LAPORAN RESMI

PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI FARMASI

PRAKTIKUM X
UJI ANGKA LEMPENG TOTAL

Penyusun :
1. Annisa Nilamsari Utami
14/362870/FA/10026 ()
2. Muhammad Faishal Mahdi 14/362873/FA/10029 ()
3. Cinantya Talia Paramita
14/362879/FA/10035 ()
Kelas

:A

Golongan / Kelompok

: II / 2

Hari, Tanggal Praktikum

: Rabu, 20 Mei 2015

Dosen Jaga

: Dr. rer.nat. Yosi Bayu Murti, M.Si., Apt.

Asisten Jaga

: Dita dan Dwi

Asisten Koreksi

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI FARMASI

BAGIAN BIOLOGI FARMASI
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS GADJAH MADA
YOGYAKARTA
2015

PRAKTIKUM X
UJI ANGKA LEMPENG TOTAL
I. Tujuan
Menetapkan cemaran bakteri yang terdapat dalam sediaan makanan, minuman,
kosmetika, obat atau obat tradisional.
II. Dasar Teori
Pertumbuhan bakteri dengan berbagai cara yang salah satunya yaitu uji angka
lempeng total. Pengukuran dengan platting technique (uji angka lempeng total) merupakan
metode perhitungan jumlah sel tampak (visible) dan didasarkan pada asumsi bahwa bakteri
hidup akan tumbuh, membelah, dan memproduksi satu koloni tunggal. Satuan perhitungan
yang dipakai adalah CFU (Colony Forming Unit) dengan cara membuat seri pengenceran
sampel dan menumbuhkan sampel pada media padat. Pengukuran dilakukan pada plate
dengan jumlah koloni berkisar 25-250 atau 30-300 (Pratiwi, 2008).
Uji angka lempeng total (ALT) merupakan metode yang umum digunakan untuk
menghitung adanya bakteri yang terdapat dalam sediaan yang diperiksa. Uji angka lempeng
total dapat dilakukan dengan dua teknik, yaitu teknik cawan tuang (pour plate) dan teknik
sebaran (spread plate). Pada prinsipnya dilakukan pengenceran terhadap sediaan yang
diperiksa kemudian dilakukan penanaman pada media lempeng agar. Jumlah koloni bakteri
yang tumbuh pada lempeng agar dihitung setelah inkubasi pada suhu dan waktu yang sesuai.
Perhitungan dilakukan terhadap petri dengan jumlah koloni bakteri antara 30-300. Titik
angka lempeng total dinyatakan sebagai jumlah koloni bakteri hasil perhitungan dikalikan
dengan faktor pengenceran. Jumlah angka lempeng total memenuhi aturan Departemen
Kesehatan RI jika kurang dari 106 (Jawetz dkk., 1995).
Prinsip dari metode cawan tuang adalah bila sel ditumbuhkan pada medium, maka
mikroba tersebut akan berkembang biak dan membentuk koloni yang dapat dilihat langsung
dan kemudian dihitung tanpa menggunakan mikroskop.
Metode ini merupakan cara yang paling sensitive untuk menentukan jumlah jasad
renik, dengan alasan :
a. Hanya sel mikroba yang hidup yang dapat dihitung.
b. Beberapa jasad renik dihitung sekaligus.
c. Dapat digunakan untuk isolasi dan identifikasi mikroba, karena koloni yang terbentuk
mungkin berasal dari mikroba yang mempunyai penampakan spesifik.
Selain keuntungan-keuntungan di atas, metode hitungan cawan juga mempunyai
kelemahan :
a. Hasil perhitungan tidak menunjukkan jumlah sel yang sebenarnya karena beberapa sel
yang berdekatan mungkin membentuk koloni.

b. Medium dan kondisi inkubasi yang berbeda mungkin menghasilkan jumlah yang berbeda
pula.
c. Mikroba yang ditumbuhkan harus dapat tumbuh pada medium padat dan membentuk
koloni yang kompak, jelas, dan tidak menyebar.
d. Memerlukan persiapan dan waktu inkubasi yang relatif lama agar pertumbuhan koloni
dapat dihitung.
Sementara teknik sebaran dilakukan dengan cara menuangkan media terlebih dahulu
kemudian setelah media memadat baru suspensi sampel dimasukkan pada permukaan agar
dan diratakan dengan spreader glass.
Keuntungan metode spread plate:
a. Sampel yang dibutuhkan hanya sedikit
b. Cocok untuk segala macam bakteri
c. Tidak terpengaruh suhu.
Kerugian metode spread plate:
a. Perlu menggunakan spreader glass
b. Perlu keahlian khusus dalam peralatan sampel agar media tidak rusak (Pratiwi, 2008).
Syarat-syarat metode yang baik adalah :
a. Susunan makanan harus terpenuhi untuk pertumbuhan bakteri, missal sumber nitrogen
b.
c.
d.
e.

III.

dan sumber karbon.

Tekanan osmosis harus isotonis
Derajat keasaman (pH) relatif netral
Temperatur inkubasi sekitar 37C
Sterilitas harus terjaga dengan mengerjakannya secara aseptis.

Alat dan Bahan

A. Alat
1. Kotak aseptis
2. Laminar Air Flow (LAF)
3. Tabung reaksi (12 buah)
4. Cawan petri (14 buah)
5. Gelas ukur 10 mL (1 buah)
6. Mikropipet dan blue tip
7. Vortex
B. Bahan
1. Sampel uji, berupa isi dari Calhaid kapsul
2. Pelarut ASA (Air Suling Agar) 0,05%

3. Media PCA (Plate Count Agar)

IV.

Cara Kerja
Ditimbang 1 gram sampel yang akan diperiksa, dicampur dengan 10 mL ASA 0,05%
Di-vortex campuran sampel dan larutan pengencer hingga homogen
Dilakukan pengenceran seri hingga 10-5, direplikasi sebanyak satu kali
Diambil sebanyak 1 mL sampel uji dari masing-masing tabung, dituangkan ke dalam cawan
petri yang telah ditandai untuk tiap konsentrasi dan seri pengenceran
Dicairkan media PCA, ditunggu hingga suhunya sekitar 40C
Dituang 10 mL media PCA cair ke dalam tiap-tiap cawan petri, dibiarkan memadat
Dibuat kontrol media dan kontrol pelarut
Diinkubasi petri selama 24 jam pada suhu 37C dalam posisi terbalik

Dihitung jumlah koloni bakteri yang tumbuh pada masing-masing cawan petri
V. Hasil Pengamatan

Gambar 1. Sampel uji dengan pengenceran 10-1 setelah diinkubasi selama 24 jam. Jumlah koloni pada
seri pengenceran pertama (kiri) adalah 120 dan pada seri pengenceran kedua (kanan) adalah 213.

Gambar 2. Sampel uji dengan pengenceran 10-2 setelah diinkubasi selama 24 jam. Jumlah koloni pada
seri pengenceran pertama (kiri) adalah 20 dan pada seri pengenceran kedua (kanan) adalah 17.

Gambar 3. Sampel uji dengan pengenceran 10-3 setelah diinkubasi selama 24 jam. Jumlah koloni pada
seri pengenceran pertama (kiri) adalah 87 dan pada seri pengenceran kedua (kanan) adalah 13.

Gambar 4. Sampel uji dengan pengenceran 10-4 setelah diinkubasi selama 24 jam. Jumlah koloni pada
seri pengenceran pertama (kiri) adalah 3 dan pada seri pengenceran kedua (kanan) adalah 0.

Gambar 5. Sampel uji dengan pengenceran 10-5 setelah diinkubasi selama 24 jam. Jumlah koloni pada
seri pengenceran pertama (kiri) adalah 1 dan pada seri pengenceran kedua (kanan) adalah 0.

Gambar 6. Kontrol media (kanan) dan kontrol pelarut (kiri) setelah diinkubasi selama jam. Kedua
kontrol bebas dari koloni bakteri.

Gambar 7. Larutan stok sampel uji (tidak diencerkan) setelah diinkubasi selama 24 jam. Jumlah koloni
pada seri pengenceran pertama (kiri) adalah 200 dan pada seri pengenceran kedua (kanan) adalah 277

Pengamatan dilakukan setelah sampel diinkubasi selama 1 x 24 jam pada suhu

37C. Data jumlah koloni yang tumbuh pada masing-masing konsentrasi sampel uji
dihimpun dalam tabel berikut ini.
Konsentras
i
10-1
10-2
10-3
10-4
10-5

Seri ke

Jumlah koloni

I
II
I
II
I
II
I
II
I
II

120
213
20
17
87
13
3
0
1
0

Memenuhi syarat perhitungan ALT?

Ya, karena > 30 dan < 120
Ya, karena > 30 dan < 120
Tidak, karena < 30
Tidak, karena < 30
Ya, karena > 30 dan < 120
Tidak, karena < 30
Tidak, karena < 30
Tidak, karena < 30
Tidak, karena < 30
Tidak, karena < 30

Pada tingkat pengenceran 10-1, kedua cawan petri menghasilkan jumlah koloni
antara 30-300. Untuk mendapatkan nilai ALT-nya, jumlah koloni rata-rata dari kedua
cawan petri dikalikan dengan faktor pengenceran. Perhitungannya adalah sebagai
berikut:
Ratarata jumlah koloni=

120+213 333
=
=166,5 koloni
2
2

1
1
166,5 1
faktor pengencer
10
=
=1665 CFU /mL
gram sampel
1

Jumlah koloni
ALT =

Berdasarkan data yang terdapat dalam tabel tersebut, sampel uji yang diperiksa
memiliki ALT lebih kecil daripada yang ditetapkan oleh Departemen Kesehatan
Republik Indonesia yaitu 106 CFU/mL, tidak melebihi ambang batas konsumsi.
VI. Pembahasan
Praktikum ini bertujuan untuk mengetahui keberadaan cemaran bakteri dalam sampel
yang diuji. Menurut Departemen Kesehatan Republik Indonesia, suatu sediaan dianggap
aman untuk dikonsumsi jika ALT-nya kurang dari 106 CFU/mL (Anonim, 1992).
Sampel yang diuji dalam praktikum kali ini adalah Calhaid kapsul produksi PT PJT Dr.
Sardjito, mengandung Ekstrak Sonchi Folium sebanyak 385 mg, Ekstrak Curcumae
Rhizoma sebanyak 100 mg dan Saccharum lactis (gula susu) sebanyak 15 mg tiap kapsul.
Metode yang digunakan untuk menentukan AKK-nya adalah pour plate, yaitu teknik
menumbuhkan bakteri dengan menambahkan suspensi bakteri dalam media kemudian
dipadatkan (Leboffe & Pierce, 2010).
Percobaan dilakukan secara aseptis; tahap pengenceran sampel uji dilakukan di dalam
kotak aseptis dan proses pencampuran sampel uji dengan media serta pembuatan kontrol
dilakukan dalam LAF (Laminar Air Flow), alat yang memiliki pola pengaturan dan
penyaring aliran udara untuk menciptakan area yang bebas mikroba; serta dilengkapi lampu
UV yang berfungsi sebagai germisida, dinyalakan selama 15-20 menit beberapa jam
sebelum digunakan, sehingga cocok untuk pekerjaan aseptis yang membutuhkan kondisi
steril (Nair, 2005). Digunakan kotak aseptis pada tahap pengenceran sampel karena saat
praktikum dilaksanakan LAF yang tersedia tengah digunakan oleh kelompok yang
mengerjakan percobaaan lain. Tangan praktikan serta peralatan yang digunakan disemprot
terlebih dahulu dengan alkohol sebelum masuk ke dalam kotak aseptis dan LAF, tujuannya
adalah mensterilkan segala hal yang masuk ke dalam kedua alat tersebut dari cemaran
mikroba untuk menghindari kontaminasi.
Langkah pertama adalah menimbang 1 gram sampel yang akan diuji, yaitu isi dari kapsul
Calhaid, kemudian dimasukkan ke dalam tabung reaksi berisi 10 mL larutan pengencer
ASA (Air Suling Agar 0,05%) dan di-vortex agar kedua bahan tersebut tercampur secara

homogen. Digunakan ASA 0,05% karena zat ini memiliki pH dan tekanan osmotik yang
sesuai dengan kondisi pertumbuhan bakteri. Campuran ini menjadi larutan stok.
Langkah selanjutnya adalah pengenceran seri yang bertujuan untuk memperkecil populasi
mikroba juga mempersempit area uji sehingga koloni bakteri yang dihasilkan tidak
bertumpuk dan mudah untuk diamati. Diambil 1 mL campuran dari tabung larutan stok, lalu
dipindahkan ke dalam tabung pertama sehingga konsentrasinya menjadi 10-1; selanjutnya
diambil 1 mL campuran dalam tabung reaksi pertama, lalu dipindahkan ke dalam tabung
kedua sehingga konsentrasinya menjadi 10-2; demikian seterusnya hingga diperoleh sampel
uji dengan konsentrasi 10-5. Prosedur ini direplikasi sebanyak satu kali sebagai pembanding.
Kemudian dari setiap tabung diambil 1 mL campuran dan dimasukkan ke dalam cawan petri.
Berikutnya dipanaskan media PCA (Plate Count Agar) yang berfungsi sebagai media
pertumbuhan bakteri hingga mencair. Media ini mengandung 5 g Tryptone, 2,5 g yeast
extract, 1 g dekstrosa (glukosa) dan 15 g agar per liter (Harley & Prescott, 2001).

Sebelum

ditambahkan dengan sampel yang berada dalam cawan petri, media yang telah mencair
tersebut didiamkan terlebih dahulu hingga suhunya mencapai 40C. Apabila terlalu panas
bakteri dapat mati sedangkan apabila terlalu dingin media akan memadat kembali.
Media cair PCA yang telah mencapai suhu 40C kemudian dituangkan ke dalam cawan
petri yang telah berisi sampel uji; setiap cawan petri diisi dengan 10 mL media cair PCA.
Selain itu dibuat kontrol media dengan menuangkan 10 mL media cair PCA pada cawan
petri tanpa penambahan apapun serta kontrol pelarut dengan meneteskan 1 mL pelarut ASA
lalu ditambahkan 10 mL media cair PCA. Fungsi kedua kontrol ini adalah mengetahui
apakah media dan pelarut yang digunakan telah terkontaminasi oleh bakteri atau tidak.
Selanjutnya cawan petri digoyangkan agar media merata dan homogen dengan sampel.
Setelah itu cawan petri ditutup dan direkatkan dengan selotip untuk menghindari masuknya
kontaminan. Seluruh cawan petri kemudian diinkubasi pada suhu 37C selama 24 jam;
suhu tersebut merupakan suhu optimum pertumbuhan bakteri dan rentang waktu 24 jam
diasumsikan cukup untuk perkembangbiakan bakteri, namun fungi tidak dapat tumbuh
optimal pada suhu tersebut sehingga penambahan bahan antifungi tidak diperlukan. Saat
inkubasi cawan petri diletakkan dalam kondisi terbalik agar air atau uap air yang terbentuk
akan menempel pada tutup cawan petri alih-alih di permukaan media; sebab permukaan
media yang terbasahi air akan mengganggu pertumbuhan koloni bakteri.
Berdasarkan hasil pengamatan, koloni tumbuh pada semua cawan petri yang berisi
sampel uji kecuali pada seri pengenceran kedua dengan konsentrasi 10-4 dan 10-5; sedangkan
kedua kontrol bersih dari pertumbuhan bakteri yang menunjukkan bahwa media dan pelarut
yang digunakan bebas dari kontaminan. Karena hanya sampel dengan konsentrasi
konsentrasi 10-1 yang kedua seri pengencerannya memiliki jumlah koloni dalam kisaran 30300, maka ALT ditentukan dengan merata-ratakan jumlah koloni dari kedua cawan petri

pada tingkat pengenceran tersebut lalu dikalikan dengan faktor pengencerannya. Diperoleh
nilai ALT sebesar 1665 CFU/mL, yang masih dibawah ambang batas aman konsumsi yang
telah ditetapkan oleh Departemen Kesehatan Republik Indonesia yaitu 10 6 CFU/mL
sehingga dapat disimpulkan bahwa sediaan ini aman untuk dikonsumsi.
VII. Kesimpulan
1. Percobaan ini dilakukan untuk mengetahui apakah sampel yang diuji tercemar bakteri
lebih dari ambang batas konsumsi yang telah ditetapkan oleh Departemen/Kementerian
Kesehatan Republik Indonesia yaitu 106 CFU/mL.
2. Angka Lempeng Total (ALT) dinyatakan sebagai jumlah koloni bakteri dikalikan faktor
pengenceran per bobot sampel dalam gram.
3. Metode penentuan ALT yang diaplikasikan dalam praktikum ini adalah metode pour
plate (teknik cawan tuang)
4. Sampel yang diuji memiliki nilai ALT sebesar 1665 CFU/mL, kurang dari 106 CFU/mL
sehingga sampel tersebut, yaitu Calhaid kapsul aman untuk dikonsumsi.
VIII. Daftar Pustaka
Anonim, 1992, Prosedur Operasional Baku Pengujian Mikrobiologi, Pusat Pemeriksaan
Obat dan Makanan Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan Departemen
Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta.
Harley, J.P. & Prescott, L.M., 2001, Laboratory Exercise in Microbiology, 5th ed.,
McGraw-Hill, New York.
Jawetz, E., Melnick, J.L., Adelberg, E.A., Brooks, G.F., Butel, J.S. & Ornston, L.N.,
1995, Mikrobiologi Kedokteran, edisi keduapuluh, diterjemahkan oleh Nugroho &
R.F. Maulany, EGC, Jakarta.
Leboffe, M.J. & Pierce, B.E., 2010, Microbiology: Laboratory Theory & Application, 3rd
ed., Morton Publishing, Colorado.
Nair, J., 2005, Comprehensive Biotechnology Class XII, Firewall Media, New Delhi.
Pratiwi, S.T., 2008, Buku Ajar Mikrobiologi Farmasi, Erlangga, Jakarta.
Yogyakarta, 26 Mei 2015
Praktikan,
1.
2.
3.

Annisa Nilamsari Utami

(10026) ()
Muhammad Faishal Mahdi (10029) ()
Cinantya Talia Paramita
(10035) ()