Laurensius Danang W.

/ 128114160 / FSTB
Delayed Temporal Increase of Hepatic Hsp70 in ApoE Knockout Mice After
Prenatal Arsenic Exposure
Arsenik anorganik adalah kontaminan alami dalam air minum di seluruh
dunia dan merupakan zat berbahaya. Studi epidemiologis menunjukkan
paparan arsenik kronis memiliki risiko penyakit kardiovaskular (CVD) yang
tinggi. Aterosklerosis mendasari sebagian besar CVD, yang merupakan
penyebab utama kematian di seluruh dunia. Paparan arsenik dalam air minum
dapat mempercepat aterogenesis pada hewan. Namun, mekanisme arsenik
yang menginduksi aterosklerosis tidak diketahui. Kehamilan adalah masa kritis.
Arsenik mudah melintasi plasenta pada manusia dan tikus. Dengan demikian,
paparan arsenik dapat mempengaruhi penyakit dewasa yang mengindikasikan
induksi kanker hati pada tikus jantan dewasa. Paparan arsenik prenatal
mempercepat aterosklerosis pada tikus ApoE - / -. Tikus yang terpapar arsenik
sebelum lahir memiliki lesi> 2 kali lipat pada usia 10 dan 16 minggu,
dibandingkan dengan tikus yang tidak terpapar. Lesi ini terletak di akar aorta
dan aorta arkus. Tikus yang terpapar arsenik juga mengalami penurunan
trigliserida total 20-40%, tapi tidak ada perubahan total kolesterol dan
fosfolipid. Studi epidemiologi menunjukkan bahwa penyakit hati merupakan
faktor risiko independen untuk aterosklerosis karotid, dan peningkatan enzim
hati dalam plasma (misalnya, alanine aminotransferase [ALT] dan aspartat
aminotransferase [AST]) merupakan faktor risiko koroner. Arsenik adalah racun
bagi hati, dapat menyebabkan penyakit hati pada manusia dan hewan
percobaan. Data menunjukkan beberapa gen diekspresikan secara berbeda
termasuk konstitutif (Hsc70) dan heat shock protein (Hsp70) yang mudah
diinduksi. Namun masih belum jelas bagaimana ekspresi postnatal Hsp70
diatur setelah paparan arsenik prenatal. Salah satu mekanisme yang mana
ekspresi gen dapat diubah adalah dengan regulasi epigenetik, khususnya
metilasi DNA. Arsenik mengganggu genome-wide dan metilasi DNA situsspesifik. Paparan arsenik Prenatal menyebabkan perubahan dalam metilasi
DNA, menyebabkan ekspresi gen yang berubah, menyebabkan karsinogenesis
hati. Selain metilasi DNA, diferensial ekspresi miRNA juga dapat memodulasi
ekspresi protein yang dikodekan oleh miRNA target mRNA. Paparan arsenik
Prenatal mengubah miRNA pada janin tikus dan tikus dewasa. Dalam studi ini,
ditunjukkan ekspresi hati dari Hsp70 dan Hsc70 selama perkembangan

prenatal dan postnatal pada tikus terpajan arsenik. Selain itu, dapat diselidiki
apakah efek yang diamati adalah karena efek epigenetik arsenik. Dalam studi
ini ditinju untuk menentukan bagaimana ekspresi Hsp70 berubah selama
perkembangan postnatal awal setelah paparan arsenik prenatal.
Metode
Senyawa yang digunakan adalah Natrium Arsenat (NaAsO2). Hewan uji
yang digunakan adalah tikus ApoE-/-. Dikandangkan dengan kondisi ruang
bebas patogen dengan suhu yang terkontrol dan pencahayaan yang diatur 12
jam terang dan 12 jam gelap. Tahap awal perlakuan pada semua tikus
dilakukan chow diet standar dan diberi tap water. Tikus yang hamil diberikan
air yang mengandung 85 mg/l NaAsO2 (49 ppm arsenik) atau tap water
(kontrol). Dan diberikan higga kelahiran hinga berumur 3, 10 dan 24 minggu.
Hati tikus diamil dan di bekukan pada suhu -80oC. Isolasi protein dari total
homogenat hati dilakukan dengan dengan menghomogenkan hati tikus yang
dibekukan dalam buffer Radioimmunoprecipitation assay (RIPA) atau buffer SDS
lisis dan dengan protease inhibitor. Disentrifugasi, supernatan yang didapat
merupakan ekstrak protein, yang konsentrasinya ditentukan dengan
bicinchoninic acid protein assay.
Ekstraksi fraksi sitostolik dan nukleus dilakukan dengan memberi cairan
nitrogen pada hati beku pada Dounce homogenizer. Dan ditambahkan buffer
poliamine A. Suspensi yang didapat diambil beberapa mL dan dimasukkan ke
mikrosentrifuge yang mana akan menghilangkan fraksi sitosolik dan akan
ditransfer ke tube baru dala suhu -80oC.
Nuclear pellet yang didapat disuspensikan kembali dengan poliamin A dan
larutan sukrosa dan disentrifuge di Backman TLA 120.2 rotor pada 95,000 x g,
selama 1 jam dengan suhu 4oC. Supernatan akan hilang dan nuclear pelled dilis
di buffer B (HEPES, NaCl, MgCl2, gliserol 12%, DTT, urea PMSF, aprotinin,
leupeptin, pepsatin, dan pospatase inhibitor) dan diinkubasi selama 30
menitada suhu 4oC dan supernatan diambil dan disimpan pada suhu -80oC
sebagai extrak nuklear. Konsentrasi protein dalam sitoplasma dan ekstrak
nuklear dihitung dengan Bio-Rad protein assay.
Analisis western blot dilakukan dengan memisahkan protein dengan SDS-Page
dan ditransfer ke membran nitroselulosa. Membran diinkubasi dengan antibodi
primer termasuk antibodi tikus dan kelinci monoklonal Hsp 70, antibodi

monoklonal tikus Hsc 70, antibodi poliklonal kelinci Hsf1, dan antibodi
poliklonal kelinci Nrf2. Membran diinkubasi dengan anibodi sekunder yang
sesuai untuk berikatan dengan HRP. Membran diinkubasi dengan ECL atau ECL
plus substrat. Membran ECL dipaparkan XAR x-ray film.Sinyal divisualisasikan
langsung pada Storm Phosphoimager pada mode plouroresen biru. Kuantitatif
dihitung dengan Image Quant.
Uji metilasi DNA global dilakukan dengan isolasi pada jaringan hati yang telah
dibekukan dan diinkubasikan dalam buffer lisis. DNA murni dilarutkan dalam
buffer TE dan dihituk secara kuantitatif dengan A260. Metilasi DNA globat
dideterminasi dengan methyl acceptance assay.
Daerah promotor dan pulau CpG metilasi Hsp70, Natrium bisulfi mengubah
semua unmetilasi sitosin menjadi residu urasil namun 5-metil sitosin resisten
terhadap konversinya. Amplifikasi PCR kemudian mengkonvert urasil menjadi
timidin. Setelah Squensing, sitosis yang tak termetilasiterdeteksi sebagai
timidin, yang bisa membuatnya terdeterminasi sebagai daerah metilasi khusus.
Kemudian dilakukan analisis statistik dengan ANOVA.
Hasil
Hepatic Hsp70 dan Hsc70 Ekspresi Selama Postnatal
Hasil menunjukkan bahwa paparan arsenik prenatal menyebabkan penundaan
semendara induksi Hsp70, sehingga menunjukkan keadaan stres sementara
dalam hati tikus yang terpapar. Berbeda dengan peningkatan ekspresi diamati
dengan diinduksi Hsp70, ekspresi konstitutif Hsc70 tidak berubah selama
setiap tahap perkembangan.
Analisis Metilasi DNA global
Uji ini menggunakan methyltransferase DNA bakteri yang memetilasi semua
unmethylated sitosin dalam DNA. Dalam DNA dari kedua tikus terpapar arsenik
dan tak terpapar arsenik, penggabungan [3H] ke dalam DNA menjadi menurun
dengan bertambahnya usia. Dengan demikian, DNA hati menjadi
hypermethylated sesuai usia tikus. Namun, paparan arsenik prenatal tidak
mengubah status metilasi DNA global pada usia berapa pun.
Status metilasi Daerah Promotor dan Pulau CpG Hsp70
Data menunjukkan bahwa daerah promotor (R1) dari Hsp70 benar-benar
unmethylated di DNA dari kedua tikus terpapar arsenik dan tak terpapar

arsenik. Namun, analisis daerah Hsp70 (R2-R5) menunjukkan pola metilasi

yang berbeda, dengan wilayah spesifik hipometilasi dan hipermetilasi. Dalam
banyak kasus, situs CpG benar-benar termetilasi atau unmethylated. Metilasi
Wilayah 3 (R3 mencakup 503-856) meningkat pada DNA tikus yang terpapar
arsenik.
Translokasi dan Aktivasi Inti HSF1 dan Nrf2
Untuk menentukan apakah paparan arsenik memiliki pengaruh hulu pada
faktor transkripsi yang mengatur ekspresi Hsp70, analisis Western blot sitosol
dan inti protein Hsf1 dan Nrf2 dilakukan. Data menunjukkan bahwa mekanisme
induksi Hsp70 oleh paparan arsenik bukan dengan aktivasi faktor transkripsi
Hsf1 dan Nrf2.
Sumber
Ngalame, Ntube N.O., et all, 2012, Delayed Temporal Increase of Hepatic Hsp70
in ApoE Knockout Mice After Prenatal Arsenic Exposure, Toxicological
Sciences
Young, J., Hongbao, M., 2008, Practical Technique of Western Blotting, The
Journal of American Science