BAB II

TINJAUAN PUSTAKA
II.1. Pengertian Isolasi
Isolasi adalah mengambil mikroorganisme yang terdapat di alam dan
menumbuhkannya dalam suatu medium buatan. Prinsip dari isolasi mikroba
adalah memisahkan satu jenis mikroba dengan mikroba lainnya yang berasal
dari

campuran bermacam-macam

denganmenumbuhkannya

dalam

mikroba.

Hal

media padat

ini
sel-sel

dapat

dilakukan

mikroba

akan

membentuk suatu koloni sel yang tetap pada tempatnya. Isolasi bakteri atau
biakan yang terdiri dari satu jenis mikroorganisme (bakteri) dikenal
sebagai biakan murni ataubiakan aksenik. Biakan yang berisi lebih dari satu
macam mikroorganisme (bakteri) dikenal sebagai biakan campuran, jika
hanya terdiri dari dua jenis mikroorganisme, yang dengan sengaja dipelihara
satu sama lain dalam asosiasi, dikenal sebagai biakan dua-jenis (1)
Persyaratan utama bagi isolasi dan kultivasi fage adalah harus adanya
kondisi optimum untuk

pertumbuhan

organisme

inangnya.

Sumber

bakteriofage yang paling baik dan paling utama adalah habitat inang.
Sebagai contoh fage koli yang di jumpai di dalam pencernaan dapat diisolasi
dari limbah atau pupuk kandang. Hal ini dilakukan dengan sentifugasi atau
filtrasi bahan sumbrnya dan penambahan kloroform untuk membunuh sel-sel
bakterinya (1).
Ada beberapa cara yang digunakan untuk bakteri, fungi, dan khamir
dengan metode garis, metode tuang, metode sebar, metode penuangan,

serta micromanipulator. Dua diantaranya yang paling sering banyak

digunakan adalah teknik cawan tuang dan cawan gores. Kedua metode ini
didasarkan pada prinsip yang sama yaitu mengencerkan organisme
sedemikian rupa sehingga individu species dapat dipisahkan (2).
II.2. Teknik Isolasi
Untuk melakukan isolasi mikroba, dapat dilakukan dengan beberapa
cara atau teknik. Teknik atau cara-cara isolasi mikroorganisme adalah :
a. Pour plate atau shake culture
Beberapa ml suspensi bakteri dicampur dengan mediaum yang
masih cair (belum membeku) dengan demikian akan diperoleh piaraa
adukan. Digunakan untuk mengencerkan atau mengisolasi yang terdapat
pada contoh. Setelah inkubasi pada suhu dan waktu tertentu, koloni akan
tumbuh pada permukaan dan bagian bawah agar.
b. Streak Plate
Ujung kawat imokulasi yang membawa bakteri digesekkan atau
digoreskan dengan bentuk zig-zag pada permukaan agar-agar dalam
cawan Petri sampai meliputi seluruh permukaan. Untuk memperoleh hasil
yang baik diperlukan keterampilan, yang biasanya diperoleh dari
pengalaman. Metode cawan gores yang dilakukan dengan baik
kebanyakan akan menyebabkan terisolasinya mikroorganisme yang
diinginkan. Dua macam kesalahan yang umum sekali dilakukan adalah
tidak memanfaatkan permukaan medium dengan sebaik- baiknya untuk
digores sehingga pengenceran mikroorganisme menjadi kurang lanjut dan

cenderung untuk menggunakan inokulum terlalu banyak sehingga

menyulitkan pemisahan sel-sel.
c. Slant culture
Ujung

kawat

yang

membawakan

bakteri

digesekkan

pada

permukaan agar-agar miring dalam tabung reaksi. Dapat dilakukan

dengan cara menggoreskan secaa zig-zag pada permukaan agar miring
menggunakan jarum ose yang bagian atasnya dilengkungkan. Cara ini
juga dilakukan pada agar tegak untuk meminimalisir pertumbuhan
mikroba dalam keadaan kekurangan oksigen.
d. Stab culture
Ujung kawat yang membawakan bakteri ditusukkan pada media
padat (agar-agar) dalam tabung reaksi, berbeda dengan slant culture
permukaan agar-agar ini tidak miring. Media agar setengah padat dalam
tabung reaksi, digunakan untuk menguji gerak bakteri secara makroskopis
(3).
II.3. Aktinomisetes
Aktinomisetes adalah bakteri Gram positif yang tumbuh sebagai
filament sel yang bercabang dan hidup dari berbagai bahan organik yang
membusuk. Menurut Alexander, aktinomisetes merupakan bentuk peralihan
antara bakteri dan fungi. Aktinomisetes secara umum hamper menyerupai
jamur karena mempunyai ciri : miselium aktinomisetes mempunyai karakter
percabangan yang luas; seperti umumnya fungi, aktinomisetes membentuk
miselium udara dan konidia ; pertumbuhan aktinomisetes pada kultur cair
yang menghasilkan kekeruhan seperti umumnya bakteri uniseluler, tetap
membentuk pellet-pelet fungi.

Aktinomisetes merupakan bakteri yang memiliki kemiripan dengan

jamur sebab menghasilkan miselium namun aktinomisetes merupakan sel

prokariotik yang menjadi ciri utama dari bakteri, oleh karena itu aktinomisetes
digolongkan sebagai bakteri sebab aktinomisetes merupakan mikroba
prokariotik. Aktinomisetes menghasilkan miselium bercabang dan biasanya
mengalami fragmentasi atau pembelahan untuk membentuk spora.
Aktinomisetes apabila ditumbuhkan pada medium maka morfologi
akan terleihat seperti gambar berikut :
Aktinomisetes banyak hidup pada tanah atau sedimen laut. Namun
aktinomisetes juga ternyata hidup pada jaringan dalam tumbuhan sebagai
bakteri endofit. Aktinomisetes merupakan bakteri aerob dan dapat hidup pada
suhu yang tinggi walaupun hidup di dalam tanah. Aktinomisetes banyak hidup
di dalam tanah, sebab aktinomisetes dapat menembus tanah untuk
mendapatkan senyawa-senyawa hasil dekomposisi jaringan tanaman yang
telah mati. Hal ini berarti, aktinomisetes memerlukan jaringan tanaman
sebagai sumber nutrisi bagi kehidupannya. Hal inilah yang menyebabkan
bahwa aktinomisetes juga ternyata dapat hidup pada jaringan tanaman
sebagai mikroba endofit.

Menurut Soetedo, aktinomisetes adalah organisme yang memiliki sifatsifat umum dimiliki oleh bakteri dan jamru, tetapi juga mempunyai ciri khas
yang cukup berbeda. Seperti halnya jamur, aktinomisetes mempunyai
miselium uniseluler dan mempunyai susunan hifa yang bercabang yang agak
panjang dan diameter 0.5-0.8 mikrometer. Miseliumnya berkembang dalam
lapirsan bawah dan tumbuh menjulang seperti antenna yang disebut
miselium aerial. Pada lempeng agar, aktinomisetes dapat dibedakan dengan
mudah dari bakteri. bakteri memiliki morfologi yang berlendir, mengkilap dan
tumbuh dengan cepat sedangkan koloni aktinomisetes dapat dibedakan
morfologi yang buram, permukaan konsisten berbubuk, melekat erat pada
permukaan agar dan memiliki pertumbuhan yang lambat.
Pengendalian biologi sangat diperlukan untuk menekan pertumbuhan
filopatogen. Menurut Crueger dan Crueger dan Kenneth aktinomisetes
khususnya Streptomyces

merupakan mikroorganisme yang menghasilkan

senyawa bioaktif yang dapat dimanfaatkan pada bidang pertanian sebagai

pengendali hayati. Selain itu, masih banyak jenis aktinomisetes yang
menghasilkan metabolit sekunder seperti antibiotic dan antitumor.
II.4. Medium Isolasi
Medium pertumbuhan (disingkat medium) adalah tempat untuk
menumbuhkan mikroba. Mikroba memerlukan nutrisi untuk memenuhi
kebutuhan energi dan untuk bahan pembangun sel, untuk sintesa
protoplasma dan bagian-bagian sel lain. Setiap mikroba mempunyai
sifat fisiologi tertentu, sehingga memerlukan nutrisi tertentu pula.
Susunan kimia sel mikroba relatif tetap, baik unsur kimia maupun
senyawa yang terkandung di dalam sel. Dari hasil analisis kimia diketahui
bahwa penyusun utama sel adalah unsur kimia C, H, O, N, dan P, yang
jumlahnya + 95 % dari berat kering sel, sedangkan sisanya tersusun dari
unsur-unsur lain (Lihat Tabel). Apabila dilihat susunan senyawanya, maka
air merupakan bagian terbesar dari sel, sebanyak 80-90 %, dan
bagian
lain sebanyak 10-20 % terdiri dari protoplasma, dinding
sel, lipida untuk cadangan makanan, polisakarida, polifosfat, dan senyawa
lain.
Susunan unsur-unsur penyusun sel bakteri E. coli

Unsur-unsur kimia

Persentase berat kering

Carbon (C)
50
Oksigen (O)
20
Nitrogen (N)
14
Hidrogen (H)
8
Fosfor (P)
3
Belerang (S)
1
Kalium (K)
1
Natrium (Na)
1
Kalsium (Ca)
0,5
Magnesium (Mg)
0,5
Klor (Cl)
0,5
Besi (Fe)
0,2
Lain-lain
0,3
II.4.1. Fungsi Nutrisi untuk Mikroba
Setiap unsur nutrisi mempunyai
peran tersendiri dalam
fisiologi sel. Unsur tersebut diberikan ke dalam medium sebagai kation
garam anorganik yang jumlahnya berbeda-beda
tergantung
pada
keperluannya. Beberapa golongan mikroba misalnya diatomae
dan
alga tertentu memerlukan silika (Si) yang biasanya diberikan dalam
bentuk silikat untuk menyusun dinding sel. Fungsi dan kebutuhan natrium
(Na) untuk beberapa jasad belum diketahui jumlahnya. Natrium dalam
kadar yang agak tinggi diperlukan oleh bakteri tertentu yang hidup
di laut, algae hijau biru, dan bakteri fotosintetik. Natrium tersebut tidak
dapat digantikan oleh kation monovalen yang lain.
Jasad hidup dapat menggunakan makanannya dalam bentuk
padat maupun cair (larutan). Jasad yang dapat menggunakan makanan
dalam bentuk padat tergolong tipe
holozoik,
sedangkan
yang
menggunakan makanan dalam bentuk cair tergolong tipe holofitik.
Jasad holofitik dapat pula menggunakan makanan dalam bentuk
padat, tetapi makanan tersebut harus dicernakan lebih dulu di luar
sel dengan pertolongan enzim ekstraseluler. Pencernaan di luar sel ini
dikenal sebagai extracorporeal digestion.
Bahan makanan yang
digunakan oleh jasad hidup dapat
berfungsi
sebagai sumber energi, bahan pembangun sel, dan sebagai
aseptor atau donor elektron. Dalam garis besarnya bahan makanan dibagi
menjadi tujuh golongan yaitu air, sumber energi, sumber karbon, sumber
aseptor elektron, sumber mineral, faktor tumbuh, dan sumber nitrogen.

1. Air
Air
merupakan
komponen
utama sel
mikroba
dan
medium. Funsi air adalah sebagai sumber oksigen untuk bahan
organik sel pada respirasi. Selain itu air berfungsi sebagai pelarut dan
alat pengangkut dalam metabolisme.
2. Sumber energi
Ada beberapa sumber energi untuk mikroba
yaitu senyawa
organik atau anorganik yang dapat dioksidasi dan cahaya terutama
cahaya matahari.
3. Sumber karbon
Sumber karbon untuk mikroba
dapat berbentuk
senyawa
organik maupun anorganik. Senyawa organik meliputi karbohidrat,
lemak, protein, asam amino, asam organik, garam asam organik,
polialkohol, dan sebagainya. Senyawa anorganik misalnya karbonat
dan gas CO2 yang merupakan sumber karbon utama terutama untuk
tumbuhan tingkat tinggi.
4. Sumber aseptor elektron
Proses oksidasi biologi merupakan
proses pengambilan
dan
pemindahan dari substrat. Karena elektron dalam sel
tidak berada dalam bentuk bebas, maka
harus ada suatu
zat yang dapat menangkap
elektron tersebut. Penangkap
elektron ini disebut aseptor elektron. Aseptor elektron ialah agensia
pengoksidasi. Pada mikrobia yang dapat berfungsi sebagai
aseptor elektron ialah O2, senyawa organik,
NO3 NO2 N2O SO4 CO2 Fe3+
5. Sumber mineral
Mineral merupakan bagian dari sel. Unsur penyusun utama sel
ialah C, O, N, H, dan P. unsur mineral lainnya yang diperlukan
sel ialah K, Ca, Mg, Na, S, Cl. Unsur mineral yang
digunakan dalam jumlah sangat sedikit ialah Fe, Mn, Co, Cu, Bo, Zn,
Mo, Al, Ni, Va, Sc, Si, Tu, dan sebagainya
yang
tidak
diperlukan
jasad. Unsur
yang digunakan dalam jumlah besar
disebut unsur makro, dalam jumlah sedang unsur oligo, dan dalam
jumlah sangat sedikit unsur mikro. Unsur mikro sering
terdapat sebagai ikutan (impurities) pada garam unsur makro, dan
dapat masuk ke dalam medium lewat kontaminasi gelas tempatnya
atau lewat partikel debu.
Selain berfungsi sebagai
penyusun
sel, unsur mineral
juga berfungsi
untuk mengatur tekanan osmose, kadar ion
H+
(kemasaman, pH), dan potensial oksidasi- reduksi (redox
potential) medium.

6. Faktor tumbuh
Faktor tumbuh
ialah senyawa
organik yang sangat
diperlukan
untuk pertumbuhan
(sebagai prekursor,
atau
penyusun bahan sel) dan senyawa ini tidak dapat
disintesis
dari sumber
karbon
yang
sederhana.
Faktor tumbuh
sering juga disebut zat tumbuh dan hanya diperlukan dalam jumlah
sangat sedikit.
Berdasarkan
struktur
dan
fungsinya
dalam
metabolisme,
faktor tumbuh digolongkan menjadi asam amino,
sebagai penyusun protein; base purin dan pirimidin, sebagai penyusun
asam nukleat; dan vitamin sebagai gugus prostetis atau bagian aktif
dari enzim.
7. Sumber nitrogen
Mikroba dapat menggunakan
nitrogen dalam bentuk
amonium,
nitrat, asam amino, protein, dan sebagainya. Jenis
senyawa
nitrogen
yang
digunakan
tergantung pada
jenis
jasadnya. Beberapa mikroba dapat menggunakan nitrogen
dalam bentuk gas N2 (zat lemas) udara. Mikroba ini disebut mikrobia
penambat nitrogen.
II.4.2. Medium Pertumbuhan Mikroba
Susunan dan kadar nutrisi suatu medium untuk pertumbuhan
mikroba harus seimbang agar mikroba dapat tumbuh optimal. Hal
ini perlu dikemukakan mengingat banyak senyawa yang menjadi zat
penghambat atau racun bagi mikroba jika kadarnya terlalu tinggi (misalnya
garam dari asam lemak, gula, dan sebagainya). Banyak alga yang sangat
peka terhadap fosfat anorganik. Disamping itu dalam medium yang terlalu
pekat
aktivitas metabolisme
dan pertumbuhan
mikroba
dapat
berubah. Perubahan faktor lingkungan menyebabkan aktivitas fisiologi
mikroba
dapat
terganggu,
bahkan untuk
mempertahankan
pH
medium ditambahkan bahan buffer. Beberapa komponen penyusun
medium dapat juga berfungsi sebagai buffer.
II.4.3. Macam Medium Pertumbuhan
1. Medium dasar/ basal mineral
Medium
dasar
adalah
medium
yang
mengandung
campuran senyawa anorganik. Medium dasar ini selanjutnya ditambah
zat lain apabila diperlukan, misalnya sumber karbon, sumber energi,
sumber nitrogen, faktor tumbuh, dan faktor lingkungan yang penting
seperti pH dan oksigen serta tekanan osmosis.
2. Medium sintetik

Medium sintetik adalah medium yang seluruh susunan kimia dan

kadarnya telah diketahui
dengan
pasti.
Sebagai
contoh
adalah
medium dasar yang ditambah NH4Cl
(medium 1) dengan sumber karbon berupa gas CO2, apabila
diinkubasikan
dalam keadaan
gelap
dapat
digunakan
untuk
menumbuhkan bakteri nitrifikasi khemoototrof,
misalnya bakteri Nitrosomonas. Bakteri ini memperoleh energi dari oksidasi
amonium, selain itu amonium juga berfungsi sebagai sumber nitrogen.
Contoh lain adalah medium dengan susunan sama dengan
medium 1 tetapi ditambah
glukosa (medium
2). Dalam keadaan
aerob merupakan
medium
untuk perbanyakan jamur dan bakteri
yang bersifat heterotrof. Glukosa berfungsi sebagai sumber
karbon
dan sumber energi. Dalam keadaan anaerob, medium ini dapat
digunakan untuk menumbuhkan bakteri fakultatif anaerob maupun
anaerob obligat. Energi diperoleh dari hasil fermentasi glukosa.
Untuk menumbuhkan
mikroba yang memerlukan
faktor
tumbuh
dapat menggunakan medium yang komposisinya sama
dengan medium 2 tetapi ditambah asam nikotinat (vitamin) sebagai
faktor tumbuh (medium 3).
2. Medium kompleks
Medium
kompleks
adalah medium
yang susunan
kimianya
belum diketahui dengan pasti. Sebagai contoh medium ini adalah medium
dasar yang ditambah glukosa dan ekstrak khamir (medium 4). Susunan kimia
ekstrak khamir tidak diketahui secara pasti, tetapi mengandung berbagai
faktor tumbuh yang sering diperlukan oleh mikroba. Medium
ini dapat
untuk menumbuhkan
mikroba khemoheterotrof
aerob maupun
anaerob baik yang memerlukan
maupun yang tidak memerlukan
faktor tumbuh.
II.5. Fermentasi
Fermentasi memiliki banyak definisi. Pengertian fermentasi menurut
ahli mikrobiologi diartikan sebagai proses untuk menghasilkan suatu produk
dari kultur mikrooeganime. Fermentasi dapat juga diartikan sebagai suatu
disimilasi senyawa-senyawa organik yang disebabkan oleh aktivitas
mikroorganisme. Disimilasi merupakan reaksi kimia yang membebaskan
energy melalui perombakan nutrient. Pada proses disimilasi, senyawa
substrat yang merupakan sumber energy diubah menjadi senyawa yang lebih
sederhana atau tingkat energinya lebih rendah. Reaksi desimilasi merupakan
aktivitas katabolic sel melalui proses kimia.

Secara umum, ada empat kelompoj fermentasi yang penting secara

ekonomi, yaitu :
1. Fermentasi yang memproduksi sel mikroba
Produksi komersial dari biomass dapat dibedakan menjadi
produksi yeast untuk industry roti, dan produksi sel mikroba untuk
digunakan sebagai makanan manusia dan hewan.
2. Fermentasi yang menghasilkan enzim dan mikroba
Secara komersial enzim dapat diproduksi oleh tanaman, hewan,
dan mikroba, namun enzim yang diproduksi oleh mikroba memilliki
beberapa keunggulan yaitu, mampu dihasilkan dalam jumlah besar
dan mudah untuk meningkatkan produktivitas bila dibandingkan
dengan tanaman atau hewan.
3. Fermentasi yang menghasilkan metabolit mikroba
Metabolit mikroba dibedakan menjadi metabolit primer dan
metabolit sekunder. Produk metabolism promer yang dianggap penting
contohnya etanol, asam sitrat, polisakarida, aseton, butanol dan
vitamin. Sedangkan metabolit sekunder yang dihasilkan oleh mikroba
adalah antibiotic, pemacu pertumbuhan, inhibitor enzim dan lain-lain.
4. Fermentasi tranformasi
Sel mikroba dapat digunakan untuk mengubah suatu senyawa
menjadi senyawa lain yang masih memiliki kemiripan struktur namun
memiliki komersial yang lebih tinggi. Proses transformasi dengan
menggunakan mikroba ini lebih baik bila dibandingkan dengan proses
kimia, berkaitan dengan penggunaan reagen kimia yang lebih sedikit.
Selain itu, proses dapat berlangsung pada suhu rendah tanpa
membutuhkan katalis logam berat yang berpotensi menimbulkan
potensi.
Fermentasi dapat dilakukan dengan metode kultur permukaan
dan kultur terendam. Medium kultur permukaan dapat berupa medium
padat, semi padat atau cair. Sedangkan kultur terndam dilakukan
dengan medium cair menggunakan bioreactor yang dapt berupa labu
yang diberi aerasi, labu yang digoyang dengan shaker atau fermentor.
Diandingkan dengan medium padat, medium cair memiliki
kelebihan yaitu :
1. Jenis dan konsentrasi komponen-komponen medium dapat
diatur sesuai dengan yang diinginkan
2. Dapat memberikan kondisi yang optimum untuk pertumbuhan
3. Pemakaian medium lebih efisien.
Kondisi yang optimum untuk suatu proses fermentasi bergantung
pada jenis organismenya. Pengendalian factor-faktor fermentasi
bertujuan untuk menciptakan kondisi yang optimum bagi pertumbhan

dan roduksi metabolit yang diinginkan dari suatu organisme tertentu.

Fermentasi medium cair lebih memungkinkan untuk mengendalikan
factor-faktor fisik dan kimia yang mempengaruhi proses fermentasi
seperti suhu, pH dan ketuhuan oksigen.
Pada fermentasi skala laboratorium yang menggunakan shaker
flask, pengendalian suhu dapt dilakukan melalui penggunaan
incubator yang dilengkapi dengan thermostat pengatur suhu atau
menggunakan penangas air. Penambahan asam atau basa untuk
mengatur pHmedium pada fermentasi
Fermentasi medium cair dapat dilakukan dengan 3 cara yaitu
fermentasi tertutup, fermentasi kontinyu dan fermentasi fedbatch
Pada fermentasi tertuutp, setelah inokulasi tidak dilakukan lagi
penambahan medium ke dalam fermentor, kecuali pemberian
oksigen, antibuih dan asam/basa sebagai pengatur pH. Karena itu,
pada fermentasi tertutup ini dengan semakun lamanya waktu
fermentasi, laju pertumbuhan spesifik mikroba semakin menurun
sampai akhirnya pertumbuhan berhenti. Penurunan dan berhentinya
pertumbuhan disebabkan karena dengan semakin bertambahnya
waktu fermentasi, nutrient-nutrien esensial dalam edium semakin
berkurang atau terjadi akumulasi autotoksin yang mempengaruhi laju
pertumbuhan atau kombinasi keduanya. Demikian pada fermentasi
tertutup jumlah sel pada fase stasioner merupakan jumlah sel
maksiumum
Dalam fermentsai kontinyu, larutan nutrient steril dalam volume
tertentu ditambahkan ke dalam fermentor secara terus menerus dan
pada saat bersamaa cairan fermentasi yang mengandung sel dan
produk-produk fermentasi dikeluarkan dari fermentor dengan volume
yang sam. Penambahan medium baru dengan kecepatan tertentu
dapat menghasilkan keadaan steady state yaitu keadaan dimana
jumlah sel-sel yang terbentuk sama dengan jumlah sel yang
dikeluarkan dari fermnetor.