Kromatografi Kertas dan KLT

Kromatografi adalah suatu cara pemisahan dimana komponen-komponen yang akan

dipisahkan didistribusikan antara 2 fase, salah satunya yang merupakan fase stasioner (diam),
dan yang lainnya berupa fasa mobil (fasa gerak). Fase gerak dialirkan menembus atau sepanjang
fase stasioner. Fase diam cenderung menahan komponen campuran, sedangkan fasa gerak
cenderung menghanyutkannya.
Komponen utama kromatografi adalah fasa stationer (diam) dan fasa mobil (gerak), dan
kromatografi dibagi menjadi beberapa jenis bergantung pada jenis fasa mobil dan mekanisme
pemisahannya, seperti ditunjukkan di Tabel 1.1
Tabel 1.1 Klasifikasi kromatografi
Kriteria

Nama

Fasa mobil

Kromatografi cair, kromatografi gas

Kromatografi adsorpsi, kromatografi partisi

Mekanisme

Kromatografi pertukaran ion

kromatografi gel

Fasa stationer Kromatografi kolom, kromatografi lapis tipis,kromatografi kertas

2.1.

Kromatografi kertas
Berbagai jenis pemisahan yang sederhana dengan kromatografi kertas telah dikerjakan
dimana prosesnya dikenal sebagai analisis kapiler. Metode-metode seperti ini sangat
bersesuaian dengan kromatografi serapan, dan sekarang kromatografi kertas dipandang sebagai
perkembangan dari system partisi. Salah satu zat padat dapat digunakan untuk menyokong fasa
tetap yaitu bubuk selulosa.

2.1.1.

Pengertian Kromatografi Kertas

Kromatografi kertas merupakan kromatografi cairan - cairan dimana sebagai fasa diam
adalah lapisan tipis air yang diserap dari lembab udara oleh kertas jenis fasa cair lainnya dapat
digunakan. Teknik ini sangat sederhana.

2.1.2.

Prinsip Kromatografi Kertas

Prinsip dasar kromatografi kertas adalah partisi multiplikatif suatu senyawa antara dua
cairan yang saling tidak bercampur. Jadi partisi suatu senyawa terjadi antara kompleks selulosa-

air dan fasa mobil yang melewatinya berupa pelarut organik yang sudah dijenuhkan dengan air
atau campuran pelarut.
2.1.3. Mekanisme Kromatografi Kertas
Kertas dibuat dari serat selulosa. Selulosa merupakan polimer dari gula sederhana, yaitu glukosa.

Adsorben dalam kromatografi kertas adalah kertas saring, yakni selulosa.

Cara melakukannya, cuplikan yang mengandung campuran yang akan dipisahkan diteteskan /
diletakkan pada daerah yang diberi tanda di atas sepotong kertas saring dimana ia akan meluas
membentuk noda yang bulat. Bila noda telah kering kertas dimasukkan dalam bejana tertutup
yang sesuai dengan satu ujung, dimana tetesan cuplikan ditempatkan, tercelup dalam pelarut
yang dipilih sebagai fasa bergerak (jangan sampai noda tercelup karena berarti senyawa yang
akan dipisahkan akan terlarut dari kertas).
Pelarut bergerak melalui serat dari kertas oleh gaya kapiler dan menggerakkan komponen dari
campuran cuplikan pada perbedaan jarak dalam arah aliran pelarut. Bila permukaan pelarut telah
bergerak sampai jarak yang cukup jauhnya atau setelah waktu yang telah ditentukan, kertas
diambil dari bejana dan kedudukan dari permukaan pelarut diberi tanda dan lembaran kertas
dibiarkan kering. Jika senyawa-senyawa berwarna maka mereka akan terlihat sebagai pita atau
nodayang terpisah. Jika senyawa tidak berwarna harus dideteksi dengan cara fisika dan kimia
yaitu dengan menggunakan suatu pereaksi pereaksi yang memberikan sebuah warna terhadap
beberapa atau semua dari senyawa -senyawa. Bila daerah dari noda yang terpisah telah dideteksi,
maka perlu mengidentifikasi tiap individu dari senyawa. Metoda identifikasi yang paling mudah
adalah berdasarkan pada kedudukan dari noda relatif terhadap permukaan pelarut, menggunakan
harga Rf.
Harga Rf merupakan parameter karakteristik kromatografi kertas dan kromatografi lapis tipis.
Harga ini merupakan ukuran kecepatan migrasi suatu senyawa pada kromatogram dan pada
kondisi konstan merupakan besaran karakteristik dan reprodusibel.
Harga Rf didefinisikan sebagai perbandingan antara jarak senyawa dari titik awal dan jarak tepi
muka pelarut dari titik awal.
Rf = Jarak titik tengah noda dari titik awal
Jarak tepi muka pelarut dari titik awal
Ada beberapa faktor yang menentukan harga Rf yaitu:

1)
2)
3)

4)

5)

Pelarut, disebabkan pentingnya koefisien partisi, maka perubahan - perubahan yang sangat kecil
dalam komposisi pelarut dapat menyebabkan perubahan - perubahan harga Rf.
Suhu, perubahan dalam suhu merubah koefisien partisi dan juga kecepatan aliran.
Ukuran dari bejana, volume dari bejana mempengaruhi homogenitas dari atmosfer jadi
mempengaruhi kecepatan penguapan dari komponen - komponen pelarut dari kertas. Jika bejana
besar digunakan, ada tendensi perambatan lebih lama, seperti perubahan komposisi pelarut
sepanjang kertas, maka koefisien partisi akan berubah juga. Dua faktor yaitu penguapan dan
kompisisi mempengaruhi harga Rf.
Kertas, pengaruh utama kertas pada harga Rf timbul dari perubahan ion dan serapan, yang
berbeda untuk macam -macam kertas. Kertas mempengaruhi kecepatan aliran juga
mempengaruhi kesetimbangan partisi.
Sifat dari campuran, berbagai senyawa mengalami partisi diantara volume-volume yang sama
dari fasa tetap dan bergerak. Mereka hampir selalu mempengaruhi karakteristik dari kelarutan
satu terhadap lainnya hingga terhadap harga Rf mereka.

Kromatografi kertas diterapkan untuk analisis campuran asam amino dengan sukses besar.
Karena asam amino memiliki sifat yang sangat mirip, dan asam-asam amino larut dalam air dan
tidak mudah menguap (tidak mungkin didistilasi), pemisahan asam amino adalah masalah paling
sukar yang dihadapi kimiawan di akhir abad 19 dan awal abad 20. Jadi penemuan kromatografi
kertas merupakan berita sangat baik bagi mereka.
Kimiawan Inggris Richard Laurence Millington Synge (1914-1994) adalah orang pertama yang
menggunakan metoda analisis asam amino dengan kromatografi kertas. Saat campuran asam
amino menaiki lembaran kertas secara vertikal karena ada fenomena kapiler, partisi asam amino
antara fasa mobil dan fasa diam (air) yang teradsorbsi pada selulosa berlangsung berulang-ulang.
Ketika pelarut mencapai ujung atas kertas proses dihentikan. Setiap asam amino bergerak dari
titik awal sepanjang jarak tertentu. Dari nilai R, masing-masing asam amino diidentifikasi.
Kromatografi kertas dua-dimensi (2D) menggunakan kertas yang luas bukan lembaran kecil, dan
sampelnya diproses secara dua dimensi dengan dua pelarut.

Kromatografi dua dimensi

2.1.4.

Jenis Kromatografi Kertas

Kromatografi kertas ada dua jenis yaitu :
1) Kromatografi kertas satu arah
Dalam kromatografi kertas, fase diam adalah kertas serap yang sangat seragam. Fase gerak
adalah pelarut atau campuran pelarut yang sesuai. Sampel tinta diteteskan pada garis dasar pinsil
pada selembar kromatografi kertas. Beberapa pewarna larut dalam jumlah yang minimum dalam
pelarut yang sesuai, dan itu juga di teteskan pada garis yang sama.
Kertas digantungkan pada wadah yang berisi lapisan tipis pelarut atau campuran pelarut
yang sesuai didalamnya. Perlu diperhatikan bahwa batas pelarut berada dibawah garis pada
bercak diatasnya. Kadang-kadang kertas hanya digulungkan secara bebas pada silinder dan
diikatkan dengan klip kertas pada bagian atas dan bawah. Silinder kemudian ditempatkan dengan
posisi berdiri pada bawah wadah. Alasan untuk menutup wadah adalah untuk meyakinkan bahwa
astmosfer dalam gelas kimia terjenuhkan denga uap pelarut. Penjenuhan udara dalam gelas kimia
dengan uap menghentikan penguapan pelarut sama halnya dengan pergerakan pelarut pada
kertas.

2)

Kromatografi kertas dua arah

Kromatografi kertas dua arah dapat digunakan dalam menyelesaikan masalah pemisahan
substansi yang memiliki nilai Rf yang sangat serupa. Waktu ini kromatogram dibuat dari bercak

tunggal dari campuran yang ditempatkan ke depan dari garis dasar. Kromatogram ditempatkan
dalam sebuah pelarut sebelum dan sesudah sampai pelarut mendekati bagian atas kertas.
Sangat menarik untuk mencoba menjelaskan kromatografi kertas dalam kerangka bahwa
senyawa-senyawa berbeda diserap pada tingkatan yang berbeda pada permukaan kertas. Dengan
kata lain, akan baik menggunakan beberapa penjelasan untuk kromatografi lapis tipis dan kertas.
Kompleksitas timbul karena serat-serat selulosa beratraksi dengan uap air dari atmosfer
sebagaimana halnya air yang timbul pada saat pembuatan kertas. Kertas sebagai serat-serat
selulosa dengan lapisan yang sangat tipis dari molekul-molekul air yang berikatan pada
permukaan.Interaksi ini dengan air merupakan efek yang sangat penting selama pengerjaan
kromatografi kertas.

2.2.

Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

Kromatografi lapis tipis (KLT) dikembangkan tahun 1938 oleh Ismailoff dan Schraiber.
Adsorben dilapiskan pada lempeng kaca yang bertindak sebagai peunjang fase diam. Fase
bergerak akan merayap sepanjang fase diam dan terbentuklah kromatogram. Ini dikenal juga
sebagai kromatografi kolom terbuka. Metode ini sederhana, cepat dalam pemisahan tinggi dan
mudah untuk memperoleh kembali senyawa-senyawa yang terpisahkan.

2.2.1.

Pengertian Kromatografi Lapis Tipis

Kromatografi lapis tipis (KLT) adalah suatu metode analisis yang digunakan untuk
memisahkan suatu campuran senyawa secara cepat dan sederhana.
Kromatografi lapis tipis digunakan untuk pemisahan senyawa secara cepat, dengan
menggunakan zat penjerap berupa serbuk halus yang dipaliskan serta rata pada lempeng kaca.
Lempeng yang dilapis, dapat dianggap sebagai kolom kromatografi terbuka dan pemisahan
dapat didasarkan pada penyerapan, pembagian atau gabungannya, tergantung dari jenis zat
penyerap dan cara pembuatan lapisan zat penyerap dan jenis pelarut.

2.2.2.

Prinsip Kromatografi Lapis Tipis

Prinsipnya didasarkan atas partisi dan adsorpsi. Zat penjerap merupakan fase stasioner,
berupa bubuk halus dibuat serba rata dan tipis diatas lempeng kaca. Fase diam yang umum
digunakan adalah silika gel, baik yang normal fase maupun reversed fase
Kromatografi lapis tipis dengan penyerap penukar ion dapat digunakan untuk pemisahan
senyawa polar. Harga Rf yang diperoleh pada kromatografi lapis tipis tidak tetap, jika
dibandingkan dengan yang diperoleh pada kromatografi kertas. Oleh karena itu pada lempeng
yang sama di samping kromatogram zat yang di uji perlu dibuat kromatogram zat pembanding
kimia, lebih baik dengan kadar yang berbeda-beda.

2.2.3.

Cara Kerja Kromatografi Lapis Tipis

Kromatografi lapis tipis adalah metode pemisahan fisikokimia. Lapisan yang memisahkan,
yang terdiri atas bahan berbutir butir (fase diam), ditempatkan pada penyangga berupa plat
gelas, logam atau lapisan yang cocok. Campuran yang akan dipisah berupa larutan , ditotolkan
berupa berupa bercak atau pita (awal). Setelah plat atau lapisan ditaruh didalam bejana tertutup
rapat yang berisi larutan pengembang yang cocok.

Alasan untuk menutup gelas kimia adalah untuk meyakinkan bahwa kondisi dalam gelas
kimia terjenuhkan oleh uap dari pelarut. Untuk mendapatkan kondisi ini, dalam gelas kimia
biasanya ditempatkan kertas saring yang terbasahi oleh pelarut. Kondisi jenuh dalam gelas kimia
dengan uap mencegah penguapan pelarut. Pemisahan terjadi selama perambatan kapiler. Karena
pelarut bergerak lambat pada lempengan, komponen-komponen yang berbeda dari campuran
pewarna akan bergerak pada kecepatan yang berbeda dan akan tampak sebagai perbedaan bercak
warna.

Untuk campuran yang tidak diketahui, lapisan pemisah (sifat penjerap) dan sistem larutan
pengembang harus dipilih dengan tepat karena keduanya bekerjasama untuk mencapai
pemisahan. Selain itu hal yang juga penting adalah memilih kondisi kerja yang optimum yang
meliputi sifat pengembangan, jarak pengembangan , atmosfer bejana dan lain- lain. Jarak
pengembangan senyawa pada kromatogram biasanya dinyatakan dengan angka Rf atau hRf.
Rf

= Jarak titik pusat bercak dari titik awal

Jarak garis depan dari titik awal

Angka Rf berjangka antara 0,00 dan 1,00 dan hanya dapat ditentukan dua desimal. hRf
adalah angka Rf dikalikan faktor 100 (h), menghasilkan nilai berjangka 0 100. Jika keadaan
luar misalnya sifat penjerap yang agak menyimpang, menghasilkan kromatogram yang agak
menyimpang, menghasilkan kromatogram yang secara umum menunjukkan angka Rf lebih
rendah atau lebih tinggi, maka sistem pelarut harus diganti dengan yang lebih sesuai. Jika angka
hRf lebih tinggi dari hRf yang dinyatakan, kepolaran pelarut harus dikurangi, jika hRf lebih
rendah maka komponen polar pelarut harus dinaikkan.
Sifat sifat umum dari penyerap - penyerap untuk kromatografi lapis tipis yaitu besar
partikel dan homogenitasnya, karena adhesi terhadap penyokong sangat tergantung pada mereka.
Besar partikel yang biasa digunakan adalah 1 25 mikron . Partikel yang butirannya sangat kasar
tidak akan memberikan hasil yang memuaskan dan salah satu alasan untuk menaikkan hasil
pemisahan adalah menggunakan penyerap yang butirannya halus. Kebanyakan penyerap yang
digunakan adalah silika gel. Silika gel yang digunakan kebanyakan diberi pengikat yang
dimaksudkan untuk memberi kekuatan pada lapisan dan menambah adhesi pada gelas
penyokong. Pengikat yang digunakan kebanyakan kalsium sulfat. Tetapi biasanya dalam
perdagangan silika gel telah diberi pengikat. Jadi tidak perlu mencampur sendiri dan diberi nama
dengan kode silika gel G.

Gambar Kromatografi Lapis Tipis

Bahan adsorben sebagai fasa diam digunakan silica gel, alumina, dan serbuk selulosa. Partikel
silica gel mengandung gugus hidroksil di permukaannya yang akan membentuk ikatan hidrogen
dengan molekul -molekul polar. Alumina lebih disukai untuk memisahkan senyawa -senyawa
polar lemah, sedangkan silica gel lebih disukai untuk memisahkan molekul-molekul seperti
asam-asam amino dan gula. Magnesium silikat, kalsium silikat, dan arang aktif mungkin juga
dapat digunakan sebagai adsorben.
Zat yang paling umum digunakan sebagai adsorben adalah alumina, silica gel, dan bubuk
silica. Zat - zat tersebut dibuat bubuk tepung yang selanjutnya tersebar di atas lempeng dan
dibuat sedemikian rupa hingga ketebalannya merata. Kadang - kadang suatu pengikat, misalnya
plaster parte ditambahkan untuk menambah daya lekat zat tersebut. Setelah kering, selanjutnay
diaktivasi dengan pemanasan dalam oven pada temperature 110 oC selama beberapa jam. Cara
kerjanya sama dengan kromatografi kertas. Deteksi terhadap noda timbul kadang-kadang lebih
mudah dibandingkan kromatografi kertas karena dapat dipakai cara-cara yang lebih umum.
Jel silika adalah bentuk dari silikon dioksida (silika). Atom silikon dihubungkan oleh atom
oksigen dalam struktur kovalen yang besar. Namun, pada permukaan jel silika, atom silikon
berlekatan pada gugus -OH. Jadi, pada permukaan jel silika terdapat ikatan Si-O-H selain Si-OSi.
Eluen pengembang dapat berupa pelarut tunggal dan campuran pelarut dengan susunan
tertentu. Pelarut - pelarut pengembang harus mempunyai kemurnian yang tinggi. Terdapatnya
sejumlah kecil air atau zat pengotor lainnya dapat menghasilkan kromatogram yang tidak
diharapkan.
Analisis dengan KLT dapat digunakan untuk mengidentifikasi simplisia yang kelompok
kandungan kimianya telah diketahui. Kelompok kandungan kimia tersebut antara lain :

1)
2)
3)
4)
5)
6)
7)
8)
9)
10)

Alkaloid
Antraglikosida
Arbutin
Glikosida Jantung
Zat pahit
Flavonoid
Saponin
Minyak atsiri
Kumarin dan asam fenol karboksilat
Valepotriat

Pereaksi penampak
Pereaksi penampak adalah larutan pereaksi yang digunakan untuk menyemprot lempeng KLT
agar bercak yang terjadi dapat jelas terlihat.
a) Anisaldehid-asam sulfat P
Untuk mengamati minyak atsiri, saponin, zat pedas dan lain-lain.
b) Dragendroof
Untuk mengamati alkaloid.
c) Antimon (III) klorida
Untuk mengamati glikosida jantung, saponin.

a)

b)
c)
d)
e)
2.2.4.

Hal-hal yang harus diperhatikan dalam KLT :

Lempeng yang akan digunakan harus diaktifkan terlebih dahulu agar pada proses elusi lempeng
silica gel dapat menyerap dan berikatan dengan sampel. Pengaktifan lempeng dilakukan dalam
oven pada suhu 1100C selama 30 menit.
Chamber harus dijenuhkan untuk menghilangkan uap air atau gas lain yang mengisi fase
penjerap yang akan menghalangi laju eluen.
Pada saat penotolan, hendaknya sampel jangan terlalu pekat sebab pemisahannya akan sulit
sehingga didapat noda berekor.
Penotolan harus tepat sehingga didapatkan jumlah noda yang baik.
Eluen yang digunakan harus murni sehingga tidak menghasilkan noda lain.
Noda Pada Kromatografi Lapis Tipis
Mekanisme panampakan noda pada UV yaitu suatu molekul yang mengabsorbsi cahaya
ultraviolet akan mencapai suatu keadaan tereksitasi dan kemudian memancarkan cahaya

a.
b.
c.
d.
e.
f.
g.
h.
i.

ultraviolet atau cahaya tampak pada waktu kembali ke tingkat dasar (emisi), emisi inilah yang
digambarkan sebagai fluoresensi.
Prinsip pemisahan noda adalah berdasarkan kepolarannya sehingga menghasilkan
kecepatan yang berbeda - beda saat terpartisi dan terjadilah pemisahan. Untuk memisahkan noda
dengan sebaik-baiknya maka digunakan kombinasi eluen non polar dengan polar. Apabila noda
yang diperoleh terlalu tinggi, maka kecepatannya dapat dikurangi dengan mengurangi kepolaran.
Namun apabila nodanya lambat bergerak atau hanya ditempat, maka kepolaran dapat ditambah.
Faktor-faktor yang mempengaruhi gerakan noda dalam kromatrografi lapis tipis yang juga
mempengaruhi harga Rf :
Struktur kimia dari senyawa yang sedang dipisahkan
Sifat dari penyerap dan derajat aktivitasnya.
Tebal dan kerataan dari lapisan penyerap.
Pelarut (dan derajat kemurniannya) fase bergerak
Derajat kejenuhan dari uap dalam mana bejana pengembangan yang digunakan
Teknik percobaan, Arah dalam mana pelarut bergerak di atas plat.
Jumlah cupilkan yang digunakan, Penetesan cuplikan dalam jumlah yang berlebihan.
Suhu, Pemisahan-pemisahan sebaiknya dilakukan pada suhu tetap,
Kesetimbangan, Ternyata bahwa kesetimbangan dalam lapisan tipis lebih penting dalam
kromatografi, hingga perlu mengusahakan atmosfer dalam bejana jenuh dengan uap pelarut.

Noda-noda yang diperoleh biasanya berekor disebabkan karena :

Penotolan yang berulang-ulang dan letaknya tidak tepat
Kandungan senyawa yang terlalu asam atau basa
Lempeng yang tidak rata
2.2.5. Kelebihan dan Manfaat Kromatografi Lapis Tipis
a. Kelebihan Kromatografi Lapis Tipis
Kelebihan penggunaan kromatografi lapis tipis yaitu :
lebih cepat dan lebih reproducible dari kromatografi kertas,
untuk menyempurnakan pemisahan,
lempeng dapat dibuat dengan campuran adsorben yaitu campuran homogen dari beberapa
adsorben, satu lempeng dilapisi dengan adsorben yang berbeda-beda, satu lempeng dilapisi
dengan campuran dua adsorben dengan konsentrasi bervariasi dari 0 % ke 100 % untuk adsorben
yang satu dari ujung lempeng yang satu ke ujung lempeng yang lain dan sebaliknya,
area dari bercak lebih kompak dan jenis spray-reagents lebih banyak termasuk yang bersifat
korosif dapat digunakan bila adsorben bukan selulosa.

b.

Manfaat Kromatografi Lapis Tipis

Adapun manfaat dari Kromatografi Lapis Tipis (KLT) yaitu :
Pemeriksaan kualitatif dan kemurnian senyawa obat.
Pemeriksaan simplisia hewan dan tanaman.
Pemeriksaan komposisi dan komponen aktif sediaan obat.
Penentuan kualitatif masing-masing senyawa aktif campuran senyawa obat.