LAPORAN DEFINITIF ACARA ISOLASI PLASMID

PRAKTIKUM REKAYASA GENETIKA

NAMA

: Bagus Hendrawan

NIM

: B1J013184

KELOMPOK

:4

ROMBONGAN : II
ASISTEN

: Yani Yuliani

LABORATORIUM GENETIKA DAN BIOLOGI MOLEKULER

FAKULTAS BIOLOGI
UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN

ISOLASI PLASMID

Tujuan : Untuk mengisolasi DNA plasmid bakteri dan menduga konformasi DNA
plasmid bakteri
Kompetensi : Mahasiswa mampu melakukan isolasi DNA plasmid bakteri dan
mengetahui konformasi DNA plasmid bakteri

Telaah Pustaka :
Plasmid bakteri adalah elemen genetik yang mampu mereplikasi secara terpisah
dari kromosom inang. Selain untok mengkode mesin yang diperlukan untuk kontrol
replikasi mereka, plasmid juga sering menyandikan fungsi yang diperlukan untuk
pemeliharaan kestabilan dan pentransferan horisontal, serta berbagai sifat inang yang
menguntungkan seperti resistensi antibiotik, resistansi logam, virulensi dan aktivitas
katabolik mereka. Sekitar 50% dari sekuen plasmid sejauh ini dianggap mampu
melakukan mobilisasi diri atau selftransmisi oleh plasmid co yang berada di dalam sel.
Plasmid yang terfasilitasiakan melakukan adaptasi cepat dari bakteri ke lingkungan
yang berubah dengan melakukan mediasi transfer gen horisontal, seperti yang
dicontohkan oleh kenaikan mengejutkan dalam patogen multi resisten obat (Yano et al.,
2013).
Tidak semua makhluk hidup memiliki plasmid. Plasmid merupakan DNA
ekstrakromosomal yang memiliki bentuk sirkuler, oleh sebab itu plasmid sering disebut
juga dengan DNA sirkuler. Plasmid mudah disisipi oleh gen lain dan mampu bereplikasi
beberapa kali. DNA plasmid biasanya mempunyai ikatan lebih erat dibanding DNA
genom sehingga DNA genom lebih mudah didegradasi dibandingkan dengan DNA
Plasmid (Surzycki, 2000).
Plasmid sering digunakan sebagai vektor karena memiliki ukuran yang tidak
terlalu panjang dan mudah disisipi gen yang diinginkan, sehingga plasmid memudah
digunakan dalam teknik rekayasa genetika maupun segala sesuatu yang berhubungan
dengan biologi molekuler. Plasmid pada dasarnya memiliki 5 tipe konformasi utama,
yaitu linear, nicked, supercoiled, supercoiled denatured dan relaxed circular. Urutan

konformasi plasmid dari yang paling berat hingga yang paling ringan dapat diurutkan
sebagai berikut: nicked, linear, supercoiled denatured, relaxed circular, dan supercoiled.
(Lodish et al., 2000).
Menurut penelitian dari Sambrook et al. (1989), isolasi DNA plasmid dapat
dilakukan dengan menggunakan metode alkalin lisis. Metode ini menggunakan larutan
I, larutan II, dan larutan III. Larutan I atau solution I berisi senyawa glukosa, Tris dan
EDTA yang berfungsi untuk menjaga keutuhan DNA sel E.coli dengan membentuk
resuspensi buffer antara larutan dan bakteri E.coli. Glukosa pada solution I berfungsi
sebagai larutan isotonis yang menjaga tekanan osmotik pada sel E.coli. larutan EDTA
merupakan larutan yang menginaktivasi berbagai macam enzim yang dapat
membahayakan DNA. Larutan Tris berfungsi sebagai agen penyangga yang menjaga
pH. Komposisi dari solution II adalah larutan basa kuat NaOH dan SDS. NaOH
dijadikan sebagai komponen dalam solution II karena metode yang digunakan untuk
isolasi plasmid menggunakan alkalin lisis dan oleh sebab itu basa kuat digunakan
sebagai alat untuk denaturasi DNA. SDS 1% merupakan senyawa detergent dalam
solution II yang larut oleh fosfolipid sehingga senyawa ini berfungsi sebagai pelisis
dinding sel bakteri. Selain sebagai pelisis dinding sel bakteri larutan SDS juga berfungsi
untuk membersihkan DNA dari senyawa protein sehingga didapatkan plasmid dan DNA
genom yang bersih tanpa kontaminasi dari protein. Solution III disebut juga dengan
larutan netralisasi atau renaturasi. Larutan renaturasi berfungsi merenaturasi plasmid
menggunakan senyawa potasium asetat dan asam asetat glasial, larutan ini juga
berfungsi mengikat seluruh SDS dan mengubahnya menjadi senyawa KDS (Potasium
Dedoxil Sulfat). Komposisi dari solution III antara lain EtOH yang berfungsi sebagai
pememisah pelet dan plasmid sehingga plasmid dapat bersih tanpa adanya zat
kontaminan. EtOH yang mudah menguap akan memangkat plasmid karena supernatan.
Komposisi kedua dari solution III adalah TE yang berfungsi memangkat plasmid ke arah
supernatan. TE mengandung senyawa RNAse sehingga mampu memotong seluruh
RNA yang tersisa.
Menurut Elrod (2007), isolasi DNA plasmid terdiri atas lima tahap utama, yaitu
tahap isolasi sel, pelisisan dinding sel dan membran sel, purifikasi, presipitasi dan
pencucian. Tahapan isolasi sel merupakan tahap utama yang pertama kali digunakan

untuk mengisolasi sel yang akan digunakan. Tahap kedua yaitu tahap pelisisan dinding
dan membran sel dengan larutan pelisis sel sehingga membentuk ekstrak sel yang
terdiri atas jaringan, DNA kromosomal, DNA plasmid, serta RNA. Langkah berikutnya
adalah tahap purifikasi dengan serangkain perlakuan sehingga diperoleh DNA plasmid
yang murni. Tahap keempat adalah tahap presipitasi dimana DNA plasmid akan
diendapkan kembali dan isolat lain diluar plasmid akan dihilangkan.

Perlakuan

Bahan :
Bahan yang digunakan dalam praktikum kali ini adalah sampel kultur bakteri
E.coli umur 12 jam, media Luria-Bertani Broth, Solution I (Trisss, EDTA, glukosa),
Solution II (SDS, NaOH), Solution III (sodium asetat pH 5,5), Cloroform Isoamil Alkohol
(24:1), etanol absolut, etanol 70%, ddH 2O.

Alat :
Alat yang digunakan dalam praktikum kali ini adalah mesin sentrifugase,
mikropipet, freezer -200C dan tabung mikrosentrifugase.
Protokol :

1,5 ml bakteri masukkan ke tabung mikrosentrifugase, dan

sentrifugase 8000 rpm selama 3

Buang SN, pellet diresuspensi dengan 100 l Solution I. Tabung

divorteks, inkubasi diatas es 5

Tambahkan 200 l Solution II. Inversi kemudian inkubasi diatas

es 5

Tambahkan 150 l solution III, inversi kemudian inkubasi diatas

es 5

Sentrifugase 8000 rpm 10 suhu 40C, pindahkan SN ke tabung

mikrosentrifugase baru dengan menggunakan tip yang ujungnya
dipotong

Tambahkan CIAA 1:1, vortex 5 dan pindahkan lapisan atau

larutan dengan menggunakan tip yang ujungnya dipotong
secara hati-hati ke tabung mikrosentrifugase baru. Jangan
sampai lapisan bawah terambil

Tambahkan isopropanol 1 ml. Vortex lalu inkubasi di atas es 10

(800C)

Sentrifugase 11.0000 rpm 10 suhu 40C, buang SN

Pellet dicuci dengan etanol 70% 500 l Sentrifugase 11.000 rpm

suhu 40C 10 dan dikeringkan

Pellet ditambahkan ddH2O 50 l

Lampiran :

Daftar Pustaka
Elrod S. 2007. Genetika Edisi Keempat. Erlangga. Jakarta
Lodish H., Arnold B., Lawrence Z., Paul M., David B., James D. 2000. Molecular Cell
Biology. White Freeman Company. New York.
Sambrook J., Fritsch E.F., Maniati T. 1989. Molecular Cloning A Laboratory Manual.
Cold Spring Harbor Lab Press. USA.
Surzycki S. 2000. Basic Techniques in Molecular Biology. Springer. New York.
Yano H., Linda M.R., Molly G.K., Holger H., Kornelia S., Celeste J.B., dan Eva M.T.
2013. Host Range Diversification within the IncP-1 Plasmid Group. J.
Microbiology, 159(1): 23032315.