Nama

Desak Gede Dian Purnama Dewi

NIM

P07134014027

Semester

V (Lima)

Judul

TPHA (Treponema pallidum Hemagglutination Assay) Test

Hari, Tanggal :

Rabu, 14 September 2016

Tempat

Laboratorium Imunoserologi JAK Poltekkes Denpasar

I. TUJUAN
Untuk mendeteksi antibodi terhadap Treponema pallidum dalam serum atau
plasma pasien secara kualitatif dan semikuantitatif.
II. METODE
Hemagglutination Indirect test
III.PRINSIP
Berdasarkan rekasi aglutinasi antara sel darah merah burung angsa yang
diselimuti dengan komponen Treponema pallidum (Strain Nichols) sebagai antigen
terhadap serum atau plasma pasien sebagai antibodi.
IV. DASAR TEORI
Sifilis disebabkan oleh Treponema pallidum dari golongan spirochete anaerobik.
Penyakit ini dapat ditularkan melalui hubungan seksual dan tidak bertahan hidup di
luar inangnya. Treponema berbentuk spiral, langsing berukuran lebar kira kira 0,2
m, panjangnya antara 5-15 m dan tidak dapat di kultur secara in vitro. (Bala,
Manju, et al, 2012). T. pallidum dapat menembus melalui mukosa genital atau kulit
yang terkelupas, kemudian memasuki kelenjar getah bening dan aliran darah
selanjutnya akan menyebar ke berbagai organ (Zhan, Weihai, et al, 2012). Waktu
inkubasi dari penyakit ini bervariasi dari 3 sampai 90 hari yang gejala awalnya
ditandai dengan adanya lesi primer intrarektal, perianal, atau oral. Penyakit ini dibagi
menjadi tiga tahap, antara lain tahap primer, sekunder dan tersier (K Gupta, Sunil, et
al. 2012).
Tes serologis sifilis merupakan pembantu diagnosis yang penting bagi sifilis
terutama pada pasien asymptomatik. Tes serologis pada sifilis dapat dibagi menjadi
dua, yaitu treponemal tes dan non treponemal tes. Uji non treponemal adalah uji yang

mendeteksi antibodi IgG dan IgM terhadap materi-materi lipid yang dilepaskan dari
sel-sel rusak. Uji ini tidak langsung mendeteksi terhadap keberadaan Treponema
pallidum itu sendiri, oleh karena itu uji ini termasuk ke dalam uji non spesifik. Uji ini
akan menjadi negatif 1-4 minggu setelah pertama kali memberi hasil positif, seiring
dengan pemberian obat dan penyembuhan lesi sehingga hanya digunakan untuk
melihat keberhasilan pengobatan terhadap penyakit sifilis. Uji non-treponemal
meliputi VDRL (Venereal disease research laboratory), USR (unheated serum
reagin), RPR (rapid plasma reagin), dan TRUST (toluidine red unheated serum test)
(Zhu, Lin, et al, 2014).
Uji treponemal merupakan uji yang spesifik terhadap sifilis, karena mendeteksi
langsung antibodi terhadap antigen Treponema pallidum (R. Castro, Arnold, et al,
2011. Biasanya uji ini digunakan untuk mengkonfirmasi uji non-treponemal (non
spesifik) dan untuk menilai respon bakteri treponemal tersebut. Pada uji treponemal,
sebagai antigen digunakan bakteri treponemal atau ekstraknya, misalnya Treponema
Pallidum Hemagglutination Assay (TPHA), Treponema Pallidum Particle Assay
(TPPA), dan Treponema Pallidum Immunobilization (TPI). Walaupun pengobatan
secara dini diberikan, namun uji treponemal dapat memberi hasil positif seumur
hidup (Zhu, Lin, et al, 2014).
V. ALAT DAN BAHAN
a. Alat
1. Mikropipet dan Yellow tip
2. Mikroplate V
3. Beaker glass
4. Timer
b. Bahan
1. Serum atau plasma
2. Kontrol positif dan kontrol negatif
3. Kontrol cell
4. Test cell
5. Diluent
VI. CARA KERJA
Cara Kerja Kualitatif
1. Disiapkan alat, bahan dan reagen yang akan digunakan

2. Semua komponen pemeriksaan disuhu-kamarkan terlebih dahulu 30

menit
3. Sebelum itu, darah disentrifuge terlebih dahulu untuk mendapat serumya.
Spesimen Diluent
1. Diambil 190 l diluent pada tempat well.
2. Ditambahkan 10 l sampel ke dalam tempat well tersebut.
3. Kemudian dihomogenkan.
Tes :
1. Pipet 25 l specimen diluent yang dibuat ke test well dan kontrol
well.
2. Pipet 25 l kontrol positif dan kontrol negative ke kontrol positif well
dan kontrol negative well.
3. Tambahkan 75 l test cell ke test well, kontrol positif dan kontrol
negative dan 75 l kontrol test ke kontrol well (Masing-masing
campuran pada well dihomogenkan. Pengenceran sampel setelah
ditambahkan test sel adalah 1:80)
4. Inkubasi 15-300C selama 45-30 menit.
5. Dibaca hasilnya, bandingkan dengan kontrol negative dan kontrol
positif
NB : Jika hasilnya positif, maka harus dilakukan dengan uji
semikuantitatif untuk mengetahui titer TPHA pada sampel.
Cara Kerja Semikuantitatif:
1. Disiapkan alat, bahan dan reagen yang akan digunakan
2. Semua komponen pemeriksaan disuhu-kamarkan terlebih dahulu 30
menit
3. Sebelum itu, darah disentrifuge terlebih dahulu untuk mendapat serumya
Spesimen diluent:
1. Diambil 190 l diluent pada tempat well.
2. Ditambahkan 10 l sampel kedalam tempat well tersebut.
3. Kemudian dihomogenkan.
Titrasi:
1. Disiapkan sumus mikroplate dan diberi label no 1-8.
2. Untuk sumur 1 dikosongkan, sedangkan sumur 2-8 ditambahkan 25 l
diluent.
3. Untuk sumur 1 dan 2 ditambahkan 25 l sampel yang telah diencerkan
dengan diluent
4. Pipet 25 l campuran diluent spesiment ke sumur 3 lalu
dihomogenkan.

5. Ambil 25 l campuran dari sumur 3 ke sumur 4 dan seterusnya. Pada

sumur 8 dibuang 25 l campuran tersebut.
Test:
1. Ditambahkan 75 l test cell ke sumur 1-8.
2. Inkubasi 15-300C selama 45-30 menit.
3. Dibaca aglutinasi yang terbentuk dan tentukan titer yang masih

memberikan hasil positif pada pengenceran tertinggi.

VII.

INTERPRETASI HASIL
Kualitatif
Reaksi positif ditunjukkan dengan hemaglutinasi sel
Reaksi negatif ditunjukkan dengan adanya pengendapan sel pada dasar
sumur seperti titik.

(Negatif)

(Positif)

Semikuantitatif
Reaksi positif ditunjukkan dengan hemaglutinasi sel
Reaksi negatif ditunjukkan dengan adanya pengendapan sel pada dasar

sumur seperti titik.

Gambar hasil yang masih menunjukkan hasil positif :

Gambar hasil yang menunjukan hasil +/-

Berikut ini ilustrasi dari hasil semi kuantitatif:

+/-

Titer : pengenceran terakhir yang masih menunjukkan hemaglutinasi.

VIII. HASIL PENGAMATAN

Identitas sampel
Kode sampel : TP

(Mikroplate U)

(Sampel serum pasien)

(Kontrol +)

(Kontrol -)

(Kontrol sel)

(Test sel)

Hasil Uji Kualitatif

Hasil uji sampel TP adalah negatif yang ditandai dengan adanya

pengendapan eritrosit berupa titi di dasar sumur.

Sampel

Kontrol sel

Kontrol

Hasil : (-)

negatif

Test sel
Hasil : (-)
Hasil Ujidiluents
Semikuantitatif

Kontrol
positif

Hasil positif berturut

turut dengan t titer
Hasil negatif berturut
1/80, 1/160, 1/320, dan
turut dengan t titer
1/640. Dimana titer
1/1280, 1/2560, 1/5120,
IX. PEMBAHASAN
tertingginyapallidum
adalah dari golongan spirochete
dan 1/10240.
Sifilis disebabkan oleh Treponema
anaerobik.
1/640
Penyakit ini dapat ditularkan melalui hubungan seksual dan tidak bertahan hidup di
luar inangnya. Treponema berbentuk spiral, langsing berukuran lebar kira kira 0,2
m, panjangnya antara 5-15 m dan tidak dapat di kultur secara in vitro (Bala,
Manju, et al, 2012). Tahap inkubasi dibagi menjadi tiga, tahap primer ditandai dengan
timbulnya chancre di tempat inokulasi. Tahap sekunder ditandai dengan ruam
polimorfik, limfadenopati dan manifestasi sistemik lainnya. Tahap tersier adalah
tahap yang paling merusak dan ditandai dengan adanya gejala gangguan
kardiovaskular dan neurologis (K Gupta, Sunil, et al. 2012).
TPHA adalah uji treponemal yang berfungsi untuk mendeteksi adanya antibodi
spesifik Triponema pallidum dalam serum atau plasma pasien guna membantu

menegakkan diagnosis laboratorium terhadap indikasi penyakit sifilis. Antibodi

Treponemal dapat terdeteksi seumur hidup sedangkan antibodi non treponemal akan
hilang setelah masa pengobatan. Sedangkan kelemahan dari uji TPHA ini adalah
dapat menimbulkan reaksi negatif palsu apabila spesimen yang diperiksa dalam fase
sekunder (Bala, Manju, et al, 2012). Metode yang digunakan dalam pemeriksaan
sifilis yaitu metode hemaglutinasi tidak langsung (Insert kit, 2014). Prinsip dari
pemeriksaan TPHA adalah rekasi aglutinasi antara sel darah merah burung angsa
yang diselimuti dengan komponen Treponema pallidum (Strain Nichols) sebagai
antigen terhadap serum atau plasma pasien sebagai antibodi (Insert kit, 2014).
Pada praktikum kali ini uji TPHA dilakukan secara kualitatif dan semikuantitatif.
Uji kualitatif dilakukan dengan cara menambahkan sampel yang telah diencerkan ke
dalam sumur sebanyak 25 mikron dan tes sel sebanyak 75 mikron, kedua campuran
tersebut dihomogenkan dan diinkubasi pada suhu selama 45 60 menit agar antigen
dan antibodi dapat berikatan secara optimal. Pada saat proses inkubasi berlangsung,
sampel diletakkan pada tempat yang datar dan terhindar dari getaran. Uji kualitatif
bertujuan untuk mendeteksi ada atau tidaknya antibodi spesifik terhadap Treponema
pallidum, hasil positif ditandai dengan terbentuknya hemaglutinasi pada sumur dan
jika negatif ditandai dengan adanya pengendapan sel pada dasar sumur seperti titik.
Hasil yang didapat dibandingkan dengan kontrol positif dan negatif dimana kontrol
negatif yang sudah ditambahkan tes sel harus memberikan hasil negatif sedangkan
kontrol positif yang sudah ditambahkan test sel harus memberikan hasil positif dan
pada uji semikuantitatif harus menunjukkan titer 640 2560 (Insert kit, 2014).
Metode semikuantitatif dilakukan dengan pengenceran berseri pada sumur dan
menggunakan 8 sumur, dimana sumur 2 8 diisi 25 mikron diluents, lalu
ditambahkan 25 mikron sampel yang telah diencerkan pada sumur 1 dan 2, melalui
sumur 2 diambil 25 mikron sampel dan dimasukkan ke dalam sumur 3, kemudian
dilakukan pengenceran bersehi hingga mencapai sumur ke-8. Pada sumur 8 sampel
diambil 25 mikron untuk dibuang, setelah itu lakukan proses inkubasi seperti pada
metode kualitatif (Insert kit, 2014). Uji semikuantitatif bertujuan untuk melihat kadar
atau titer antibodi yang terbentuk di dalam tubuh.

Pada praktikum ini, pemeriksaan TPHA menggunakan reagen kit dengan merk
healthcare. Dimana dalam satu kit reagen berisi tes sel yang mengandung awetan
eritrosit ayam yang dilapisi dengan antigen Triponema pallidum, kontrol sel
mengandung awetan eritrosit ayam yang tidak dilapisi antigen Triponema pallidum,
diluents yang mengandung larutan garam dengan penyerap absorban, kontrol positif
mengandung serum manusia dengan titer 1280, dan kontrol negatif mengandung
serum manusia dengan titer <80.
Reagen TPHA disimpan pada suhu 2 8oC dalam posisi tegak lurus. Sebelum
digunakan letakkan reagen pada suhu ruang dan perhatikan tanggal kadaluarsa reagen
karena penggunaan reagen yang kadaluarsa akan memberikan interpretasi hasil yang
salah (Insert kit, 2014). Sensitivitas dari reagen ini adalah 99,5% sedangkan
spesifisitasnya adalah 100%. Menurut Miguel Marino (2013), sensitivitas adalah
proporsi orang yang benar sakit dalam populasi yang juga diidentifikasi sebagai orang
sakit oleh tes penapisan sedangkan spesifisitas adalah proporsi orang yang benar
benar tidak sakit dan tidak sakit pula saat diidentifikasi dengan tes penapisan. Jadi,
reagen TPHA merk Healthcare mampu mendeteksi orang yang benar-benar terinfeksi
sifilis sebesar 99,5%, sedangkan kemampuan reagen ini dalam mendeteksi orang
yang benar benar tidak terinfeksi adalah 100%.
Reagen ini dapat mendeteksi antibodi anti-treponemal hingga batas terendah yaitu
0,05 IU/ml yang telah diuji oleh First International Standard serum (NIBSC,
London,UK). Sedangkan sampel yang digunakan dalam pemeriksaan TPHA dapat
berupa serum ataupun plasma harus terbebas dari bakteri kontaminan. Sampel dapat
disimpan pada suhu 2 8o

C apabila tidak segera diperiksa dan dapat disimpan

lebih lama lagi pada suhu -20oC (Insert kit, 2014).

Berdasarkan praktikum yang telah dilakukan, hasil uji TPHA pada serum pasien
dengan kode TP menunjukkan hasil negatif pada uji kualitatif ditandai dengan
adanya pengendapan eritrosit pada dasar sumur berupa titik setelah melalui proses
inkubasi pada suhu ruang selama 60 menit. Hal tersebut menunjukkan bahwa di
dalam sampel serum pasien tidak terdapat antibodi spesifik terhadap Treponema
pallidum oleh karena itu sampel tersebut tidak dilakukan uji secara semikuantitatif.
Namun pada praktikum kali ini uji semikuantitatif dilakukan dengan menggunakan

kontrol positif sebagai sampel yang bertujuan untuk melihat titer yang terbentuk.
Hasil titer yang didapat pada uji semikuantitatif menggunakan kontrol positif adalah 1
: 640. Menurut Narinder Kaur Naidu (2012), selain dengan menggunakan uji TPHA
untuk mendeteksi antibodi spesifik, uji lain yang dapat digunakan adalah ELISA.
Keuntungan dari ELISA adalah kemampuan untuk memproses sejumlah besar sampel
dan kemampuan untuk dibaca pada spektrofotometer.
X. SIMPULAN
Berdasarkan hasil praktikum pemeriksaan TPHA pada serum pasien dengan kode
TP diperoleh hasil negatif. Hal tersebut mengindikasikan bahwa dalam sampel
serum pasien tidak terdapat antibodi spesifik terhadap Treponema pallidum sebagai
penanda penyakit sifilis.

DAFTAR PUSTAKA
Bala, Manju, et al. 2012. Evaluation of the usefulness of Treponema pallidum
hemagglutination test in the diagnosis of syphilis in weak reactive
Venereal Disease Research Laboratory sera. [online]. Tersedia :
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3505284/. [diakses :
19 September 2016, 18.05 wita]
Insert Kit. 2014. TPHA Test Kit. United Kingdom : Healthcare Ltd
K Gupta, Sunil, et al. 2012. Syphilis D Emblee. [online]. Tersedia :
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3401849/. [diakses : 19
September 2016, 19.42 wita]
Marino, Miguel, et al. 2013. Measuring Sleep: Accuracy, Sensitivity, and Specificity
of Wrist Actigraphy Compared to Polysomnography. [online]. Tersedia
: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3792393/. [diakses :
19 September 2016, 20.36 wita]
Naidu, Narinder Kaur, et al. 2012. Comparative study of Treponemal and nonTreponemal test for screening of blood donated at a blood center.
[online]. Tersedia :
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3353627/. [diakses :
19 September 2016, 20.05 wita]
Zhan, Weihai, et al. 2012. Concurrent Sexual Partnerships and Sexually Transmitted
Diseases in Russia. [online]. Tersedia :
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3151331/. [diakses :
19 September 2016, 15.08 wita]
Zhu, Lin, et al. 2014. Comparison of the Cerebrospinal Fluid (CSF) Toluidine Red
Unheated Serum Test and the CSF Rapid Plasma Reagin Test with the

CSF Venereal Disease Research Laboratory Test for Diagnosis of

Neurosyphilis among HIV-Negative Syphilis Patients in China.
[online]. Tersedia :
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3957747/. [diakses :
19 September 2016, 16.07 wita]