PEWARNAAN BAKTERI SECARA GRAM

BAB II
PRAKTIKUM KE IV (PEWARNAAN BAKTERI SECARA GRAM)

A. Tujuan Praktikum
Adapun tujuan praktikum mengenai pewarnaan bakteri secara gram ini antara lain untuk
memahami cara identifikasi dengan metode pewarnaan dan mikroskop.

B. Dasar Teori
Pewarnaan secara gram adalah pewarnaan yang sangat berguna dan paling banyak
digunakan dalam laboratorium mikrobiologi dan klasifikasi bakteri, karena merupakan tahapan
penting dalam langkah awal identifikasi. Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau tipisnya
lapisan peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada membran sel
bakteri. Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan gram dibagi menjadi dua yaitu gram positif dan
gram negatif. Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang tebal dan membran sel selapis.
Sedangkan baktri gram negatif mempunyai dinding sel tipis yang berada di antara dua lapis
membran sel.
Karena kemampuannya membedakan suatu kelompok bakteri tertentu dari kelompok
lainnya, maka pewarnaan ini juga disebut pewarnaan diferensial.
Mikroorganisme terutama bakteri sulit dilihat dengan menggunakan mikroskop cahaya, karena
tidak mengasorbsi ataupun membiaskan cahaya.
Tehnik pewarnaan merupakan cara yang banyak dipergunakan untuk melihat struktur dan
morfologi bakteri. Terdapat beberapa tehnik pewarnaan diantaranya, pewarnaan sederhana

merupakan pewarnaan yang hanya menggunakan satu macam larutan warna contohnya
pewarnaan sederhana dan pewarnaan negative, kemudian pewarnaan diferensial, merupakan
pewarnaan yang menggunakan lebih dari satu macam larutan warna, contohnya pewarnaan gram,
pewarnaan tahan asam, pewarnaan kapsul, dan pewarnaan spora.
Sebelum melakukan prosedur pewarnaan terhadap bakteri, terdapat beberapa hal yang
perlu diperhatikan, seperti gelas objek dibersihkan dengan menggunakan alcohol 70% untuk
menghilangkan debu atau lemak, kemudian pewarnaan diferensial terlebih dahulu dibuat
preparat, dan fiksasi dapat dilakukan dengan melewatkan preparat ulas diatas nyala api, adapun
tujuan dilakukan fiksasi antara lain untuk melekatkan sel bakteri pada objek glass, mematikan sel
bakteri dan lain sebagainya.

C. Alat dan Bahan

a.

Biakan bakteri E. Coli, Streptococus, dan Pseudomonas

b. Mikroskop
c.

Larutan Kristal violet

1. Kristal violet 2 gram

2. Etil alcohol 20 gram
3. Ammonium oksalat 0,8 gram
d. Larutan lugol
1. Iodine 1 gram
2. Kl 2 gram
3. Aqua dest 300 ml
e.

Alcohol 96 %

f.

Larutan safranin

1. Safranin 0,25 gram

2. Alcohol 95 % 10 ml
3. Aqua dest 100 ml
g. Alcohol 70 %
h. NaCl
i.

Aqua dest

j.

Lampu spritus

k. Jarum Ose
l.

Objek glas

m. Pinset (Penjepit kayu)

D. Cara Kerja
1. Pewarnaan sederhana.
Pertama - tama membuat preparat ulas dengan cara :
1) Bersihkan kaca objek dengan menyemprotkan alcohol 70 %, kemudian lap dengan
menggunakan tisu atau kapas.
2) Pindahkan suspense bakteri dengan menggunakan jarum ose keatas kaca objek, dekatkan dengan
api spritus agar kerja berjalan steril.
3) Campur dengan NaCl hingga merata. Oleskan campuran ini diatas kaca objek.
4) Biarkan preparat mengering di udara sebentar.
5) Fiksasi diatas api spritus.
Kemudian,
6) Beri atau tetesi larutan metylen blue, diamkan sebentar sekitar 20-30 detik.

7) Zat warna dituang, kemudian bilas dengan aqua dest mengalir.

8) Preparat dikeringkan di udara,
9) Amati dengan menggunakan mikroskop.
2. Pewarnaan gram.
Pertama tama membuat preparat ulas dengan cara :
1) Bersihkan kaca objek dengan menyemprotkan alcohol 70 %, kemudian lap dengan
menggunakan tisu atau kapas.
2) Pindahkan suspense bakteri dengan menggunakan jarum ose keatas kaca objek, dekatkan dengan
api spritus agar kerja berjalan steril.
3) Campur dengan NaCl hingga merata. Oleskan campuran ini diatas kaca objek.
4) Biarkan preparat mengering di udara sebentar.
5) Fiksasi diatas api spritus.
Kemudian,
6) Beri atau tetesi larutan Kristal violet, diamkan sebentar lalu bilas dengan aqua dest mengalir.
7) Tetesi larutan lugol, diamkan sebentar lalu lunturkan dengan alcohol 96 % goyangkan sampai
tidak ada lagi zat warna mengalir di preparat.
8) Zat warna dibuang bilas dengan aqua dest mengalir.
9) Tetesi dengan larutan safranin diamkan sebentar.
10) Zat warna dibuang dengan membilas dengan menggunakan aqua dest mengalir.
11) Preparat dikeringkan dengan menggunakan kertas saring.
12) Amati dengan menggunakan mikroskop.
F. Pembahasan

Pewarnaan yang dilakukan merupakan pewarnaan sederhana dan pewarnaan gram.

Dimana pewarnaan sederhana merupakan pewarnaan yang hanya menggunakan satu macam
pewarna saja, sedangkan pewarnaan gram merupakan pewarnaan yang menggunakan pewarna
lebih dari satu macam.
Pada pewarnaan sederhana menggunakan satu macam pewarna metylen blue, sehingga
ketika diamati dengan menggunakan mikroskop maka pada bakteriE.coli akan terlihat bewarna
biru keungu-unguan, pada bakteri Streptococuskelihatan bewarna biru keungu-unguan, dan pada
bakteri ketiga yaitu bakteriPseudemonas, ketika diamati ternyata bewarna ungu kebiru-biruan
pudar.
Sedangkan pada pewarnaan gram menggunakan lebih dari satu macam pewarna seperti Kristal
violet, larutan lugol, dan larutan safranin. Pada pewarnaan gram apabilah bakteri berakhir
dengan warna merah maka bakteri tersebut merupakan bakteri gram negative, dan sebaliknya
apabilah tidak bewarna merah berarti merupakan bakteri gram positive.
Pada pewarnaan gram ini, ditemukan bahwa bakteri E. coli setelah diamati dengan
menggunakan mikroskop, terlihat bewarna merah, kemudian bakteristreptococcus tidak bewarna,
hanya ada sedikit warna merah yang merupakan pembiasan cahaya pada mikroskop, begitu juga
dengan bakteri Pseudomonasterlihat bewarna sedikit kemerah-merahan dan kelihatan merah
tambahan yang dihasilkan merupakan biasan cahaya dari mikroskop.

G. Kesimpulan
Berdasarkan hasil pengamatan, maka dapat disimpulkan bahwa :
a. Bakteri E.coli merupakan bakteri gram negative , karena berakhir dengan warna merah pada
akhir pewarnaan gram.

b. Bakteri Streptococus merupakan bakteri gram positif karena tidak berakhir dengan warna merah
pada akhir pewarnaan gram dan berbentuk kokus yang merupakan cirri daripada bakteri gram
positif.
c. Bakteri Pseudomonas merupakan bakteri gram negative , karena berakhir dengan warna
kemerahan pada akhir pewarnaan gram, serta berbentuk basil yang merupakan cirri daripada
bakteri gram positif.

Preparat tetesan bergantung (Hanging Drop)

Diposkan oleh . PooR pRinZa aPpLe . di 08.22.00

LAPORAN PRAKTIKUM
MIKROBIOLOGI I
PREPARAT TETESAN BERGANTUNG (HANGING DROP)

Oleh:

Oleh:
Nama
NIM

: Dian Octarina
: 08081004023

Asisten
Kelompok

: Farhan
: VIII (Delapan)

LABORATORIUM MIKRO
JURUSAN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS SRIWIJAYA
2009

LEMBAR HASIL KERJA

PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI
Judul Praktikum

: Preparat tetesan bergantung (Hanging Drop)

Nama / NIM

: Dian Octarina/08081004023

Kelompok

: VIII

Asisten

: Farhan

Tanggal

: 28

Oktober 2009
I.

TUJUAN PRAKTIKUM

Tujuan Praktikum ini adalah :

Untuk melihat pergerakan mikroorganisme.

II. LANDASAN TEORI

Mikroorganisme (bakteri, Cyanobacteria, jamur, protozoa, dan ganggang) dan
binatang-binatang kecil (multiseluler parasit dan invertebrata mikroskopis)
menampilkan berbagai bentuk dan ukuran. Sistem Whittaker, yang terdiri dari lima
kerajaan, menekan perbedaan dalam cirri-ciri seluler dan gizi, sedangkan sistem
Woese, yang terdiri dari tiga domain, menekankan perbedaan dalam ciri-ciri
biokimia. Sistem tersebut tidak mencakup virus, karena sifat, karakter yang unik
dan metode replikasi (Alexander 2004).
Bakteri hidup sukar untuk dilihat dengan mikroskop cahaya biasa karena
bakteri itu tampak tidak berwarna, jika diamati secara sendiri-sendiri, walaupun
biakannya secara keseluruhan mungkin berwarna. Namun, sering diperlukan dan
lebih disukai untuk melihat bakteri hidup dibawah mikroskop, khususnya untuk
menentukan apakah bakteri-bakteri tersebut dapat bergerak (Volk 1993).
Suatu cara pengamatan bakteri hidup yang memuaskan ialah dalam sediaan
tetesan bergantung. Setetes biakan cair (atau organisme disuspensi dalam air)
diletakkan ditengah sebuah kaca penutup. Disini dipakai gelas preparat khusus
dengan cekungan ditengahnya. Cekungan dilingkari oleh lapisan petrotalum
kemudian dibalikkan diatas kaca penutup, sehingga tetesan biakan berada ditengah
cekungan. Seluruh preparat dengan kaca penutup kemudian secara cepat
dibalikkan lagi sehingga tetesan biakan benar-benar menggantung pada kaca
penutup di dalam cekungan. Gelas preparat diletakkan pada meja mikroskop dan
organisme diamati dengan lensa objektif tinggi kering atau imersi minyak (Volk
1993).

Pada umumnya tolak ukur pertumbuhan (multiplikasi) bakteri dan lain-lain

mikroorganisme uniseluler adalah hasil penentuan penambahan jumlah dalam
hubungan dengan waktu. Misalnya ke dalam medium yang berisi 50 ml bulyon steril
dengan suhu 35C ditanam setetes cairan yang kira-kira 10 sel bakteri yang
biasanya ditemukan dalam usus, misalnya Esherichia coli. Bakteri colon ini diambil
dari biakan persediaan yang sudah lama disimpan di lemari es dan tidak aktif.
Bulyon yang telah ditanam itu dieramkan pada suhu 35C. masalahnya sekarang
ialah secara berurutan menghitung jumlah bakteri yang ditemukan selang waktu
tertentu dengan cara mengambil sejumlah biakan bulyon tersebut misalnya 1 ml
(Irianto 2007).
Bentuk dan struktur bakteri dapat diamati dengan dua cara: (a). Dengan
mengamati pergerakan sel-sel hidup, tanpa pewarnaan, (b). Mengamati sel-sel yang
mati dengan pewarnaan. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan tidak
kontras dengan air, di mana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Oleh karena itu
pengamatan tanpa pewarnaan menjadi lebih sukar dan tidak dapat digunakan
untuk melihat bagian-bagian sel dengan teliti. Pewarnaan akan menyebabkan
bakteri-bakteri tersebut berwarna dengan sekelilingnya, sehingga akan terlihat lebih
jelas. Pada umumnya pergerakan mikroba dapat dibagi menjadi dua macam, yaitu
gerak pasif dan gerak aktif. Gerak pasif disebabkan oleh adanya gerakan pertikelpertikel disekitarnya, misalnya gerakan dari molekul-molekul (gerakan Brown) yang
menyebar kesemua arah. Sedangkan gerakan aktif disebabkan oleh pergerakan
mikroba itu sendiri. Berdasarkan cara pergerakannya, mikroba dibagi atas mikroba
yang bersifat motil dan bersifat non-motil. Mikroba motil ialah mikroba yang dapat
bergerak karena mempunyai flagella, sedangkan bakteri non-motil tidak dapat
bergerak (Sutedjo 1991).
Preparat basah atau preparat tetes bergantung memungkinkan pemerikasaan
organisme hidup yang tersuspensi dalam zat alir. Preparat baasah diperoleh dengan
menaruh setetes zat alir yang mengandung organisme pada kaca dan menutupnya
dengan kaca sangat tipis yang dinamakan kaca tutup. Untuk mengurangi laju
penguapan dan meniadakan aliran udara, tetesan itu biasanya dilingkari dengan
jeli petroleum atau bahan serupa sehingga antara kaca objek dan kaca terkatup
rapat. Tersedia kaca objek khusus dengan daerah cekung ke dalam untuk preparat
tetes bergantung. Preparat basah atau preparat tetes bergantung berutama
berguna apabila morfologi mikroorganisme yang ditengah diperiksa dapat rusak
karena perlakuan dengan panas atau bahan kimia ataupun bila organisme itu sukar
diwarnai. Cara itu pun merupakan metode pilihan untuk mengamati proses-proses
kehidupan tertentu, misalnya seperti motilitas dan reproduksi. Apabila preparat
basah diperiksa dengan mikroskop medan terang, amatlah penting untuk

menyesuaikan cahaya dengan benar. Preparat basah atau preparat tetes gantung
memungkinkan pemeriksaan organisme hidup yang tersuspensi di dalam zat alir
(Pelczar 1986).
Bentuk dan struktur bakteri dapat diamati dengan dua cara: (a). Dengan
mengamati pergerakan sel-sel hidup, tanpa pewarnaan, (b). Mengamati sel-sel yang
mati dengan pewarnaan. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan tidak
kontras dengan air, di mana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Oleh karena itu
pengamatan tanpa pewarnaan menjadi lebih sukar dan tidak dapat digunakan
untuk melihat bagian-bagian sel dengan teliti. Pewarnaan akan menyebabkan
bakteri-bakteri tersebut berwarna dengan sekelilingnya, sehingga akan terlihat lebih
jelas. Pada umumnya pergerakan mikroba dapat dibagi menjadi dua macam, yaitu
gerak pasif dan gerak aktif. Gerak pasif disebabkan oleh adanya gerakan pertikelpertikel disekitarnya, misalnya gerakan dari molekul-molekul (gerakan Brown) yang
menyebar kesemua arah. Sedangkan gerakan aktif disebabkan oleh pergerakan
mikroba itu sendiri. Berdasarkan cara pergerakannya, mikroba dibagi atas mikroba
yang bersifat motil dan bersifat non-motil. Mikroba motil ialah mikroba yang dapat
bergerak karena mempunyai flagella, sedangkan bakteri non-motil tidak dapat
bergerak (Sutedjo 1991).
Menurut Brown gerakan bakteri menggunakan preparat tetesan bergantung
biasanya lurus dan tak tentu arahnya. Metode ini enggunakan tabung-tabung
dengan suspense dari berbagai derajat kekeruhan. Tiap-tiap derajat tersebut
dengan tingkat kekeruhan equivalen dengan jumlah tertentu permilimeter.
Suspense bakteri yang ingin diperiksa jumlanya dibandingkan dengan kekeruhan
dalam tabung, yaitu dengan ukuran yang sama (Irianto 2006).
Menyesuaikan cahaya dengan benar pada mikroskop medan terang dalam
mengamati preparat tetes bergantung, intensitas cahaya dapat dikurangi dengan
menggunakan filter khusus. Mikroskopi medan gelap dan mikroskopi kontras fase
memberikan keuntungan khusus untuk pemeriksaan sel-sel mikrobe yang tidak
diwarnai yang tersuspensi dalam cairan. Kedua macam mikroskopi menghasilkan
kontras yang lebih baik antara mikroorganisme (atau sebagian daripadanya) dan
bahan latar belakangnya. Teknik ini digunakan di laboratorium diagnostic klinis,
khususnya untuk pemeriksaan specimen yang diduga mengandung protozoa
didalamnya. Sel protozoa umumnya lebih besar dari kebanyakan bakteri dan
mempunyai stuktur internal yang lebih rumit. Struktur-struktur ini, atau bagian
intraseluler, penting untuk mencirikan spesies dan dapat diamati dengan
menggunakan mikroskopi medan gelap atau kontras fase (Pelczar 1986).

Dalam sediaan preparat tetes bergantung, hanya dapat mengalami

pengamatan bakteri selama fluida masih bergantung pada kaca penutup, jika fluida
telah menetes pada kaca benda, maka pengamatan akan sulit dilakukan. Melalui
preparat tersebut dapat dilihat mikroba yang bergerak. Pengelompokan bakteri
secara natural dan reaksi kimia terhadap bahan kimia (Burdon 1994).
Tolak ukur pertumbuhan (multiplikasi) bakteri dan lain-lain mikroorganisme
uniseluler adalah hasil penentuan penambahan jumlah dalam hubungan dengan
waktu. Misalnya ke dalam medium yang berisi 50 ml bulyon steril dengan suhu 35C
ditanam setetes cairan yang kira-kira 10 sel bakteri yang biasanya ditemukan
dalam usus, misalnya Esherichia coli. Bakteri colon ini diambil dari biakan
persediaan yang sudah lama disimpan di lemari es dan tidak aktif. Bulyon yang
telah ditanam itu dieramkan pada suhu 35C. masalahnya sekarang ialah secara
berurutan menghitung jumlah bakteri yang ditemukan selang waktu tertentu
dengan cara mengambil sejumlah biakan bulyon tersebut misalnya 1 ml (Irianto
2007).

III.

1.

Mikroskop

HASIL PENGAMATAN

Keterangan :
1.

Lensa okuler

6. Cermin

2.

Revolver

7. Alas mikroskop

3.

Lensa objektif

8. Lengan mikroskop

4.

Meja preparat

9. Kondensor

5.

Diafragma

2.

Preparat Tetes Bergantung

Air Got (perbesaran 4 x 10)

IV.

PEMBAHASAN

Dalam studi organisme mikroskopis, mikroskop sangat dibutuhkan. Mikroskop dapat

memperjelas mata dalam mengamati organisme berukuran sangat kecil yang tidak dapat dilihat
dengan mata telanjang. Hal ini sesuai dengan pendapat Campbell (2002) bahwa dua nilai
penting sebuah mikroskop ialah daya pembesaran dan penguraiannya, atau resolusi.
Pembesaran mencerminkan berapa kali lebih besar objeknya terlihat dibandingkan dengan
ukuran sebenarnya. Daya urai merupakan ukuran kejelasan citra, yaitu jarak minimum dua titik
yang dapat dipisahkan dan masih dapat dibedakan sbegai dua titik terpisah.
Berdasarkan sumber penerangan sinarnya, mikroskop dibedakan dalam beberapa jenis
dengan kemampuan perbesaran yang berbeda pula. Hal ini sesuai dengan pendapat Alexandes
(2004) bahwa mikroskop yang biasa digunakan di laboratorium adalah mikroskop cahaya, dan
ada pula mikroskop yang mampu menggantikan cahaya tampak dan memfokuskan berkas
electron melalui specimen, yakni mikroskop electron. Mikroskop cahaya memperbesar objek
hingga 1000X dan dapat dipergunakan untuk mempelajari ukuran sel, bentuk dan pengaturan.
Terdapat dua jenis mikroskop electron, yaitu mikroskop elektron transmisi (TEM) dan
mikroskop elektron payar (SEM). Mikroskop elektron transmisi memungkinkan memagnifikasi
hingga 100.000X, sehingga memungkinkan dapat mempelajari detail internal sel, dan
mikroskop elektron payar (SEM) menggunakan ketelitian hingga 20.000X yang mampu
menampilkan sel dalam tiga dimensi.

Komponen mikroskop dibagi menjadi dua bagian, yaitu bagian optik dan bagian
mekanik. Hal ini sesuai dengan pendapat Sutedjo (1991) bahwa bagian-bagian mekanik pada
mikroskop terdiri dari statif, tubus, revolver, maja benda, sekrup pengatur tubus (halus dan
kasar), sekrup pengatur kondensor dan sekrup-sekrup pengatur meja benda. Dan bagian optic
mikroskop mencangkup lensa okuler, lensa objektif, kondensor dan cermin pengatur cahaya.
Pengamatan terhadap air selokan pada preparat tetes bergantung di bawah mikroskop,
terlihat hasil pergerakan euglena. Protozoa ini berbentuk elips/lonjong, berwarna hijau dan
memiliki pergerakan yang maju. Hal ini sesuai dengan pendapat Irianto (2002) bahwa euglena
merupakan protozoa yang memiliki flagella dan memiliki klorofil dan kloroplas yang
menyebabkan warna hijau pada tumbuhan tingkat tinggi. Para ahli tumbuhan memasukkannya
dalam dunia tumbuhan. Sedangkan para ahli hewan memasukkannya ke dalam dunia hewan
karena bergerak secara aktif dan memiliki bintik mata.
Pada praktikum preparat tetasan bergantung ini, salah satu bahan yang digunakan ialah
vaselin. Vaselin digunakan saat meletakkan/menutupkan kaca penutup pada kaca objek.
Vaselin berfungsi untuk mempertahankan air yang mengandung mikrobia yang akan diamati
yang telah diletakkan pada kaca objek dan ditutup dengan kaca penutup serta merekatkan kaca
penutup pada kaca objek agar air di dalam dapat dipertahankan dan tidak menyebar kemanamana. Yang mempermudah terhadap pengamatan gerakan mikrobia air tersebut. Hal ini sesuai
dengan pendapat Dwidjosepoetro (1998) bahwa gerakan pada mikroba dibagi menjadi dua
macam, yaitu gerak pasif dan gerak aktif. Gerak pasif disebabkan oleh adanya gerakan partikelpartikel disekitarnya, misalnya gerakan dari molekul-molekul air (gerakan Brown) yang
menyebar ke semua arah. Sedangkan gerakan aktif disebabkan oleh gerakan mikroba itu
sendiri.
Dengan menggunakan preparat tetes bergantung, pergerakan mikroba dalam objek air
yang diamati di bawah mikroskop akan tampak jelas pergerakannya. Hal ini sesuai dengan
pendapat Schlejel (1994) bahwa preparat bawah atau preparat tetes bergantung berguna
terutama apabila dalam pengamatan morfologi mikroorganisme yang tengah diperiksa dapat
rusak karena perlakuan dengan panas atau bahan kimia ataupun bila organisme itu sukar
diwarnai. Berdasarkan geaknya, mikroba dibagi atas mikroba yang bersifat motil dan amotil.
Pada praktikum ini diperoleh gerak Brown yang termasuk mikroba motil yaitu yang dapat
bergerak.

V.

KESIMPULAN

Dari praktikum yang telah dilaksanakan dapat disimpulkan sebagai berikut :

1.

Mikroskop terdiri dari dua komponen, yiatu bagian mekanik dan bagian ortik.

2.

Bentuk dan struktur bakteri dapat diamati tanpa pewarnaan, yakni bagian mengamati
pergerakan sel-sel hidup.

3.

Preparat tetes bergantung digunakan dalam mengamati gerak bakteri dan gerak Brown dengan
menghindari penguapan.

4.

Bakteri dapat bergerak maju dan mundur karena benturan dari moekul air menurut Brown.

5.

Pada preparat tetes bergantung air got didapatkan gerak Brown yang berupa
gerakan dari mikrobia yang diamati.

gerakan-

6.

Di dalam air got terdapat protozoa, yaitu euglena yang berwarna hijau dan paramecium yang
putih transparan.