplasma disebut plasmodesmida. c. Fase Terakhir telah terpisahnya kedua sel. Ada bakteri yang segera berpisah, yaitu yang satu terlepas sama sekali daripada yang lain, setelah dinding melintang menyekat secara sempurna. Bakteri yang semacam ini merupakan koloni yang merata, jika diftara pada medium padat. Sebaliknya, bakteri-bakteri yang dindingnya lebih kokoh itu tetap bergandengan setelah pembelahan. Bakteri macam ini merupakan koloni yang kasar permukaannya.

Laboratorium Mikrobiologi Dasar

Kuantitasi Mikrobe : Hitungan Cawan

Jika faktor-faktor luar menguntungkan, maka setelah terjadi pembelahan, sel-sel baru membesar sampai masing-masing menjadi sebesar induk sel. Hal ini dimungkinkan karena gampangnya peresapan zat makanan yang tersedia di dalam Medium. Medium adalah bahan yang digunakan untuk menumbuhkan mikroorganisme di atas atau di dalamnya. Persyaratan untuk membuat medium itu amat beragam, diantaranya yang utama adalah air, karbon, energi, mineral dan faktor tumbuh. Pertumbuhan mikroorganisme tergantung dari tersedianya air. Bahanbahan yang terlarut dalam air, yang digunakan oleh mikroorganisme untuk membentuk bahan sel dan memperoleh energi, adalah bahan makanan. Air merupakan komponen utama protoplasma (70-85% protoplasma terdiri dari air) serta wahana bagi masuknya nutrien ke dalam sel dan keluarnya sekresi ataupun sekresi dari dalam sel. Selain itu air juga diperlukan untuk berlangsungnya reaksireaksi enzimatik di dalam sel. Air yang digunakan adalah air suling. Air sadah

Laboratorium Mikrobiologi Dasar

10

Kuantitasi Mikrobe : Hitungan Cawan

tidak dapat digunakan karena pada medium yang mengandung pepton dan ekstrak daging dapat menyebabkan terbentuknya endapan posfat dan Magnesium fosfat. Berdasarkan pada sumber karbon yang digunakan, organisme dibagi menjadi dua kelompok, yaitu : a. Organisme autotrof b. Organisme Heterotrof : : Organisme yang dapat mensintesis semua komponen selnya dari karbon dioksida. Organisme yang memerlukan satu atau lebih senyawa organik sebagai sumber karbonnya termasuk karbon dioksida. Sedangkan berdasarkan sumber energinya, organisme dikelompokkan menjadi sebagai berikut : a. Fotoautotrof b. Kemoautotrof : : Autotrof yang dapat memanfaatkan energi cahaya matahari dengan bantuan pigmen fotosintetiknya. Autotrof yang memperoleh energi dari oksidasi senyawa-senyawa anorganik sederhana (seperti nitrit, nitrat atau sulfida) c. Kemoheterotrof d. Fotoheterotrof : : Heterotrof yang memerlukan sumber energi organik seperti glukose atau asam-asam amino Organisme yang memanfaatkan energi cahaya matahari dan memerlukan sumber karbon organik seperti alkohol. Sumber nitrogen bagi organisme autotrofik adalah senyawa anorganik, sedangkan bagi heterotrof dapat berupa asam amino atau senyawa-senyawa protein intermediat seperti peptide, protease, dan pepton. Misalnya pada kaldu nutrien, nitrogen diperoleh dari ekstrak daging dan pepton. Faktor tumbuh ialah komponen selular esensial (yaitu asam-asam amino atau vitamin) yang tidak dapat disintesis sendiri oleh suatu organisme dari sumber dasar karbon dan nitrogennya. Bagi banyak heterotrof, faktor tumbuh dipenuhi dari ekstrak daging kalbu atau kaldu nutrien. Namun bagi patogen-patogen yang lebih rewel (fastidious) untuk penyediaan faktor tumbuhnya memerlukan medium yang lebih rumit seperti agar darah.

Laboratorium Mikrobiologi Dasar

11

Kuantitasi Mikrobe : Hitungan Cawan

Media Biak Sesuatu larutan biak yang dapat dibuat dari senyawa-senyawa kimia tertentu, disebut media biak. Harus diusahakan agar untuk setiap mikroorganisme dapat ditetapkan kebutuhan bahan makanan minimum dan mengembangkan medium minimum yang tidak mengandung lebih banyak komponen daripada yang diperlukan untuk pertumbuhan. Jenis-jenis yang mempunyai tuntutan tinggi memerlukan sejumlah besar zat pelengkap. a. Media Biak Kompleks Untuk banyak mikroorganisme bertuntutan tinggi belum dikenal benar bahanbahan makanan yang diperlukan. Larutan-larutan biak tidak dibentuk dari senyawa-senyawa murni tetapi lebih disukai untuk menggunakan zat-zat kompleks, seperti air dadih, melase, air rendaman jagung atau ekstrak kedele, Media biak seperti ini disebut media biak kompleks. b. Media Biak Padat Untuk membuat biak padat pada larutan biak cair ditambahkan bahan pemadat yang memberi konsistensi seperti selai pada larutan air. Bahan pemadat yang hampir ideal adalah agar. Agar adalah polisakarida dengan susunan kompleks dan teratur kuat berasal dari ganggang laut. Bila diperlukan media biak padat tanpa komponen-komponen organik, maka dipakai silikogel sebagai bahan pemadat. Mikroorganisme dibiakkan di laboratorium pada bahan nutrient yang disebut medium. Banyak sekali medium yang tersedia, macamnya yang dipakai bergantung kepada banyak faktor, salah satu diantaranya adalah macam mikroorganisme yang akan ditumbuhkan. Jika kita ingin mengisolasi biakan murni bakteri dari mulut kita, maka air liur itu diinokulasikan sedikit saja pada medium yang cocok sedemikian rupa hingga sel-sel mikroba tumbuh terpisahpisah pada medium tadi. Bahan yang diinokulasikan pada medium itu disebut inokulum. Dengan menginokulasi medium agar nutrien (nutrient agar) dengan metode cawan gores atau metode cawan tuang, sel-sel itu akan terpisah sendirisendiri. Setelah inkubasi, sel-sel mikrobe individu itu memperbanyak diri

Laboratorium Mikrobiologi Dasar

12

Kuantitasi Mikrobe : Hitungan Cawan

sedemikian cepatnya sehingga di dalam waktu 18-24 jam terbentuklah massa sel yang dapat dilihat dan dinamakan koloni. Koloni ini dapat dilihat oleh mata telanjang. Setiap koloni yang berlainan dapat mewakili macam organisme yang berbeda-beda, setiap koloni merupakan biakan murni satu macam mikroorganisme. Jika dua sel mikrobe pada inokulum asal terlalu berdekatan letaknya pada medium agar, maka koloni yang terbentuk dari masing-masing sel dapat bercampur dengan sesamanya, atau paling tidak bersentuhan, jadi massa sel yang dapat diamati itu bukanlah suatu biakan murni. Dasar metode hitungan cawan dengan anggapan bahwa setiap sel yang dapat hidup akan berkembang menjadi satu koloni. Jadi jumlah koloni yang muncul pada cawan merupakan suatu indeks bagi jumlah organisme yang dapat hidup yang terkandung dalam sampel. Cawan yang dipilih untuk penghitungan koloni adalah yang mengandung antara 30-300 koloni. Untuk memperoleh sekurang-kurangnya satu cawan yang mengandung koloni dalam jumlah yang memenuhi syarat maka harus dilakukan sederetan pengenceran dan pencawanan. Jumlah organisme yang terdapat dalam sampel asal ditentukan dengan mengalikan jumlah koloni yang terbentuk dengan faktor pengenceran pada cawan yang bersangkutan. Dalam kegiatan ini, kita akan mencoba dua macam prosedur hitungan cawan yaitu: 1. 2. Metode penyebaran Metode penuangan

Persyaratan Bagi Pertumbuhan Bakteri 1. Kadar Ion Hidrogen Diantara semua ion, ion H+dan OH- adalah ion-ion yang paling mobil, oleh sebab itu perubahan kadar yang kecil saja sudah menimbulkan pengaruh yang

Laboratorium Mikrobiologi Dasar

13

Kuantitasi Mikrobe : Hitungan Cawan

besar. Karena alasan ini adalah amat penting untuk menggunakan nilai pH awal yang optimum dan mempertahankannya sepanjang pertumbuhan. 2. Karbondioksida Larutan biak yang diperlukan untuk pertumbuhan mikroorganisme yang autotrof yang memfiksasi CO2, biasanya ditambahi Na-bikarbonat dan diinkubasi di bawah atmosfir yang mengandung CO2 dalam wadah tertutup. Tetapi juga mikroorganisme heterotrof, yang mengasimilasi juga sumbersumber karbon organik memerlukan CO2. 3. Kadar Air dan Tekanan Osmotik Mikroorganisme menunjukkan perbedaan yang luas dari segi tuntutan keperluan akan kadar air. Untuk dapat membandingkan larutan dalam air dan zat-zat padat dari segi banyaknya air yang tersedia, digunakan parameter aktivitas sir (aw) atau kelembaban relatif. 4. Suhu Menilik tumbuhan mengenai suhu inkubasi mikroorganisme berbeda-beda perilakunya. Sebagian besar bakteri tanah dan air bersifat : Mesophil : kecepatan tumbuh maksimum antara 200C dan 420C. Termotoleran : Organisme yang masih mampu tumbuh sampai 500C Termofil : Tumbuh pada suhu di atas 400C dengan kecepatan maksimum dan mencapai batas pada waktu 900C Termofil ekstrim : pertumbuhan optimum organisme terletak pada suhu di atas 650C Psikhrofil : Jenis bakteri ini mencapai kecepatan tumbuh tercepat di bawah 200C, diantaranya terutama bakteri laut (bakteri bercahaya) dan bakteribakteri besi (Galliomella). 5. Aerasi Untuk semua mikroorganisme aerob obligat, oksigen merupakan akseptor elektron yang sangat penting. Untuk bakteri yang tumbuh di atas agar atau pada lapis tipis cairan yang berkontak dengan udara, biasanya tersedia cukup oksigen. Di dalam lapis media biak cair yang lebih tebal, bakteri-bakteri aerob hanya tumbuh pada permukaan: dibawahnya keadaan menjadi semakin

Laboratorium Mikrobiologi Dasar

14

Kuantitasi Mikrobe : Hitungan Cawan

anaerob. Agar di dalam lapisan-lapisan lebih dalam pada biak cair masih dimungkinkan pertumbuhan bakteri aerob, diperlukan aerasi. 6. Biak Anaerob Untuk menumbuhkan jenis bakteri yang anaerob kuat penyingkiran O2 udara merupakan persyaratan yang amat perlu. Suatu empiris telah diketahui, bahwa bentuk koloni itu mempunyai hubungan erat dengan kemampuan bakteri untuk menimbulkan penyakit dan pula dengan kemampuannya untuk menambah kekebalan. Perubahan-perubahan sifat koloni yang dapat dialami oleh bakteri yang ditumbuhkan pada medium padat berupa kehalusan, kekasaran, berlendir, atau tidak, tidak halus atau tidak kasar, besar atau kecil, lemah atau tidak. Sifat-sifat tersebut ditandai dengan huruf besar sebagai singkatan dari bahasa asing yang lengkapnya seperti di bawah ini : a. S (Smooth) melukiskan koloni yang halus dan bundar b. R (Rough) untuk koloni yang kasar dan tidak teratur c. M (Mucoid) untuk koloni yang berlendir d. I (Intermediate) yaitu sifat antara S dan R e. G (Gonidial) yaitu kecil-kecil yang serupa titik-titik f. L (Pelo = Pleuropneumonia-like-organism) bakteri ini lunak dan mudah rusak kalau dibuat preparat. Dasar metode hitungan cawan dengan anggapan bahwa setiap sel yang dapat hidup akan berkembang menjadi satu koloni. Jadi jumlah koloni yang muncul pada cawan merupakan suatu indeks bagi jumlah organisme yang dapat hidup yang terkandung dalam sampel. Cawan yang dipilih untuk perhitungan koloni adalah yang mengandung antara 30-300 koloni. Untuk memperoleh sekurang-kurangnya satu cawan mengandung koloni dalam jumlah yang memenuhi syarat maka harus dilakukan sederetan pengenceran dan pencawanan. Jumlah organisme yang terdapat dalam sampel asal ditentukan dengan mengalikan jumlah koloni yang terbentuk dengan faktor pengenceran pada cawan yang bersangkutan.

Laboratorium Mikrobiologi Dasar

15

Kuantitasi Mikrobe : Hitungan Cawan

Dalam kegiatan yang telah dilakukan, terdiri dari dua macam prosedur hitungan cawan, yaitu metode penyebaran dan metode penuangan. II. ALAT DAN BAHAN a. Alat Korek api Rak tabung Spiritus Volume pipet 5 mL Volume Pipet 10 mL 3 buah cawan petri 3 buah tabung reaksi Sumbat tabung reaksi * Semua alat harus steril b. Bahan Aquades Nutrien agar Sampel air keran toilet putri lantai 2 gedung D6 Farmasi Unpad IV. PROSEDUR 1. Semua langkah kerja harus dilakukan dengan cara aseptik 2. Setiap tabung diberi label agar tidak tertukar (diberi label a, b, c) 3. Lakukan pengenceran pada sampel pada tiap-tiap tabung 4. Pada tabung a, dilakukan pengenceran sampel dengan konsentrasi 10-1, diambil 1 mL sampel dan ditambahkan dengan 9 mL aquadest, campuran dikocok 5. Pipet 1 mL sampel dari tabung a (10 -1), dimasukkan ke dalam tabung b, kemudian encerkan pula dengan penambahan 9 mL aquadest, jadi didalam tabung b merupakan sampel dengan konsentrasi 10-2, lalu dikocok

Laboratorium Mikrobiologi Dasar

16

Kuantitasi Mikrobe : Hitungan Cawan

6. Lalu, sampel pada tabung b dipipet 1 mL dan dimasukkan ke dalam tabung c, lalu diencerkan pula dengan 9 mL aquadest, sehingga di dalam tabung c terdapat sampel dengan konsentrasi 10-3, lalu dikocok 7. Sampel pada tabung reaksi a, b dan c dipipet ke dalam cawan Petri, masing-masing sebanyak 1 ml. 8. Tuang nutrient agar ke dalam masing-masing cawan Petri yang telah diberi label untuk dapat membedakan konsentrasi sampel, pastikan suhu nutrien agar 450, lakukan pekerjaan di dekat api 9. Lalu cawan Petri digoyang perlahan di atas meja laboratorium sampai sampel tersebut tersebar merata pada nutrient agar. 10. Tunggu sampai nutrient agar membeku. Lalu cawan Petri tersebut dibungkus dengan koran dalam posisi terbalik agar uap air yang terdapat pada cawan tidak jatuh ke nutrient agar 11. Diinkubasikan dalam incubator dengan suhu 37C selama 18-24 jam 12. Hitung koloni bakteri yang tumbuh pada cawan petri tersebut setelah 1824 jam

III. DATA PENGAMATAN DAN PERHITUNGAN TABEL PENGAMATAN No. PENGENCERAN 1. 10-1 2. 10-2 3. 10-3 Perhitungan : Kisaran yang paling tepat dalam menghitung koloni pada cawan adalah 30-300 koloni per cawan. Jika jumlah koloni < 30 atau >300, maka tidak dimasukkan ke dalam perhitungan. Jumlah koloni per ml sampel = (175 x 10) + (163 x 100) + (156 x 1000) 3 JUMLAH KOLONI 175 koloni 163 koloni 156 koloni

Laboratorium Mikrobiologi Dasar

17

Kuantitasi Mikrobe : Hitungan Cawan

= (1750) + (16300) + (156000) 3 = 174050 / ml

VI. PEMBAHASAN Dalam praktikum pembiakan bakteri dengan metode cawan hitung ini, semua pengerjaan harus dilakukan secara aseptis agar tidak terjadi kontaminasi dari lingkungan luar terhadap sampel ataupun biakan bakteri yang akan dibuat. Pertama-tama saat dilakukan pengenceran sampel, diperlukan tiga tabung reaksi dan volume pipet yang sudah disterilisasi terlebih dahulu di dalam autoklaf. Tabung reaksi dikeringkan di dalam oven, namun volume pipet tidak boleh dikeringkan didalam oven karena volume pipet merupakan alat yang mempunyai skala, jika dikeringkat dengan cara pemanasan akan memuai. Tabung reaksi merupakan wadah untuk pengenceran sampel, sampel diencerkan tiga kali sehingga didapatkan konsentrasi 10-1, 10-2, dan10 -3, masing masing konsentrasi dimasukkan dalam tiap tabung reaksi dan diberi label agar tidak terukar. Volume pipet digunakan untuk memipet dan memindahkan sampel serta aquadest kedalam tabung reaksi. Pada mulut volume pipet harus dipastikan masih terdapat kapas yang menutupi mulut volume pipet tersebut. Hal ini bertujuan agar bakteri yang terdapat dalam sampel tidak terhirup oleh mulut serta bakteri dari mulut juga dapat disaring oleh kapas. Cairan sampel dan aquades dihirup dengan volume pipet yang berbeda lewat mulut, bukan menggunakan bulb pipet. Untuk sampel, digunakan volume piper berskala 5 mL sedangkan untuk aquadest digunakan volume pipet berskala 10 mL. Semua pengerjaan pengenceran harus dilakukan dekat api, namun juga tidak boleh terlalu panas karena suhu yang terlalu panas dapat mematikan bakteri sehingga bakteri tidak dapat tumbuh sementara tujuan dari praktikum ini adalah mengamati pertumbuhan bakteri dengan faktor lingkungan dan nutrisi yang cocok.

Laboratorium Mikrobiologi Dasar

18

Kuantitasi Mikrobe : Hitungan Cawan

Pengenceran dilakukan agar dapat dibedakan bagaimana jumlah koloni bakteri yang tumbuh pada tiap-tiap konsentrasi yang berbeda, bakteri yang tumbuh pada konsentrasi tinggi akan lebih banyak jumlahnya dibandingkan dengan bakteri yang tumbuh pada konsentrasi yang lebih rendah karena induk biakan bakteri lebih banyak terdapat pada konsentrasi yang tinggi, dalam hal ini pada konsentrasi 10-1. Setelah dilakukan pengenceran, tiap-tiap 1 mL sampel dalam masing masing tabung reaksi dipindahkan ke dalam cawan petri. Cawan petri merupakan wadah pertumbuhan bakteri yang nantinya akan dimasukkan ke dalam inkubator. Setelah itu dimasukkan ke dalam masing-masing cawan petri nutrien broth yang merupakan media cair pertumbuhan bakteri. Nutrien Broth sudah dibuat sebelumnya, dimana di dalam tiap liter nutrien broth terkandung banyak protein dan NaCl serta nutrisi pendukung pertumbuhan bakteri lainnya. Nutrien broth berwarna kuning agak kental. Awalnya nutrien broth disimpan di dalam erlenmeyer berukuran besar, lalu dituangkan ke dalam tiga tabung reaksi besar yang sebelumnya sudah ditandai sampai batas 9 mL. Dari dalam ketiga tabung reaksi besar tersebut, masingmasing dituangkan ke dalam cawan petri yang sudah berisi sampel dengan berbagai konsentrasi. Semua pengerjaan dilakukan dekat api untuk memperbesar evaporasi dan dengan hati-hati agar nutrien broth tidak tumpah. Setelah masingmasing cawan petri diisikan nutrien broth, cawan petri diputar perlahan diatas meja laboratorium agar penyebaran nutrien dan bakteri merata di seluruh permukaan cawan petri. Setelah itu, ditunggu sampai membeku. Setelah cairan dalam cawan petri membeku, ketiga cawan petri dibalik agar uap air yang terkondensasi pada bagian tutup cawan petri tidak menetes pada media nutrien broth. Kemudian, ketiga cawan petri yang telah dibalik ditumpuk, maksimal penumpukan hanya 3 cawan petri dan diusahakan posisi tutup tidak miring. Tumpukan cawan dibungkus dengan kertas koran lalu dimasukkan ke dalam inkubaror dengan suhu 350C 400C (suhu tumbuh bakteri). Sampel diinkubasikan selama 18-24 jam dihitung dari waktu dimasukkan ke dalam inkubator.

Laboratorium Mikrobiologi Dasar

19

Kuantitasi Mikrobe : Hitungan Cawan

Setelah 18-24 jam, sampel diambil dari inkubator dan dihitung jumlah koloni bakteri di dalam masing-masing cawan. Saat akan dilakukan perhitungan terlihat bahwa bakteri pada cawan 10-1 jauh lebih banyak daripada bakteri pada kedua cawan lainnya. Untuk memudahkan perhitungan, apabila penyebaran bakteri merata cawan petri bisa dilukis menjadi empat kuadran, dihitung salah satu kuadran saja lalu jumlahnya dikalikan empat. Jumlah yang didapat pada masing-masing cawan petri adalah: Konsentrasi 10-1 = 175 koloni Konsentrasi 10-2 = 163 koloni Konsentrasi 10-3 = 156 koloni

Yang dimasukkan kedalam perhitungan jumlah koloni bakteri per mL sampel hanya koloni bakteri pada konsentrasi 10-1 dan 10-2 karena keduanya memenuhi jumlah bakteri ideal dalam pembiakan nutrien broth yaitu antara 30300 koloni. Dipilih range dalam koloni tujuannya dalh untuk meminimalisir kesalahan dalam proses analisa(statistical error). Jika didapat jumlah koloni kurang dari 30 maka: - Kesalahan statistik tinggi. - Sangat sensitif terhadap kontaminan (jumlah bakteri kontaminan yang tidak sengaja masuk, besar pengaruhnya terhadap jumlah akhir koloni per cawan). - Membutuhkan kerja aseptis yang lebih teliti. Solusi yang tepat dalam hal ini adalah memperbesar ukuran sampel. Jika didapat jumlah koloni lebih besar dari 300 maka : - Dimungkinkan ada sifat antagonisme antar spesies, misalnya bakteri A menghambat bakteri B dengan mengeluarkan metabolit tertentu (antibiotik) sehingga bakteri B tidak tumbuh sedangkan keduanya berada diposisi yang berdekatan. - Perebutan nutrisi/ kompetisi sangat tinggi yang lama-kelamaan menimbulkan keterbatasan nutrisi.

Laboratorium Mikrobiologi Dasar

20

Kuantitasi Mikrobe : Hitungan Cawan

- Kemungkinan dua koloni bergabung menjadi satu lebih besar sehingga mengaburkan jumlah sebenarnya karena dua koloni yang bergabung tetap dihitung satu koloni. Solusi : memperkecil ukuran sampel atau diencerkan. Setelah dihitung jumlah koloni per sampel maka didapatkan jumlah koloni per mililiter air keran toilet putri lantai 2 gedung D6 Farmasi Unpad adalah 174050 koloni / ml.

VII. KESIMPULAN Apabila kita ingin mengisolasi biakan murni bakteri dari suatu sampel, maka sampel tersebut diinokulasikan sedikit saja pada medium yang cocok sedemikian rupa sehingga sel-sel mikrobe tumbuh terpisah-pisah pada medium tadi. Bahan yang diinokulasikan pada medium itu disebut inokulum. Dengan menginokulasi medium agar nutrien (nutrient agar) dengan metode cawan gores atau metode cawan tuang. Proses pengerjaannya harus senantiasa aseptik (didekatkan dengan api), agar terhindar dari bakteri hidup yang sifatnya mudah masuk ke dalam tubuh manusia melalui udara, tetapi jangan terlalu dekat juga dengan api, karena dapat membunuh bakteri tersebut. Dari pengamatan yang kami lakukan melalui perhitungan jumlah koloni bakteri yang terdapat dalam cawan, maka dapat kami ambil kesimpulan bahwa koloni bakteri yang terdapat dalam ketiga cawan tersebut tidak dapat dijumlahkan karena tidak memenuhi syarat. Seperti yang telah kita ketahui bahwa syarat koloni bakteri yang dapat dihitung yaitu berkisaran antara 30-300 koloni bakteri. Karena jika di bawah 30 koloni/mL, maka memiliki statistik yang kurang bagus bagus sehingga kemungkinan melakukan kesalahan lebih besar. Sedangkan pada jumlah koloni bakteri yang lebih dari 300 koloni/mL akan

Laboratorium Mikrobiologi Dasar

21

Kuantitasi Mikrobe : Hitungan Cawan

memiliki biakan yang kurang bagus karena medium agar (NA) hanya untuk 300 koloni bakteri.

Laboratorium Mikrobiologi Dasar

22

Kuantitasi Mikrobe : Hitungan Cawan

DAFTAR PUSTAKA Buchanan, R.E., dan N.E. Gibbons (eds.). 1974. Bergeys Manual of Determinative Bacteriology. 8th ed. Williams & Wilkins. Baltimore. Dwidjoseputro, D. 2003. Dasar-dasar Mikrobiologi. Jakarta : Djambatan. Pelczar, Michael J. 1986. Dasar-dasar mikrobiologi I. penerjemah: Ratna Siri Hadioetomo. Jakarta : UI Press. Schlegel, Hans G. 1994. Mikrobiologi Umum edisi keenam. Yogyakarta : Gadjah Mada University Press.

Laboratorium Mikrobiologi Dasar

23