PENDAHULUAN

KROMATOGRAFI

Oleh :
osfarsjofjan@yahoo.co.id.

Animal Nutrition and Feed

Animal Husbandry Faculty, Brawijaya
University.
1

Menurut Willard et at, (1989), pembagian kromatografi dapat dibuat bagan sebagai
berikut:

Kromatografi

Kromatografi gas
Gas-cair
(GLC)
LSC

Kromatografi Cair

Gas padat
(GSC)

Cair-cair
LLC

Cair-padat

Eksklusif

Penukar ion
EC
Fase terikat

IEC

Pasangan ion

 Pembagian diatas berdasar jenis fase,

ialah cair dan gas,
Pembagaian kedua : penukar ion dan
eklusif serta pasangan ion hanya
mengetengahkan salah satu fase diam,
Willard : kedua kromatografi penukar ion
dan eklusif merupakan kromatografi yang
berdasar pada interaksi antara linarut
dan fase diam.
Berdasarkan kesetimbangan yang terjadi
dibedakan menjadi 2 ialah: adsorbsi,
dan partisi yang dapat terjadi baik dalam
kromatografi gas maupun kromatografi
cair.
3

Berdasarkan Proses
Pemisahan
a. Kromatografi adsorbsi
b. Kromatografi partisi
c. Kromatografi pasangan ion
d. Kromatografi penukar ion
e. Kromatografi eksklusif
f. Kromatografi afinitas,

C.TEORI

PEMISAHAN

Teori dan Mekanisme dari

pemisahan.
1. Pemisahan Adsorpsi

Peristiwa

berbagai

adsorpsi oleh fase diam terhadap

fase gerak dan linarut selalu terjadi
kompetitif
Kemampuan fase diam mengadsorpsi
keduanya
sangat
tergantung
pada
topografi gugus aktif yang terdapat pada
masing -masing komponen.
Fase diam dari silica yang mempunyai
gugas hidroksil dari silanol (Si-OH) dapat
terjadi interaksi dengan gugus pada linarut
maupun pada fase gerak.
5

 Peristiwa
adsorbsi
umumnya
terjadi pada kromatografi padat
cair
(liquid
solid
chromatography,
atau
LSC,
terjadi pada KLT).
Dapat pula terjadi pada Gas solid
chromatography
atau
Kromatografi gas (KG) yang
berinteraksi antara fase diam dan
linarutnya.
Fase gerak pada kromatografi gas,
tidak mempunyai gugus aktif yang
dapat berinteraksi dengan fase
6

Rumus Koefisien Distribusi (KD)

KD =CS/CM
CS menyatakan kadar linarut dalam fase
diam (stationair phase), dan CM kadar
linarut dalam fase gerak (mobile phase).
Persamaan diatas menunjukkan bahwa
linarut X lebih banyak berinteraksi dengan
fase diam karena indeknya lebih kecil dan
jumlah dalam masing-masing fase juga
sangat kecil.
Dengan pedoman tersebut berarti kadar
linarut dalam fase diam selalu7 lebih kecil

Berdasarkan hal di atas maka harga K

selalu
lebih kecil dari 1, Tetapi mungkin

dapat terjadi yang sebaliknya.

Adsorpsi linarut oleh fase diam sangat
tergantung pada:
a. Struktur kimia linarut atau adanya gugus
aktif yang ada
b. Ukuran partikel fase diam, makin kecil
ukuran partikel fase diam makin luas
permukaannya sehingga kontak dengan
linarut makin luas.
c. Kelarutan linarut dalam fase gerak, makin
mudah larut linarut dalam fase gerak,
linarut makin mudah lepas dari fase diam.

 d. Kemampuan interaksi (isotermik)

yang terjadi antara fasediam dan
fase gerak.
Contoh interaksi antara
beberapa
H O
OH
senyawa aromatik dengan silica
H

H
O

OH
Si

Si

O
H
O

OH

OH

Si

Si

Si
O

O
9

Penggolongan tipe adsorbsi isotermik

Peristiwa adsorbsi isotermik dapat digolongkan dalam
beberapa tipe yaitu :
a.Tipe konkap
terjadi apabila mula-mula linarut tidak kuat
interaksinya.
kemudian menjadi lebih kuat
sehingga terikat lama pada fase diam. berarti K < 1
b. Tipe normal(linier)
Ikatan yang terjadi tetap. Sehingga berupa garis
lurus dan K = 1.
c. Tipe konvek,
Adsorpsi mula-mula terikat kuat oleh fese diam,
makin lama makin lemah sehingga bentuk
kurvanya menjadi konvek atau harga K>1
10

Penggolongan tipe adsorbsi isotermik

Puncak berekor
Tipe a dan b tersebut yang sering
menyebabkan terjadinya pelebaran
puncak lihat gambar 3.2

11

Contoh gambar adsorbsi isotermik

Gambar:

Konveks

Normal/linier

Konkaf

Berekor/tailing

Berekor/tailing

Normal/semitris

Normal/bulat

Leading(pendahulu)

12

Leading(pendahulu)

a. Jenis fase
diam
Fase diam untuk kromatografi adsorbsi
yang paling banyak digunakan adalah
silica gel
Partikel fase diam mempunyai bentuk
dan ukuran yang berbeda. Ukuran
makin kecil akan makin memperluas
permukaan fase diam, dan memperluas
pula gugus aktif dan fase diam yang
aktif berhubungan dengan linarut
Bentuk dengan pori yang dalam, bila
pori tersebut sangat banyak akan
menaikkan harga K, yang jauh lebih
besar dan 1 dan menimbulkan garis
kurva adsorbsi isotermik yang13konkaf

 Makin dangkal pori yang ada, makin

efisien untuk pemisahan.
Pedoman memilih fase diam dengan
sebagai berikut:
1).Fase diam yang bentuk pelikuler (pori
yang dalam) akan menambah efisiensi,
tetapi menaikkan
kapasitasnya.
2). Bentuk pelikuler umumnya dibuat
packing dengan cara kering

a=porus dangkal

b=porus dalam

c= tidal berporus
14

3/. Bentuk mikroporus, dikemas secara

basah (adonan atau slurry, permukaan jadi

luas menambah harga K)
4/. Bila pemisahan antara linarut sukar,
sebaiknya menggunakan mikroporus, karena
efisiensinya makin tinggi, luas
permukaan
partikel
makin
besar, sehingga kontak
dengan linarut makin banyak (K menjadi
besar).
Kejadian tersebut akan menaikkan sifat
selektivitas fase diam terhadap linarut, dan
kapasitas fase diam akan menjadi lebih besar.

Tabel I.I Beberapanama adsorben/penjerap dan ukurannya (Johson dan Stevenson 1979)

Tipe
Silica
aktif

Nama

Ukuran(nm)

Sifat

Luas m 2 g

Asamlemah

1-7dan 111
HS-4
HC-8
14,12,
HS-4 &
HC-8

Pellosil
Corasil
(HS dan HC
Perrisorb A
Vydac

37-50
37-44

Alumin Pellumina
a
HS dan HC
LainPellidon
Perrisorb PA
lain
Diatomeae
Lempung
Celite

37-44

Basa
lemah

45
30-44

non
polar

30-40
30-44

HS =High solution
HC=High capacity
16

1
0,5

2. Pemisahan Partisi
Pemisahan cara partisi sangat erat
kaitannya dengan kelarutan senyawa ke
dalam pelarut.
Dalam kromatografi didasarkan pada
kelarutan linarut dalam fase diam
maupun fase cair, maka terdapat istilah
koefisien partisi, yang peristiwanya
akan mengembang menjadi koefisen
distribusi yang umumnya berlaku pada
kromatografi.
Koefisien partisi dapat dinyatakan
sebagai
perbandingan
kadar(kelarutan) linarut dalam fase
diam
dengan
kadar(kelarutan)
17
linarut dalam fase gerak.

 Sedangkan
secara
umum
adalah
perbandingan kelarutan senyawa dalam
oktanol dibanding kelarutannya dalam
air.
Sifat linarut dalam kromatografi
dapat digambarkan dalam berbagai
cara, pada kromatografi kolom
dikenal dengan volume tambat atau
VR.
VR (sesuai dengan jumlah volume fase
gerak yang digunakan untuk membawa
satu linarut keluar dari kolom).
Tetapi bila dinyatakan dengan tR
(waktu tambat) menyatakan
waktu
c
yang VR1diperlukan
fase
gerak
membawa VR2
linarut keluara dari kolom.

18

 Sedangkan waktu yang diperlukan untuk

membawa linarut bergerak dari satu titik ke
titik yang lain dalam KLT atau elektroforese
disebut Rf.
Satuan ini merupakan perbandingan jarak
yang ditempuh linarut dengan jarak
yang ditempuh pelarut (fase gerak)
dalam waktu yang sama
Jarak migrasi sampel

Rf =

Jarak migrasi pelarut

Tetapan
partisi
dengan
inial
k'
(perbandingan kadar linarut dalam fase
diam dibanding dengan kadar linarut
dalam
19
fase gerak).

 Kromatografi
eksklusif
pemisahannya atas dasar ukuran
molekul linarut, utamanya pada
molekul
yang
besar,
sehingga
dinamakan
pula
kromatografi
filtrasi.
Pada kromatografi filtrasi dapat pula
terjadi pada kromatogarfi gas tetapi
dengan ukuran molekul yang kecil
disebut moleculer shiever
Teori tersebut perlu dibahas terpisah
sesuai dengan topik dan aplikasinya.
20

LIQUID-LIQUID CHROMATOGRAPHY

ODPN (oxydipropionylnitrile)
Normal Phase LLC
Reverse Phase
LLC

NCCH3CH2OCH2CH2CN(Normal)
CH3(CH2)16CH3(Reverse)

The stationary solid surface is coated with a 2nd liquid (the

Stationary Phase) which is immiscible in the solvent (Mobile) phase.
Partitioning of the sample between 2 phases delays or retains some
components more than others to effect separation.

ION-EXCHANGE CHROMATOGRAPHY

SO3-Na+

Separation in Ion-exchange Chromatography is based on the

competition of different ionic compounds of the sample for the
active sites on the ion-exchange resin (column-packing).

Types of Ion Exchange Resins

Type of
Exchanger

Functional Exchanger Group

Trade Name

Cation
Strong Acid

Sulfonic acid (-SO3-H+)

Dowex 50;
Amberlite IR 120

Weak acid

Carboxyclic acid (-CO2-H+)

Amberlite IRC 50

Anion
Strong base

Quaternary ammonium ion (- Dowex 1; Amberlite

NR3+OH-)
IRA 400

Weak base

Amine group (-NH3+OH-)

Dowex 3; Amberlite
IR 45

Chromatography
Conditions associated with each kind of chromatography
Ion exchange chromatography
Organic cation exchange resins involve crosslinked polystyrene containing
either SO3- H
or H
COO
functional groups with an associated cation
H H

Na SO3

SO3 Na

Organic anion exchange resin involve

crosslinked polystyrene containing NH3+
functional groups with an associated anion
H H H H
C

C
H

Cl NH3

C
H

NH3 Cl

The affinity of dissolved ions

for the resin varies
with the ion and the
composition of the
solution

 nRzSO3H+ + Mn+

(RzSO3)nM + nH+

nRzCO2H+ + Mn+

(RzCO2)nM + nH+

nRzNR3+OH-+ AnnOH-

(RzNR3)nA +

MECHANISM OF ION-EXCHANGE
CHROMATOGRAPHY OF AMINO ACIDS

pH2

SO3

Na

H3 N

COOH
Ion-exchange Resin

SO3

H3 N
Na

+
-

COO

pH4.5

Chromatography of Amino Acids

Stationary Phase

Mobile Phase
H3N

SO3 Na+

COOH
+

Na
SO3

OH
H3 N

COOH
Exchange Resin
-

SO3 H3N+
COOH
SO3

pH3.5

OH

H3N
+

+
-

Na

COO

OH = H 2 O

Na
SO3

H3N

+
-

COO
-

OH = H 2 O

SO3Na

pH4.5

Some Applications of Ion Exchange

Chromatography

Purifications
a mixed bed cation-anion exchanger remove
salts (ex CaCl2) from water by exchanging
them for H2O :Deionization of water

Concentrations
The concentration of trace elements in
seawater.

Analytical Separations
Separations of metal ions and amino acid or
halide ions

SIZE EXCLUTION CHROMATOGRAPHY

Gel-Permeation Chromatography is a mechanical sorting of molecules

based on the size of the molecules in solution.
Small molecules are able to permeate more pores and are, therefore,
retained longer than large molecules.

SIZE EXCLUTION CHROMATOGRAPHY

Molecules that can penetrate the gel particles
are separated based on size and shape.
Others pass straight through the column.
Gel filtration chromatography : mobile phase
is water.
Gel permeation chromatography : mobile
phase is an organic solvent.
Sephadex is popular molecular-sieve material
4 the separation of proteins.

Teori pemisahan

Pemisahan yang terjadi dalam

sistem
selalu
mengalami
keseimbangan yang dinamis, baik
pemisahan
tersebut
karena
peristiwa
adsorbsi
partisi,
penukaran ion, permiasi, maupun
tR2
cara afinitas.
tR1
tm

.
1

.
2

.
3

.
4

.
5

.
6

.32
menit

Resolusi (Daya Pisah)

Kromatografi digunakan untuk analisis, tetapi
tujuan utama semula adalah untuk
pemisahan, sehingga dalam analisis
campuranpun diutamakan pemisahannya.
Untuk mendapatkan harga pemisahan yang
dikehendaki berdasar pada rumus berikut:
(tR2- tR2)
R =
0,5(W1+W2)

syarat harga R agar terjadi pemisahan

dengan baik paling tidak 1,25. Kalau hanya 1
masih ada tumpang tindih sebesar 2% antara
puncak 1 dan puncak 2.
33

Applications of
Chromatography
Qualitative Analysis
Quantitative Analysis
Analyses Based on Peak Height
Analyses Based on Peak Areas
Calibration and Standards
The Internal Standard Method
The Area Normalization Method

Terima Kasih

Hatur Nuhun Ka Sadayana

Sakalangkong
Matur Suwon
Terimo Kasih
Tengkiyu