BAB III PEMBAHASAN

Suatu metode kromatografi cair kinerja tinggi fase balik yang sederhana dan tepat telah dikembangkan dan divalidasi untuk kuantifikasi dari pengawet benzalkonium klorida (BKC) dalam formulasi sediaan steril farmasi yakni tetes mata latanoprost. Latanoprost yang merupakan suatu analog sintetis prostaglandin F2 alami (PGF2), adalah suatu agen hipotensi okular. Larutan tetes mata latanoprost yang tersedia secara komersial adalah larutan jernih, tidak berwarna, obat isotonik dalam air steril untuk injeksi, dengan penambahan benzalkonium klorida sebagai pengawet. Suatu pencarian literatur yang komprehensif mengungkapkan bahwa peninjauan persiapan, farmakologi, hubungan struktural, efek yang dihasilkan dari penggunaannya, menggunakan metode HPLC, LC-MS, MS-MS dan metode kromatografi lainnya untuk penentuan latanoprost dan BKC secara terpisah, telah dilaporkan. Belum ada penelitian yang melaporkan penentuan latanoprost dan BKC secara bersamaan, sehingga terdapat kekurangan dalam penentuan prosedur yang sesuai untuk kuantifikasi dan estimasi pengawet BKC dalam formulasi sediaan farmasi latanoprost. Oleh karena itu, Tujuan dari studi yang berjudul Development and Validation of a Precise Method for Determination of Benzalkonium Chloride (BKC) Preservative, in Pharmaceutical Formulation of Latanoprost Eye Drops, adalah untuk pengembangan dan validasi dari metode yang sederhana, tepat dan akurat untuk kuantifikasi benzalkonium klorida (BKC) dengan deteksi HPLC-UV dalam formulasi sediaan farmasi obat tetes mata latanoprost. Untuk dapat menentukan kuantifikasi dari benzalkonium klorida (BKC) yang sesuai dalam formulasi tersebut, terlebih dahulu dilakukan persiapan sampel untuk selanjutnya dianalisa menggunakan metode HPLC. Sebanyak 25 mg benzalkonium klorida (Sigma Aldrich, Milan, Italia) dengan kemurnian tinggi dan diketahui potensinya, ditimbang dan dipindahkan ke labu ukur 50 mL. Sebanyak 30 mL air kelas Milli Q HPLC ditambahkan dan disonikasi untuk melarutkannya, diencerkan hingga volume yang sama dengan pelarut dan dicampur. Selanjutnya 2,0 mL larutan ini diencerkan sampai 10 ml dengan air Milli Q dan dicampur (5 mcg / mL). Kesesuaian sistem dan stabilitas dari solusi diperiksa selama periode dengan menginjeksikan larutan tersebut ke dalam sistem HPLC. Sebanyak 5 mL vial larutan tetes mata yang mengandung 0,01% BKC (b/v) & 0,005% (b/v) latanoprost langsung digunakan sebagai larutan sampel yang diuji dan diukur.

Analit tersebut dikromatografi pada kolom Spherisorb Waters CN, (4.6x250 mm) yang dikemas dengan partikel 5 m. Fase gerak, dioptimalkan melalui desain eksperimental, yakni campuran 40:60 (v/v) dari buffer kalium dihidrogen ortofosfat (pH 5,5) dan asetonitril, dipompa pada laju alir 1,0 mL / menit untuk mempertahankan suhu kolom 30 C. Deteksi UV maksimum dicapai pada 210 nm. Terdapat beberapa parameter validasi yang ditentukan, yakni stabilitas, linearitas, selektivitas, presisi intermediet, dan akurasi metode. Pengumpulan data dan interpretasi dilakukan dengan menggunakan perangkat lunak chromaleon. Parameter pertama yang diuji dalam validasi ini adalah stabilitas dari larutan yang digunakan dalam penelitian, pada suhu 25 C. Larutan sampel diinjeksikan dalam sistem kromatografi dan dicatat kromatogram pada interval reguler hingga 35 jam dan hasilnya ditemukan baik dalam kriteria penerimaan 2,0% dari penyimpangan hasil awal. Dicatat pula respon puncak untuk puncak utama dan dievaluasi persentase deviasi kurang dari 1,5% dalam respon puncak dari awal untuk kedua standar dan larutan sampel untuk kandungan BKC.

Spesifisitas dari suatu metode analisis adalah kemampuan suatu metode untuk mengukur konsentrasi analit (s) secara akurat dan spesifik, tanpa gangguan dari API lainnya, pengencer, fase gerak & plasebo (eksipien atau bahan tambahan setelah zat aktif dihilangkan). Spesifisitas metode ini ditunjukkan dengan menyiapkan beberapa larutan seperti fase gerak, persiapan standar, larutan placebo dalam tiga kali replikasi, placebo yang ditambahkan API dengan konsentrasi yang ditargetkan, serta larutan sampel. Seluruh larutan tersebut

diinjeksikan ke dalam sistem kromatografi cair yang dilengkapi dengan detektor foto dioda array. Kromatogram dicatat dan interferensi dari fase gerak dan plasebo dengan puncak analit diamati. Kemurnian puncak dari puncak analit juga diukur dalam plasebo yang ditambahkan API dan larutan sampel. Sebanyak 5.0 mL placebo (BKC yang telah

dihilangkan) dilakukan hal yang sama, tanpa pengenceran atau penambahan lebih lanjut. Penyiapan Placebo spike dengan API dilakukan dengan melarutkan 25 mg benzalkonium klorida dengan 30ml air HPLC Milli kelas Q dalam labu volumetrik 50 ml. Selanjutnya dilakukan sonikasi untuk menghomogenkan, dan diencerkan hingga volume yang sama dengan pelarut dan dicampur. Selanjutnya 2,0 mL larutan ini diencerkan sampai 10 ml dengan larutan plasebo dan dicampur. Berdasarkan hasil pengamatan dari kromatogram studi spesifisitas BKC, diketahui bahwa komponen dielusi pada waktu retensi sekitar 8.0 menit, dan kemurnian puncak menunjukkan bahwa ketiga spektrum yang diperoleh pada waktu yang berbeda berada dalam ambang batas yang ditetapkan untuk puncak ini. Tidak ada interferensi dengan puncak analit karena

plasebo atau fase gerak yang telah diamati. Pada studi dasar dan pengamatan tersebut di atas, metode yang ditetapkan adalah spesifik untuk analisis kualitatif-kuantitatif BKC dalam formulasi yang disebutkan. Puncaknya dapat ditemukan meningkat ketika sudut kemurnian puncak kurang dari ambang kemurnian puncak, atau puncak kemurnian dari puncak analit tidak kurang dari 990, yang menunjukkan bahwa puncak yang diamati adalah murni. Oleh karena itu, metode ini selektif dan cocok untuk tujuan yang dimaksudkan. Presisi adalah parameter yang mengekspresikan kedekatan hasil (tingkat pencar) antara serangkaian pengukuran yang diperoleh dari beberapa analisis dari sampel yang homogen dalam kondisi yang ditentukan. Disiapkan larutan standar sistem kesesuaian dan disuntikkan sebanyak lima ulangan suntikan larutan ini. Dengan rekaman kromatogram, diukur respon puncak untuk puncak analit yang ingin diamati, dan presisi instrumental ditunjukkan dalam hal persentase standar deviasi relatif untuk area puncak analit. Parameter lain seperti faktor tailing dan efisiensi kolom dalam hal pelat teoritis puncak analit juga diamati. Lima replikasi injeksi dari larutan standar kesesuaian sistem mengungkapkan bahwa, dengan menganalisis metode ini kesesuaian yang diinginkan dari instrumen HPLC dapat dicapai melalui analisis yang keluar. Nilai persentase standar deviasi relatif dari injeksi ulangan adalah sebesar 0,2%. Efektivitas dari kolom yang dipilih diamati dengan

mendapatkan rata-rata pelat teoritis di atas 10000 dan tailing yang diamati adalah sekitar 1,5 untuk puncak analit.

Gambar 1. Kromatogram Kesesuaian Sistem Standar Selain parameter tersebut, validasi dari metode ini juga dilakukan melalui analisa terhadap parameter repeatability. Selama enam kali berturut-turut, larutan standar kesesuaian sistem yang sama diinjeksikan dan persentase standar deviasi dan standar deviasi relatif (R.S.D.) diamati. Metode studi keterulangan dapat dibuktikan sukses ketika nilai RSD lebih

kecil atau sama dengan 1,5% untuk daerah puncak utama pada masing-masing dari enam set. Suatu RSD sebesar 0,1% diperoleh dalam penelitian ini, dengan menyuntikkan enam set larutan sampel. Nilai % RSD yang sangat rendah diamati untuk enam hasil uji, oleh karena itu disimpulkan bahwa metode ini tepat & reprodusibel untuk analisis kandungan pengawet yang dinyatakan dalam bentuk formulasi ini.

Pada penelitian ini juga dilakukan analisa terhadap parameter validasi presisi intermediet (kekasaran), yang bertujuan untuk memeriksa dan menetapkan dampak dari kondisi acak pada metode analitis. Presisi intermediet dievaluasi dengan menganalisis sampel yang sama oleh analis berbeda dalam dua hari yang berbeda dengan kolom yang berbeda dan sistem HPLC yang berbeda. Metode ini dapat dinyatakan memenuhi kriteria presisi intermediet atau ruggedness jika perbedaan antara hasil uji persentase kondisi normal dan kondisi yang berubah adalah dalam 2,0%. Uji persentase masing-masing sampel dihitung dan presisi ditunjukkan dengan mengevaluasi penyimpangan hasil uji persentase standar relatif, % RSD yang diamati adalah 0,8% dan perbedaan diamati antara dua kondisi adalah 0,6%. Perbandingan hasil ini menunjukkan bahwa kriteria dan metode yang disebutkan, diketahui memenuhi kriteria kekasaran untuk analisis.

Ketangguhan dari prosedur analitis adalah ukuran dari kemampuan suatu metode untuk tetap tidak terpengaruh oleh perubahan kecil yang dilakukan secara sengaja. Kuantifikasi ini dilakukan dengan perubahan kecil tetapi disengaja dalam yaitu parameter deteksi panjang gelombang, suhu kolom, pH fase gerak, perubahan pelarut organik, dan parameter kesesuaian sistem misalnya plat teoritis, tailing, dan % RSD. Berdasarkan hasil pengamatan diketahui bahwa seluruh parameter yang diamati memberkan nilai yang dapat diterima dengan semua kondisi yang berubah.

Linearitas merupakan salah satu parameter yang juga turut dianalisa dalam penelitian ini. Studi linearitas bertujuan untuk memverifikasi dan membuktikan bahwa larutan sampel berada dalam rentang konsentrasi yang mana respon analit adalah berbanding lurus dengan konsentrasi. Tingkat konsentrasi adalah 50, 75, 100, 125, 150% dari konsentrasi analit yang dinyatakan, sesuai dengan rentang sekitar 50-150 mcg/mL. Kurva kalibrasi diperoleh dengan memplot area puncak BKC terhadap konsentrasi larutan standar, yang ditemukan linear pada rentang konsentrasi yang disebutkan dari 50% sampai 150%. Untuk penerimaan linearitas, koefisien korelasi kurva linearitas tidak kurang dari 0,990 dan Y intercept bias tidak dapat berada dalam 2,0% tingkat respon linearitas 100%. Hasil menunjukkan bahwa metode tersebut adalah linier hingga kisaran tertentu dari konsentrasi.

Dengan mengunakan data di atas, dilakukan perhitungan menggunakan kalkulator untuk mendapatkan persamaan regresi linear, dan didapatkan hasil sebagai berikut : Y = 11820, 33 X 5740,57 Akurasi metode didefinisikan sebagai kedekatan nilai terukur dengan nilai sesungguhnya untuk sampel. Metode recovery dipelajari pada tingkat konsentrasi 50, 100 dan 150% dari BKC ke dalam larutan sampel. Uji parameter akurasi dilakukan dengan ditimbang 25 mg benzalkonium klorida dalam sebuah labu ukur 50 mL, dan ditambahkan sekitar 30 ml air HPLC Milli kelas Q. Selanjutnya dilakukan sonikasi untuk menghomogenkan, dan diencerkan hingga volume yang sama dengan pelarut dan dicampur. Penelitian ini dilakukan untuk menentukan hasil positif atau gangguan negatif yang dihasilkan oleh eksipien dalam formulasi. Hasil yang diperoleh untuk studi akurasi dalam sampel mulai konsentrasi BKC antara 50, 100 dan 150 ppm dan menjadi 100% sesuai dengan 100 ppm. Adapun persentase perolehan kembali yang dihasilkan adalah antara 98,5% dan 102,0% dari yang disuntikkan. Hasil yang ditemukan berada dalam kriteria penerimaan dengan % RSD diterima dari 2,0% pada setiap tingkat. Perolehan kembali di tiap tingkatan adalah antara 98,0-102,0% yang

menunjukkan bahwa metode ini tepat untuk menghasilkan estimasi yang akurat dari analog pengawet BKC dalam formulasi. Berikut ini adalah contoh perhitungan akurasi dengan spiked placebo recovery method dengan menggunakan data dalam penelitian tersebut. Diketahui : Persamaan regresi linear larutan standar : Y = 11820, 33 x 5740,57 Rata-rata luas puncak BKC dengan konsentrasi 50 % = 587556 Rata-rata luas puncak BKC dengan konsentrasi 100% = 1184149 Rata-rata luas puncak BKC dengan konsentrasi 150% = 1777390 Konsentrasi BKC teoritis : 50 mcg/ml, 100 mcg/ml, 150 mcg/ml. Dalam jurnal tidak disebutkan konsentrasi dari BKC yang ditemukan dari hasil analisa HPLC, namun berdasarkan data di atas dapat ditentukan konsentrasi BKC berdasarkan penelitian. Dengan memasukkan nilai rata-rata luas puncak ke dalam persamaan regresi linear larutan standar sebagai nilai y, maka nilai masing-masing konsentrasi (C) pada tiap tingkat dapat ditentukan. Y = 11820, 33 x 5740,57 Konsentrasi BKC 50 % (x) = (587556 + 5740,57) : 11820, 33 Konsentrasi BKC 50 % (x) = 50, 19 Dengan cara yang sama, diketahui bahwa nilai konsentrasi dari masing-masing tingkat konsentrasi BKC adalah sebagai berikut : Spike level (%) 50% 100 % 150 % mcg/mL (teoritis) 50 100 150 mcg/mL (hasil metode uji) 50,19 100,66 100,5

Selanjutnya nilai akurasi dapat dihitung dengan menggunakan rumus sebagai berikut : % recovery = hasil metode uji/ hasil teoritis x 100 %

Spike level (%)

mcg/mL (teoritis)

mcg/mL (hasil metode uji)

Persentase perolehan kembali (%)

50% 100 % 150 %

50 100 150

50,19 100,66 100,5

100, 38 100,66 100,5

Sedangkan berdasarkan jurnal, perhitungan persentase perolehan kembali diperoleh data sebagai berikut :

Hasil dari perhitungan di atas memiliki sedikit perbedaan, dimana hal ini disebabkan karena dalam jurnal tidak disebutkan secara rinci nilai konsentrasi yang diperoleh dari penelitian. Sehingga perhitungan yang kami lakukan untuk mendapatkan nilai konsentrasi adalah dengan menggunakan data rata-rata dari luas area puncak, sedangkan penentuan akurasi pada jurnal menggunakan data individual dari tiap pengukuran 3 replikasi spiked level. Oleh karena itu terjadi sedikit perbedaan namun tidak signifikan dari hasil yang diperoleh dalam jurnal.

BAB IV KESIMPULAN