BAB I

PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan
sifat-sifat yang khas, begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir
tidak berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut
disuspensikan. Salah satu cara untuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga
mudah untuk diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan.
Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu
mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecatan.
Bakteri tahan asam (BTA) merupakan bakteri yang memiliki ciri-ciri yaitu
berantai karbon (C) yang panjangnya 8 - 95 dan memiliki dinding sel yang
tebal yang terdiri dari lapisan lilin dan asam lemak mikolat, lipid yang ada
bisa mencapai 60% dari berat dinding sel. Bakteri yang termasuk BTA antara
lain Mycobacterium tuberculose, Mycobacterium bovis, Mycobacterium
leprae, Nocandia meningitidis, dan Nocandia gonorrhoeae. Mycobacterium
tuberculose adalah bakteri patogen yang dapat menyebabkan penyakit
tuberculose, dan bersifat tahan asam sehingga digolongkan sebagai bakteri
tahan asam (BTA). Penularan Mycobacterium tuberculose terjadi melalui
jalan pernafasan (Syahrurachman, 1994).
Pewarnaan Ziehl Neelson atau pewarnaan tahan asam memilahkan
kelompok Mycobacterium dan Nocandia dengan bakteri lainnya. Kelompok
bakteri ini disebut bakteri tahan asam karena dapat mempertahankan zat
warna pertama (carbol fuchsin) sewaktu dicuci dengan larutan pemucat
(alkohol asam). Larutan asam terlihat berwarna merah, sebaliknya pada
bakteri yang tidak tahan asam karena larutan pemucat (alkohol asam) akan
melakukan reaksi dengan carbol fuchsin dengan cepat, sehingga sel bakteri
tidak berwarna (Lay, 1994).
Dinding bakteri yang tahan asam mempunyai lapisan lilin dan lemak yang
sukar ditembus cat. Oleh karena pengaruh fenol dan pemanasan maka lapisan

Laporan Praktikum Bakteriologi

Page 1

lilin dan lemak itu dapat ditembus cat basic fuchsin. Pada waktu pencucian
lapisan lilin dan lemak yang terbuka akan merapat kembali. Pada pencucian
dengan asam alkohol warna fuchsin tidak dilepas. Sedangkan pada bakteri
tidak tahan asam akan luntur dan mengambil warna biru dari methylen blue.
Sebagai tenaga analis kesehatan dibutuhkan keterampilan dalam membuat
spesimen yang berguna dalam pemeriksaan spesimen di laboratorium. Bakteri
umumnya memiliki warna yang transparan maka dari itu diperlukan
pewarnaan bakteri agar bentuk dan struktur bakteri dapat terlihat lebih jelas
jika diamati dengan mikroskop cahaya. Hal tersebut yang melatarbelakangi
penulis untuk mengangkat permasalahan ini sebagai masalah yang akan
dibahas dalam laporan praktikum dengan judul Pewarnaan Bakteri Tahan
Asam (BTA) .
B. Maksud praktikum
Maksud dari praktikum ini adalah agar mahasiswa:

Mengetahui tekhnik pewarnaan BTA metode Ziehl-Neelsen

Mengetahui bentuk-bentuk (morfologi) dan sifat BTA

C. Tujuan praktikum
Tujuan dari praktikum ini adalah

Membuat sediaan untuk pewarnaan BTA

Melakukan pengecetan/pewarnaan BTA
Mengedentifikasi bentuk-bentuk (morfologi) dan sifat BTA pada
preparat yang telah dibuat.

Laporan Praktikum Bakteriologi

Page 2

BAB II
LANDASAN TEORI
Pewarnaan diferensial artinya pewarnaan yang menggunakan lebih dari
satu macam zat warna, seperti pewarnaan gram dan pewarnaan tahan asam.
Sedangkan pewarnaan khusus artinya pewarnaan yang dipakai untuk mewarnai
bagian-bagian sel atau bakteri tertentu yang sukar diwarnai dengan menggunakan
pewarnaan biasa. Pewarnaan khusus dipakai untuk mewarnai bagian-bagian sel
kuman atau kuman tertentu yang sukar diwarnai (Noverita, 2009).
Bakteri tahan asam merupakan bakteri yang kandungan lemaknya sangat
tebal sehingga tidak bisa diwarnai dengan reaksi pewarnaan biasa, tetapi harus
dengan pewarnaan tahan asam. Kelompok bakteri ini disebut bakteri tahan asam
(BTA) karena dapat mempertahankan zat warna pertama sewaktu dicuci dengan
larutan pemucat. Golongan bakteri ini biasanya bersifat patogen pada manusia
contohnya

adalah Mycobacterium

tuberculosis dapat

diisolasi

dari

tuberculosis.
sputum

Bakteri

penderita

TBC.

Mycobacterium
Reaksi

hasil

pewarnaannya jika positif terdapat bakteri TBC berwarna merah. Selain

menyerang manusia juga menyerang hewan seperti marmut, dan kera.
Penularannya dapat melalui udara yang masuk ke saluran pernafasan (Pelczar dan
Chan, 1988).
Bakteri tahan asam adalah jenis bakteri yang tidak dapat diwarnai dengan
pewarnaan anilin biasa kecuali dengan menggunakan fenol dan dengan
pemanasan. Bakteri ini memilki dinding sel berlilin karena mengandung sejumlah
besar materi lipoidal oleh karena itu bakteri ini hanya dapat diwarnai dengan
pewarnaan BTA (Acid-Fast Stain). Dinding sel hidrofobik dan impermeabel
terhadap pewarnaan dan bahan kimia lain pada cairan atau larutan encer. Ketika
proses pewarnaan, bakteri tahan asam ini melawan dekolorisasi dengan asam
sehingga bakteri tersebut disebut bakteri tahan asam (Ball, 1997).
Mycobacterium tuberculosis berbentuk batang langsing, lurus atau
berbentuk filament. Bakteri ini bersifat aerobik, tidak membentuk spora, non

Laporan Praktikum Bakteriologi

Page 3

motil, tahan asam, dan merupakan bakteri gram positif. Namun, sekali
mycobacteria diberi warna oleh pewarnaan gram, maka warna tersebut tidak dapat
dihilangkan dengan asam. Oleh karena itu, maka mycobacteria disebut sebagai
Basil Tahan Asam atau BTA. Beberapa mikroorganisme lain yang juga memiliki
sifat tahan asam, yaitu spesies Nocardia, Rhodococcus, Legionella micdadei, dan
protozoa Isospora dan Cryptosporidium. Pada dinding sel mycobacteria, lemak
berhubungan dengan arabinogalaktan dan peptidoglikan di bawahnya. Struktur ini
menurunkan permeabilitas dinding sel, sehingga mengurangi efektivitas dari
antibiotik. Lipoarabinomannan adalah suatu molekul lain dalam dinding sel
mycobacteria, berperan dalam interaksi antara inang dan patogen, menjadikan M.
tuberculosis dapat bertahan hidup di dalam makrofaga. Mikobakteria dapat
tumbuh lebih cepat pada pH 6 dan 8 dengan pH optimum sekitar 6.5 - 6.8 untuk
tipe pathogen. Sel mikobakteria terdiri dari tiga lapisan penting yaitu lipid,
protein, dan polisakarida (Thomas, 1999).
Mycobacterium tuberculosis termasuk gram positif, berbentuk batang
panjang atau pendek, tidak berspora, tidak berkapsul, pertumbuhan sangat lambat
(2-8 minggu), suhu optimal 37-380C yang merupakan suhu normal manusia.
Pertumbuhannya membutuhkan tambahan makanan seperti darah, egg yolk,
serum, dan bahan kimia tertentu. Dalam jaringan, basil tuberkel adalah bakteri
batang lurus dengan ukuran sekitar 0,4 3 m. Pada media buatan, bentuk kokoid
dan filamentous tampak bervariasi dari satu spesies ke spesies lain. Segera setelah
diwarnai dengan pencelupan dasar mereka tidak dapat didekolorisasi oleh alkohol,
tanpa memperhatikan pengobatan dengan iodine. Basil tuberkel secara umum
dapat diwarnai dengan pewarnaan Ziehl-Neelsen. Media untuk membiakan
mikobakteria adalah media nonselektif dan media selektif. Media selektif
berisi antibiotik untuk mencegah pertumbuhan kontaminan bakteri dan fungi
yang berlebihan. Ada tiga formulasi umum yang dapat digunakan untuk kedua
media nonselektif dan selektif, yaitu media agar semisintetik (middlebrook 7H10
dan 7H11), media telur inspisasi (Lowenstein-jensen), media kaldu (broth media)
(Jawetz et al., 2001).

Laporan Praktikum Bakteriologi

Page 4

Mikobakteria merupakan aerobik obligat yang memperoleh energi dari

oksidasi

beberapa

senyawa

sederhana.

Penambahan

CO2 meningkatkan

pertumbuhan. Tidak ada aktivitas biokimia yang menandai. Dan kecepatan

pertumbuhan lebih rendah dari pada sebagian besar bakteri. Waktu untuk
menggandakan basil tuberkel sekitar 18 jam, bentuk saprofit cenderung tumbuh
lebih cepat, poliferasi terjadi pada temperatur 22-23C, untuk menghasilkan
pigmen yang lebih banyak dan mengurangi bentuk cepat asam daripada bentuk
patogenik. Mikobakteria cenderung lebih resisten terhadap agen kimia daripada
bakteri lain karena sifat hidrofobik permukaan sel dan pertumbuhannya. Basil
tuberkel reisten terhadap kekeringan dan bertahan hidup selama periode waktu
yang lama dalam sputum kering. Variasi dapat terjadi dalam koloni, pigmentasi,
virulensi, temperatur petumbuhan yang optimal dan beberapa tanda pertumbuhan
atau seluler lainnya (Fardiaz, 1992).
Bakteri tahan asam dapat diamati dengan teknik pewarnaan Ziehl Neelson,
Kinyoun Gabber, dan Fluorochrom. Pengambilan sputum (sekret paru-paru atau
ludah) untuk analisis tuberculosis dapat dilakukan setiap saat dikenal ada 3 jenis
sputum:
Sputum pagi

: sputum yang dikeluarkan oleh penderita pada saat bangun

pagi.
Spot sputum

: sputum yang dikeluarkan pada saat itu.

Collection sputum

: sputum yang keluar dan ditampung selama 24 jam

Sputum yang telah diperoleh dapat disimpan dalam lemari es selama satu
minggu.
Teknik pewarnaan Ziehl-Neelsen, yaitu dengan menggunakan zat
warna carbol fuchsin 0,3 %, asam alkohol 3 %, dan methylen blue 0,3%. Pada
pemberian

warna

pertama,

yaitu carbol

fuchsin,

BTA

bersifat

mempertahankannya. Carbol fuchsinmerupakan fuksin basa yang dilarutkan

dalam larutan fenol 5 %. Larutan ini memberikan warna merah pada sediaan
dahak. Fenol digunakan sebagai pelarut untuk membantu pemasukan zat warna ke
dalam sel bakteri sewaktu proses pemanasan. Fungsi pemanasan untuk
melebarkan pori-pori lemak BTA sehingga carbol fuchsin dapat masuk sewaktu

Laporan Praktikum Bakteriologi

Page 5

BTA dicuci dengan larutan pemucat, yaitu asam alkohol, maka zat warna pertama
tidak mudah dilunturkan. Bakteri kemudian dicuci dengan air mengalir untuk
menutup pori-pori dan menghentikan pemucatan. BTA akan terlihat berwarna
merah, sedangkan bakteri yang tidak tahan asam akan melarutkan carbol
fuchsin dengan cepat sehingga sel bakteri tidak berwarna. Setelah penambahan zat
warna kedua yaitu methylen blue, bakteri tidak tahan asam akan berwarna biru
(Lay, 1994).
Menurut Entjang (2003), pada pewarnaan bakteri dengan metode ZiehlNeelsendapat menggolongkan bakteri menjadi dua, yaitu :
1.

Bakteri yang berwarna merah dengan pewarnaan Ziehl-Neelsen disebut

bakteri tahan asam (acid fast).

2.

Bakteri yang berwarna biru dengan pewarnaan Ziehl-Neelsen disebut bakteri

tidak tahan asam (non acid fast).

Metode Ziehl-Neelsen digunakan karena cukup sederhana dan mempunyai
sensitivitas serta spesifitas yang cukup tinggi. Spesifitas dan sensitivitas yang
tinggi sebenarnya dimiliki oleh metode fluorokrom. Bakteri yang terwarnai
menunjukkan warna yang kontras dengan lingkungannya dan tidak membutuhkan
perbesaran sampai 1000x sehingga bisa mempercepat waktu. Akan tetapi, alat
yang digunakan tidak ada yaitu mikroskop fluorescens (Kurniawati et al., 2005).
Larutan

kimia

yang

digunakan

adalah

alkohol asam

3% , carbol

fuchsin 0,3%, serta methylen blue 0,3% yang masing-masing mempunyai fungsi
antara lain asam alkohol digunakan sebagai peluntur, carbol fuchsin mempunyai
fungsi membuka lapisan lilin agar menjadi lunak sehingga cat dapat menembus
masuk ke dalam sel bakteri M. tuberculosis. Methylen blue berfungsi sebagai cat
lawan dan pada pemberian methylen blue pada bakteri akan tetap berwarna merah
dengan latar belakang biru atau hijau (Jutono dkk., 1980).

Negatif: apabila tidak ditemukan BTA.

Positif: apabila terdapat 1 9 BTA / 100 lapang pandang.
Positif 1: apabila terdapat 10 90 BTA / 100 lapang pandang.
Positif 2: apabila terdapat 1 9 BTA / 1 lapang pandang.
Positif 3: apabila terdapat > 10 BTA / 1 lapang pandang
BAB III

Laporan Praktikum Bakteriologi

Page 6

METODE KERJA
A. Alat dan Bahan
Metode Ziehl-Neelsen
ALAT

BAHAN

REAGEN

Ose

Sputum positif

Carbol fuchsin 1%

Lampu spritus

Minyak imersi

Asam alcohol 5%

Aquades/air kran

Methylen blue/asam

Objek gelas
Mikroskop

pikrat

Tissu
Pipet tetes
Metode Kinyoun-Gabbet
ALAT

BAHAN

REAGEN

Ose

Sputum positif

Larutan Kinyoun

Lampu spritus

Minyak imersi

Larutan Gabbet

Objek gelas

Aquades/air kran

Mikroskop
Tissu
Pipet tetes

B. Prosedur Kerja
Metode Ziehl-Neelsen
1)
2)
3)
4)
5)
6)
7)
8)
9)

Disiapkan alat dan bahan

Dibersihkan objek gelas hingga bebas lemak
Jika perlu, ditulis kode atau nama bakteri pada sudut objek gelas
Digenangi larutan carbol fuchsin pada sediaan yang telah difiksasi
Panaskna sampai menguap selama 5 menit
Pewarna dibuang dan ditetesi asam alcohol selama 1-2 detik
Dicuci dengan air mengalir
Ditambahkan methylen blue kurang lebih 1 menit
Dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan

10) Diperiksa di bawah mikroskop dengan menggunakan minyak

imersi.

Laporan Praktikum Bakteriologi

Page 7

 Metode Kinyoun-Gabbet
1) Disiapkan alat dan bahan
2) Dibersihkan objek gelas hingga bebas lemak
3) Jika perlu, ditulis kode atau nama bakteri pada sudut objek gelas
4) Dituangkan larutan Kinyoun selama 3 menit pada sediaan yang
telah difiksasi
5) Dicuci dengan air mengalir selama 30 detik
6) Diuangkan larutan Gabbet selama 1 menit
7) Dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan di udara
8) Diperiksa di bawah mikroskop dengan menggunakan minyak
imersi.

BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Hasil
Metode Ziehl-Neelsen

Laporan Praktikum Bakteriologi

Page 8

Gambar di atas merupakan hasil pewarnaan basil tahan asam (BTA) metode
Ziehl-Neelsen yang dilihat di bawah mikroskop dengan pembesaran 100x.
Bakteri tahan asam tampak berbentik basil warna merah sedangkan bakteri
yang tidak tahan asam berwarna biru.
Metode Kinyoun Gabbet

Gambar di atas merupakan hasil pewarnaan basil tahan asam (BTA) metode
Kinyoun-Gabbet yang dilihat di bawah mikroskop dengan pembesaran 100x.
Bakteri tahan asam tampak berbentik basil warna merah sedangkan bakteri
yang tidak tahan asam berwarna biru.

B. Pembahasan
1. Menurut Ziehl Neelsen
Bakteri genus mycobacterium dan beberapa spesies nocardia pada dinding
selnya mengandung banyak zat lipoid (lemak) sehingga bersifat permiable
dengan pewarnaan biasa. Bakteri tersebut bersifat tahan asam (+) terhadapa
pewarnaan tahan asam. Pewarnaan tahan asam dapat digunakan untuk
membantu menegakkan diagnosa tuberkulosis. Pewarnaan tahan asam
Laporan Praktikum Bakteriologi

Page 9

menggunakan larutan ziehl-Neelsen A (cat karbol fuchsin), Ziehl-Neelsen B

(alkohol asam :HCL 3% dalam metanol 95%) dan ziehl neelsen C (cat biru
metilen). Hasil pewarnaan maka bakteri tahan asam akan berwarna merah dan
bakteri tidak tahan asam akan berwarna biru.
Adapun kelemahan dan kelebihan Ziehl Neelsen yakni: latar belakang
berwarna biru terang, basil merah jelas, reagen terjangkau dan mudah didapat,
fenol diencerkan 5% dan tidak dipanaskan karena pemanasan dilakukan pada
proses pewarnaan sedian zat warna utama maka dari itu agak lama waktu
yang dibutuhkan.
2. Menurut Kinyoun Gabbet
Dinding bakteri yang tahan asam mempunyai lapisan lilin dan lemak
yang sukar ditembus cat. Oleh karena pengaruh fenol dan kadar cat yang
tinggi maka lapisan lilin dan lemak itu dapat ditembus cat basic fuchsin. Pada
waktu pencucian lapisan lilin dan lemak yang terbuka akan merapat kembali.
Pada pencucian dengan asam alkohol warna fuchsin tidak dilepas. Sedangkan
pada bakteri tidak tahan asam akan luntur dan mengambil warna biru dari
methylen blue.
Kelemahan dan Kelebihan Pewarnaan Kinyoun-Gabbet antara lain
adalah: latar belakang berwarna ungu dan buram, basil kurang merah, lekosit
ungu, reagen jarang dijumpai karena itu mahal harganya, komposisi dari fenol
kristal/bubuk murni dan pada saat pembuatan reagen sebelum proses
homogenisasi zat warna primer denagn carbol fuchsin dipanaskan/dilelehkan
pada penangas atau autoclaf, dan terakhir pada proses pewarnaan lebih
mudah, cepat dan praktis.
BAB V
PENUTUP

A. Kesimpulan
Pewarnaan BTA merupakan pewarnaan yang dilakukan untuk
mengidentifikasi Bakteri Tahan Asam. Pewarnaan ini tidak spesifik untuk
Laporan Praktikum Bakteriologi

Page 10

Mycobacterium tuberculosis karena hasil pewarnaan BTA juga akan positif

terhadap genus Mycobacterium lain.
Hal-hal yang perlu diperhatikan dalam proses pengecatan BTA adalah
pada saat dekolorisasi dengan asam alkohol dimana pemberian asam alkohol
jangan sampai berlebih karena akan menyebabkan overdekolorization
sehingga sel BTA hampir sama dengan Non BTA yang menyebabkan sulit
membedakannya, tetapi jangan juga terlalu sedikit dalam memberikan alkohol
(underdecolorization) karena tidak akan melunturkan warna secara sempurna
sehingga sel Non BTA bisa saja berwrna ungu mendekati warna sel BTA.
Saat pemanasan juga tidak boleh sampai mendidih karena akan menyebabkan
sel bakteri lisis.
Faktor-faktor yang memberikan perbedaan antara bakteri BTA dan
non BTA adalah pada komponen dinding selnya.
B. Saran
Adapun sehubungan dengan praktikum ini, khususnya ditujukan bagi
mahasiswa yaitu:
o Diharapkan bagi seluruh mahasiswa agar selama kegiatan
praktikum ini berlangsung, Mahasiswa harus menggunakan APD
(Alat Pelindung Diri).
o Diharapkan pula bagi semua mahasiswa, bahwa selama kegiatan
praktikum ini berlangsung, agar semua mahasiswa bersungguhsungguh dalam melakukan praktikum.
DAFTAR PUSTAKA
http://israyantianur.blogspot.com/2013/05/pewarnaan-bta-ziehl-neelson.html
http://erlinpurnamasari.blogspot.com/2013/06/pewarnaan-bta-metode-zn.html
http://aiiudewa.blogspot.com/2013/12/laporan-bakteri-tahan-asam.html
www.googleimage.pewarnaanbta.com

Laporan Praktikum Bakteriologi

Page 11