Data Pengamatan

No
1.
2.
3.

Perlakuan
Ekstrak buah pisang dikeluarkan dari lemari es
Ekstrak dihangatkan di atas penangas air
Ditambahkan PBS agar lebih cair kemudian

Hasil
Larutan ekstrak mengental
Ekstrak mulai mencair
Diperoleh larutan bening

disentrifugasi

pada

bagian

atas

dan

endapan serat pada bagian

bawah
4.

Diambil 5 ml larutan kental dan dimasukkan ke

dalam kolom yang telah berisi kapas, gel sphadex

5.

G-100 yang sudah mengembang

Ditambahkan PBS ke dalam kolom

6.

kolom
Disiapkan 25 botol vial yang telah dikalibrasi Diperoleh hasil fraksinasi

PBS memasuki ruangan

masing-masing 3 ml. Lalu diletakkan untuk pada

25

botol

vial,

menampung hasil fraksinasi,kran pada alat kolom masing-masing botol berisi

dibuka hingga fraksi memasuki botol, jika sudah 3 ml7
mencapai batas kalibrasi, botol diganti.Begitu
seterusnya sampai botol ke 25. Jika PBS sudah
mulai berkurang, PBS dimasukkan kembali ke
7.

dalam alat kolom

Hasil fraksinasi diuji dengan HPLC

Protein

teridentifikasi

mengandung protein pada

botol ke 1-10

Hasil HPLC
Fraksi

Jumlah
Protein

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10

1.645
1.164
1.973
0.803
0.453
0.434
0.209
0.034
0.018
0.021

Grafik Nilai HPLC

Nilai HPLC
2.5
2
1.5
Nilai Absorbansi
1
0.5
0
1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

8.0

9.0

0.02
10.0

Dari grafik menunjukkan protein terkandung pada fraksi ke 1-10, fraksi yang
memiliki jumlah protein terbanyak yaitu pada fraksi ke tiga.

PEMBAHASAN
Pada

praktikum

dilakukan

perbedaan ukuran molekul. Ekstrak

fraksinasi protein dari ekstrak buah

yang sebelumnya disimpan di dalam

pisang

fraksinasi

lemari pendingin 2-4oC menjadi kental

filtrasi gel. Fraksinasi ini didasari oleh

seperti gel, oleh karena itu ekstrak

dengan

ini
metode

dihangatkan terlebih dahulu di atas

penangas air

dilarutkan dalam 60 mL air bebas ion

15 menit agar

sambil diaduk dengan magnetik stirer

ekstrak mencair kembali. Ektrak masih

perlahan selama 30 menit. Air yang

kental, sehingga ditambahkan kembali

digunakan harus bebas ion agar tidak

larutan PBS. Ekstrak disentrifugasi

mengganggu struktur protein. Protein

untuk memisahkan bagian serat pada

terdiri dari protein yang bermuatan

pisang dengan sari dari ekstrak pisang

postitif, negative, dan netral. Jika

tersebut

menggunakan air yang mengandung

selama

10

menit,

maka

didapatkanlah sari ekstrak buah pisang

ion,

maka

ion

tersebut

yang sangat bening. Ekstrak yang akan

berinteraksi pada protein sehingga

digunakan untuk senftrifugasi harus

mengganggu

bening agar larutan tersebut mudah

sendiri. Larutan didiamkan selama 3

untuk difraksinasi. Jika masih terdapat

hari pada suhu dingin atau selama 3

serat, maka, fraksi akan sulit untuk

jam pada suhu 90C. Proses ini adalah

menetes.

proses pengembangan Sphadex G-100.

struktur

akan

protein

itu

Proses ini dilakukan supaya sphadex

Fraksinasi ini dilakukan mengunakan

menjadi gel. Gel ini nantinya akan

alat kolom. Alat kolom ini harus

menjadi barrier sehingga molekul yang

dibersihkan

untuk

turun adalah molekul pada ukuran

menghindari kontaminasi dari pengotor

tertentu. Rentan berat molekul pada

ataupun protein lainnya. Alat kolom

Sphadex G-100 adalah 4,000-100,000.

berisi kapas, Sphadex G-100, dan

Kemudian matriks dicuci dengan 50

ekstrak pisang yang telah bening.

mL PBS 0,05 M pH 6 dan diagitasi

Kapas diletakkan pada bagian dasar

untuk

kolom. Kapas ini berfungsi untuk

udara hilang.

terlebih

dahulu

membantu penyerapan senyawa yang

akan dipisahkan. Selain itu kapas juga
membantu menjernihkan ekstrak dari
pengotor agar tidak ikut dalam ekstrak
sehingga nantinya terpisah dalam labu
penampung. Pada bagian atas kapas
dimasukkan Sphadex G-100 sebagai
matrix gel filtrasi. Sphadex dibuat
dengan cara 0,5 g sephadex G-100

menghilangkan

gelembung

Sphadex G-100 ini dituangkan ke

dalam alat kolom. Jika terbentuk
rongga udara, bagian luar kolom
diketuk agar rongga udara tersebut
hilang. Jika terdapat udara, maka akan
menyebabkan gel menjadi pecah dan
mengganggu
Ekuilibrasi

proses
dilakukan

fraksinasi.
dengan

mengalirkan sejumlah PBS 0,05 M pH

gel secara berulang-ulang dan akan

6. Proses ini dilakukan untuk mencuci

tertinggal dalam kolom lebih lama.

kolom. Setelah itu ekstrak bening

Karenanya,

sebanyak 5 ml dimasukkan pada

berdasarkan

bagian atas kolom, diamkan selama 5

molekul.

menit

sampai

sampel

memiliki

kesempatan untuk memasuki kolom

dan ditambahkan PBS 0.05 M pH 6
sampai memenuhi atas kolom. Elusi
perlahan

dilakukan.

Botol

vial

sebelumnya telah dikalibrasi 3 ml.

Elusi dilakukan sampai mencapai 3 ml
dilakukan pada botol 1. Jika pada botol
1 telah mencapai 3 ml, maka diganti ke
botol vial 2, begitu seterusnya sampai
botol vial ke 25. Pada saat proses
fraksinasi, jika PBS mulai habis, maka
ditambahkan

kembali

sampai

memenuhi bagian atas kolom. Dalam

hal ini, Sphadex G-100 merupakan
fase diam sedangkan PBS sebagai
eluen nya.

Setelah

protein

akan

penurunan

seluruh

botol

terelusi
ukuran

vial

terisi,

kemudian nilai absorbansi pada 280

nm

dari

mendeteksi

fraksi

individual

protein.

Proses

untuk
ini

dilakukan dengan teknik HPLC (High

Performance Liquid Chromatography).
Prinsip dari HPLC yaitu menggunakan
bantuan pompa fasa gerak cair pada
alat HPLC yang dialirkan melalui
kolom ke detektor. Sampel hasil
fraksinasi dimasukkan ke dalam aliran
fasa gerak dengan cara penyuntikan.
Pada saat sebelum penyuntukan, alat
HPLC harus dipastikan netral terlebih
dahulu dengan cara pemberian larutan
PBS. Kemudian ditekan tombol zero
agar menunjukkan angka nol. Di dalam

Prinsip fraksinasi ini adalah perbedaan

kolom terjadi pemisahan komponen-

ukuran molekul. Pemisahan beragam

komponen campuran yang disebabkan

protein dalam sampel buah pisang

perbedaan kekuatan interaksi zat yang

disebabkan

perbedaan

terlarut terhadap fasa diam. Zat terlarut

kemampuannya untuk memasuki pori-

yang kurang kuat interaksinya dengan

pori pada Sphadex G-100. Secara

fasa diam akan keluar dari kolom lebih

umum, protein besar tidak dapat

dulu. Sementara itu, zat terlarut yang

memasuki pori-pori gel dan akan

berinteraksi kuat dengan fasa diam

terelusi dengan cepat dari kolom.

akan keluar kolom dan dideteksi oleh

Protein

akan

detektor kemudian direkam dalam

memasuki dan meninggalkan pori-pori

bentuk kromatogram kromatografi gas.

yang

oleh

lebih

kecil

Dari hasil percobaan, diperoleh 25

berbeda-beda. Jika ditinjau dari data

macam fraksi. Fraksi ini kemudian

pengamatan yang diperoleh, fraksi

diuji dengan HPLC. Ternyata fraksi

pertama menunjukkan adanya protein

yang mengandung protein terdapat

yang cukup banyak dibandingkan pada

pada fraksi ke 1-10. Nilai absorbansi

fraksi ke-2. Jika merujuk kembali pada

yang tertinggi ditunjukkan pada fraksi

prinsip fraksinasi filtrasi gel dimana

nomer 3. Analisis HPLC dihentikan

protein dengan ukuran molekul yang

pada

nilai

paling kecil akan memasuki dan

absorbansi yang diproleh sudah sangat

meninggalkan pori-pori gel pertama

kecil, yaitu sebesar 0,021.

kali, maka pada fraksi pertama, protein

fraksi

ke-10

karena

yang terkandung di dalamnya cukup

Protein memiliki ukuran molekul yang
berbeda-beda.

Jenis

protein

yang

terdapat pada ekstrak pisang pun

banyak dengan ukuran molekul yang

paling kecil dibandingkan pada fraksi
yang lainnya.