MAKALAH BIOKIM II

TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN

Dosen Pengampu :

Dra. M. DWI WIWIK ERNAWITA, M.Kes

Drs. HARYANTO, M.Kes

Dra. YUSNELTI, M.Si

DISUSUN OLEH :

M. AGRIAWAN BRILIANTIO SR A1C114022

EKA YUGA BUANA A1C114023

MUNAWIR NURSYAHROBBI A1C114024

PROGRAM STUDI PENDIDIKAN KIMIA

FAKULTAS KEGURUAN DAN ILMU PENDIDIKAN
UNIVERSITAS JAMBI
2016
 BAB. 1
PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Molekul-molekul DNA mengandung ikatan kovalen yang terhubung dari dua atau
lebih DNA disebut DNA rokombinan. (nama lain dari rekombinan DNA adalah chimeric
DNA, diambil dari kata chimera, mitos yunani yaitu monster yang memiliki kepala singa,
badan kambing, dan memiliki ekor ular). Produksi rekombinan DNA dibuat dari isolasi enzim
restriksi nuklease.

Penemuan-penemuan dalam bidang biologi molekuler telah memungkinkan para

ilmuwan untuk menduplikasi fenomena transfer genetik di dalam laboratorium dan
mengembangkan metode untuk mengintroduksi hampir semua jenis informasi genetik ke
dalam suatu organisme. Teknologi genetik telah mencapai titik dimana kita dapat
menciptakan duplikat yang sama dari hewan-hewan tingkat tinggi. Kita telah menghasilkan
klon domba dan monyet serta embrio manusia telah berhasil diduplikasi dalam laboratorium.
Kelahiran dolly, domba hasil klon yang pertama, memang sebuah kejadian yang penting.
Dolly direproduksi tanpa bantuan domba jantan, dari sebuah sel kelenjar susu, bukan dari sel
reproduksi, yang diambil secara acak dari seekor domba dewasa.
Gen menjadi dasar dalam pengembangan penelitian genetika meliputi pemetaan gen
dan menganalisis posisi gen pada kromosom. Hasil penelitian telah berkembang pesat dengan
diketahuinya DNA sebagai material genetik beserta strukturnya, kode-kode genetik serta
proses transkripsi dan translasi. Suatu penelitian yang merupakan revolusi dalam biologi
modern adalah setelah munculnya metode teknologi DNA rekombinan atau rekayasa genetika
yang inti prosesnya adalah kloning gen yang merupakan suatu prosedur untuk memperoleh
replika yang dapat sama dari sel atau organisme tunggal.
Kloning pada umumnya adalah perbanyakan DNA rekombinan, yaitu DNA yang
sudah direkayasa dengan teknik penggabungan/penyisipan gen dari satu organisme satu ke
dalam genom organisme lain (transplantasi gen/teknologi plasmid). Contohnya: kloning gen
penghasil insulin dari kelenjar pankreas manusia, disisipkan ke dalam plasmid bakteri
Escherichia coli sehingga bakteri tersebut dapat mengekspresikan gen tersebut dan
menghasilkan insulin manusia dalam jumlah banyak, mengingat bakteri sangat cepat
membelah diri dan bertambah banyak dengan cepat.
Ada beberapa langkah dasar dalam kloning gen, yaitu:
1. Suatu fragmen DNA yang mengandung gen yang akan diklon diinsersikan pada molekul
DNA sirkular yang disebut vektor untuk menghasilkan chimera atau molekul DNA
rekombinan.
2. Vektor bertindak sebagai wahana yang membawa gen masuk ke dalam sel tuan rumah
(host) yang biasanya berupa bakteri, walaupun sel-sel jenis lain dapat digunakan.
3. Di dalam sel host, vektor mengadakan replikasi menghasilkan banyak kopi atau turunan
yang identik baik vektornya sendiri maupun gen yang dibawanya.
4. Ketika sel host membelah, kopi molekul DNA rekombinan diwariskan pada progeny dan
terjadi replikasi vektor selanjutnya.
5. Setelah terjadi sejumlah besar pembelahan sel, maka dihasilkan koloni atau klon sel host
yang identik.
Tiap-tiap sel dalam klon mengandung satu kopi atau lebih molekul DNA rekombinan dan
dapat dikatakan bahwa gen yang dibawa oleh molekul rekombinan telah berhasil diklon.

Dalam kloning digunakan bakteri e-colli dan eukaryote sebagai host dan pembawa
untuk gen tersebut disebut vektor, yang akan dibahas pada bab II.

1.2 Rumusan Masalah

1. Bagaimanakah konsep dari kloning pada escherichia colli dan eukaryote ?

2. Bagaimanakah langkah-langkah dan strategi pada kloning pada escherichia
colli dan eukaryote ?
3. Bagaimana keuntungan maupun kerugian dari adanya teknologi DNA
rekombinan ?

1.3 Tujuan

1. Untuk mengetahui bagaimana konsep dari kloning pada escherichia colli dan
eukaryote
2. Untuk mengetahui langkah-langkah dan strategi pada kloning pada
escherichia colli ( E-colli )
3. Untuk mengetahui keuntungan maupun kerugian dari adanya teknologi DNA
rekombinan
 BAB II

PEMBAHASAN

2.1 Sejarah Perkembangan KLONING

Escherichia Coli pertama kali diidentifikasikan oleh dokter hewan Jerman, Theodor
Escherich dalam studinya mengenai sistem pencernaan pada bayi hewan. Pada 1885, beliau
menggambarkan organisme ini sebagai komunitas bakteri coli (Escherich 1885) dengan
membangun segala perlengkapan patogenitasnya di infeksi saluran pencernaan. Nama
Bacterium Coli sering digunakan sampai pada tahun 1991. Ketika Castellani dan Chalames
menemukan genus Escherichia dan menyusun tipe spesies E. Coli.
Kata kloning, dari kata Inggris clone, pertama kali diusulkan oleh Herbert Webber
pada tahun 1903 untuk mengistilahkan sekelompok makhluk hidup yang dilahirkan tanpa
proses seksual dari satu induk. Secara alami kloning hanya terjadi pada tanaman : menanam
pohon dengan stek.
Sejarah tentang hewan kloning telah muncul sejak tahun 1900, tetapi hewan kloning
baru dapat dihasilkan lewat penelitian Dr. Ian Willmut seorang ilmuwan skotlandia pada
tahun 1997, dan untuk pertama kali membuktikan bahwa kloning dapat dilakukan pada
hewan mamalia dewasa. Hewan kloning tersebut dihasilkan dari inti sel epitel ambing domba
dewasa yang dikultur dalam suatu medium, kemudian ditransfer ke dalam ovum domba yang
kromosomnya telah dikeluarkan, yang akhirnya menghasilkan anak domba kloning yang
diberi nama Dolly.
2.2 Apa itu kloning?
Istilah kloning mengarah kepada hubungan populasi yang identik (serupa) pada
organisme, sel, virus, atau molekul DNA. Setiap anggota dari populasi berasal dari sel
tunggal, virus, atau molekul DNA. Terutama sekali untuk mempermudah melihat bagaimana
individu bakteri dan sel bakteri bisa memproduksi jumlah besar dari keturunannya. Bakteri
tumbuh dengan cepat, dan memiliki populasi besar yang bisa diperoleh dengan mudah dalam
kondisi laboratorium.
Virus dapat dianggap sebagai genom dengan mantel protein, biasanya terdiri dari
banyak salinan satu jenis protein, atau beberapa, sebagian kecil dari protein yang berbeda.
Genom virus dapat beruntai ganda atau tunggal DNA atau RNA. Untuk diskusi ini kita batasi
pada virus DNA dan DNA beruntai ganda. Pada kloning bacteriophages, beberapa bakteri
dimasukkan kedalam cawan petri yang terinfeksi phage (sejenis virus). Setiap individu virus
neginfeksi sebuah sel bakteri dan memproduksi, persis seperti halnya ketika mereka
menginfeksi, dan menghancurkan sel-sel bakteri yang lainnya. Sebagai virus yang
berkelipatan, noda bersih disebut sebagai plak yang muncul pada cawan petri, yang
menandakan dimana sel bakteri telah tewas. Plak terdiri dari keturunan virus yang diklon dari
originalnya.

Untuk mengklon sel-sel individual, apakah dari bakteri atau eukariotik, sebagian sel
menyebar tipis pada media pertumbuhan yang sesuai di cawan. Penyebaran sel-sel tipis
memastikan bahwa setiap sel akan berkembang biak dan diisolasi dari yang lain. Masing-
masing koloni sel yang mucul pada cawan akan melakukan klon dari sel tunggal.

Karena jumlah besar bakteri dan bacteriophages dapat tumbuh dalam interval waktu pemdek
dibawah kondisi laboratorium, itu digunakan untuk memasukkan DNA dari yang lebih besar,
tumbuh-lambat organisme menjadi bakteri atau phages dan untuk menghasilkan lebih banyak
DNA yang diinginkan dengan kloning. Sebagai contoh, kita mengambil sebagian DNA dari
manusia, yang akan sulit untuk memperoleh, dan akan di klon dalam virus, kita bisa
memperlakukan DNA manusia dan DNA virus dengan kesamaan restriksi endonuklease,
campur keduanya, dan biarkan sticky ends memijarkan. Jika kita kemudian mencampurkan
dengan DNA ligase, kita telah menghasilkan DNA rekombinan. Untuk mengkloningnya, kita
memasukkan chimeric DNA kedalam partikel virus dengan menambahkan lapisan protein
virus dan membiarkan virus untuk merakit sendiri. Partikel virus akan tersebar di dalam
bakteri, dan segmen kloning dalam plak kemudian dapat diidentifikasi.
 Bakteriophage biasa disebut Vektor, pembawa untuk gen yang berkepentingan itu
sudah di kloning, gen yang berkepentingan ini disebut dengan banyak hal seperti, foreign
DNA, the insert, geneX, atau bahkan YFG, yaitu your favorite gene.

2.3 Kloning pada e. Colli

Berikut beberapa alasan mengapa menggunakan e. Colli sebagai host dalam kloning
DNA,
1. Genetik Kesederhanaan

Bakteri membuat alat yang berguna untuk penelitian genetika karena ukurannya yang
relatif kecil dibandingkan genom eukariota. E. coli sel hanya memiliki sekitar 4.400 gen
sedangkan proyek genom manusia telah menetapkan bahwa manusia mengandung sekitar
30.000 gen. Selain itu, bakteri, termasuk E. coli, tinggal seumur hidup mereka dalam keadaan
haploid, tanpa alel kedua untuk menutupi efek mutasi pada rekayasa protein percobaan.

2. Laju Pertumbuhan

Bakteri biasanya tumbuh lebih cepat dibandingkan organisme yang lebih kompleks.
E. coli tumbuh pesat pada tingkat satu generasi per dua puluh menit dalam kondisi
pertumbuhan khas. Hal ini memungkinkan untuk persiapan log-fase (pertengahan-cara untuk
kepadatan maksimum) budaya semalam dan hasil eksperimen genetik jam hanya beberapa
bulan bukan hari, atau tahun. pertumbuhan yang lebih cepat juga berarti tingkat produksi
lebih baik bila budaya digunakan dalam ditingkatkan fermentasi proses.

3. Keselamatan

E. coli secara alami ditemukan di saluran usus manusia dan hewan di mana ia
membantu memberikan nutrisi (vitamin K dan B12) ke host-nya. Ada berbagai jenis banyak
dari E. coli yang dapat menghasilkan racun atau menyebabkan berbagai tingkat infeksi jika
injested atau diizinkan untuk menyerang bagian lain dari tubuh. Meskipun reputasi buruk satu
terutama strain beracun (O157: H7), E. coli umumnya relatif inocuous jika ditangani dengan
kebersihan yang wajar.

4. Konjugasi dan Genome Sequence

E. coli genom adalah yang pertama harus benar-benar diurutkan. Pemetaan genetik
dalam E. coli dimungkinkan oleh penemuan konjugasi . E. coli adalah mikroorganisme yang
paling sangat dipelajari dan pengetahuan yang canggih mekanisme ekspresi protein yang
membuatnya mudah untuk digunakan untuk percobaan di mana ekspresi protein asing dan
seleksi rekombinan sangat penting.

5. Kemampuan untuk Host DNA Asing

Kloning gen teknik Sebagian besar dikembangkan dengan menggunakan bakteri ini
dan masih lebih sukses atau efektif dalam E. coli daripada di mikroorganisme lainnya. E. coli
siap berubah dengan plasmid dan vektor , mudah mengalami transduksi , dan persiapan sel
kompeten (sel-sel yang akan mengambil DNA asing) tidak rumit. Transformasi dengan
mikroorganisme lainnya seringkali kurang berhasil.

Kloning dalam biologi adalah proses menghasilkan populasi serupa genetik individu
identik yang terjadi di alam saat organisme seperti bakteri , serangga atau tanaman
bereproduksi secara aseksual . Kloning dalam bioteknologi mengacu pada proses yang
digunakan untuk membuat salinan DNA fragmen ( kloning molekuler ), sel (kloning sel),
atau organisme.

Kloning molekuler mengacu pada proses pembuatan beberapa molekul. Cloning

umumnya digunakan untuk mengamplifikasi fragmen DNA yang mengandung seluruh gen ,
tetapi juga dapat digunakan untuk memperkuat setiap urutan DNA seperti promotor , non-
coding sequences dan DNA secara acak terfragmentasi.

Kloning sel sarana untuk memperoleh suatu populasi sel dari satu sel. Dalam kasus
organisme uniseluler seperti bakteri dan ragi, proses ini sangat sederhana dan pada dasarnya
hanya memerlukan inokulasi medium yang sesuai. Namun, dalam kasus budaya sel dari
organisme multi-selular, kloning sel adalah tugas yang berat sebagai sel-sel ini tidak akan
mudah tumbuh dalam media standar.

Kloning Organisme (juga disebut kloning reproduksi) mengacu pada prosedur untuk
menciptakan organisme multiselular baru, secara genetik identik dengan yang lain. Pada
intinya ini bentuk kloning adalah sebuah metode aseksual reproduksi, di mana pembuahan
atau kontak antar-gamet tidak terjadi.

Kloning dapat secara in vitro , dengan proses yang disebut reaksi berantai polimerase
(PCR). Namun, di sini kita akan mengkaji bagaimana kloning dilakukan in vivo

Kloning in vivo dapat dilakukan

uniseluler mikroba seperti E. coli coli
uniseluler eukariota seperti ragi dan
dalam sel-sel mamalia ditumbuhkan dalam kultur jaringan.
Dalam setiap kasus, DNA rekombinan harus diambil oleh sel dalam bentuk yang
dapat direplikasi dan diekspresikan.Hal ini dicapai dengan memasukkan DNA ke dalam
vektor . Sejumlah virus (baik bakteri dan sel mamalia) dapat berfungsi sebagai vektor. Tapi di
sini mari kita memeriksa contoh kloning menggunakan E. coli sebagai tuan rumah dan
plasmid sebagai vektor.

2.4 Strategi kloning

Prosedur apa pun dalam kloning DNA memiliki empat bagian penting:
fragmentasi pemutusan sebuah untai DNA
ligasi - perekatan bersama potongan-potongan DNA dalam urutan yang diinginkan
transfeksi - memasukkan potongan-potongan yang baru terbentuk DNA ke dalam sel
penyaringan / seleksi - memilih keluar sel yang berhasil transfected dengan DNA baru
sebuah metode untuk menghasilkan fragmen-fragmen DNA, reaksi-reaksi yang
menggabungkan DNA asing ke suatu vektor, suatu cara pengenalan rekombinan buatan ke
dalam sel inang sehingga dapat bereplikasi di dalamnya, dan suatu metode untuk menyeleksi
atau menepis klon dari sel-sel penerima yang telah memperoleh rekombinan.
( Gambar Strategi Kloning)

2.5 Seleksi
Pada bagian ini kami memberikan gambaran mengenai prinsip-prinsip umum yang dipakai
dalam prosedur seleksi dan penepisan rekombinan, dengan subbab mengenai metode genetik,
imunokimia, south-westrem, hibridisasi asam nukleat dan rekombinasional.
1) Metode genetik
Seleksi untuk adanya vektor. Apabila digabungkan dengan teknik-teknik
mikrobiologis, seleksi genetik merupakan alat yang sangat canggih karena dapat diterapkan
pada populasi yang besar. Semua molekul vektor yang bermanfaat membawa suatu penanda
atau ciri genetik yang dapat diseleksi. Vektor-vektor plasmid dan kosmid membawa penanda
resistan-obat atau nutrisional, dan dalam hal pembentukan plak vektor-vektor fag itu
merupakan ciri yang terseleksi. Seleksi genetis terhadap keberadaan vektor merupakan
langkah persyaratan untuk memeperoleh populasi rekombinan. Seperti telah kita lihat, hal ini
dapat dilaksanakan untuk membedakan molekul rekombinan dengan vektor parental non-
rekombinan. Pennyisipan penanda resistan-obat yang ditidakaktifkan, atau dari suatu gen.
Dengan suatu vektor lambda tipe pengganti tertentu, dan dengan vektor-vektor kosmid,
seleksi ukuran berdasarkan partikel fag menyeleksi pembentukan rekombinan.
 Seleksi urutan sisipan. Apabila suatu gen asing yang disisipkan pada rekombinan yang
diinginkan itu terekspresikan, maka seleksi genetik mungkin memberikan metode yang
paling sederhana untuk mmemisahkan klon-klon yang mengandung gen tersebut. Fragmen-
fragmen DNA E. Coli terklon yang membawa gen-gen biosintesis dapat diidentifikasi melalui
komplementasi dari mutasi auksotrof yangg tidak dapat dibalik pada inang galur E. Coli.

2) Metode imunokimia
Deteksi klon yang mensintesis protein asing secara imunokimia merupakan contoh-
contoh yang berhasil di mana urutan gen yang disisipkan terekspresi. Keuntungan utama
metode ini adalah bahwa gen-gen yang tidak memberikan sifat apa pun yang dapat diseleksi
pada inang juga dapat dideteksi, tetapi tenntu saja ini membutuhkan antibodi khusus.
Metode Broome dan Gilbert (1978) akan membantu menjelaskan metode deteksi
imunokimia. Ada tiga butir:
Suatu serum kekebalan yang mengandung beberapa tipe IgG yang berikatan pada
determinan yang berbeda pada molekul antigen
Molekul antibodi sangat kuat menyerap plastikk seperti polivinil yang tidak dapat
dibuang dengan cara mencuci
Antibodi IgG dapat ditandai radioaktif dengan mudah yaitu dengan iodinasi secara
invitro
Sifat-sifat ini secara bagus sekali dimanfaatkan dengan cara berikut. Pertama, sel-sel
yang sudah ditransformasi dikultur lempeng pada agar ddalam cawan petri biasa. Suatu
lempeng replika juga harus disiapkan karena prosedur selanjutnya membunuh koloni-koloni
ini. Kemudian koloni bakteri disisipkan dengan beberapa cara melalui pembedahan pada uap
kloroform, melalui penyemprotan dengan suatu aerosol fag virusen, atau dengan
menggunakan bakteri inang yang membawa profag yang termoindusibel. Perlakuan ini
membebaskan antigen dari koloni positif. Suatu lembaran polivinil yang telah dilapisi dengan
antibodi yang tepat (tidak bertanda) dikenakan pada permukaan lempeng, dengan di atasnya
antigen membentuk kompleks dengan IgG yang terikat. Lembaran ini diambil dan
didedahkan pada IgG yang ditanddai I125 . IgG-I125 itu dapat bereaksi dengan antigen terikat
melalui determinan antigenik pada tapak-tapak selain tapak yang terlibat dengan pengikatan
awal antigen pada lembar berlapis IgG. Koloni-koloni yang bereaksi positif dideteksi melalui
pencucian lembar dan pembuatan cetak autorradiografik. Klon-klon yang dibutuhkan
kemudian dapat diperoleh kembali dari lempeng replika. Metode ini dapat diterapkan dengan
sedikit modifikasi saja pada lempeng yang mengandung plak-plak fag sebagai pengganti
koloni yang sudah ditransformasi.
 Dua aspek metode imunokimia yang lebih lanjut juga perlu disebutkan. Pertama,
pendeteksi molekul protein yang sudah berubah dimungkinkan apabila perubahan itu tidak
mencegah reaksi silang dengan antibodi. Kedua, metode deteksi dua-tapak untuk mendeteksi
penyusun genetis yang baru.

3. metode rekombinasi
Metode yang sederhana dan sangat kuat ini didasarkan pada rekombinasi homolog
pada inang E.coli. urutan gamak di sini disisipkan ke dalam suatu vektor plasmid yang
dibentuk secara khhusus VX. Ini merupakan suatu plasmid yang sangat kecil, terdiri dari
902 pasangan basa yang diturunkan dari replikon CoI EI, yang mengandung suatu urutan
poli-pemaut yang cocok dan suatu gen supresor tRNA, sup F. Kepustakaan genomik fag
dibiakkan pada E.coli yang muddah mengalami rekombinasi yang mengandung plasmid
rekoombinan gamak- VX. Fag yang membawa urutan yang homolog dengan gamak akan
memperoleh suatu kopi terintegrasi dari plasmid melalui rekombinasi homolog. Fag yang
membawa gamak- VX terintegrasi ini kemudian dapat diperoleh kembali dan dipisahkan
dengan cara menumbuhkannya dalam kondisi terpilih yang cocok. Akhirnya dengan
membuat kultur lempeng pada suatu E.coli yang tidak tertekan hanya fag-fag yang memiliki
gen terintegrasi sup F yang dapat membentuk plak karena sifatnya yang homolog dengan
gamak.
Metode ini dapat diterapkan dengan mudah pada sejumlah sangat besar fag dalam
kepustakaan genomik, dan memiliki keuntungan dalam hal dapatnya dilakukan dengan sangat
cepat asalkan plasmid rekombinan gamak- VX-nya telah tersusun seebelumnya. Segmen
gamak terpendek yang dapat memberi rekombinasi yang tinggi diketahui panjangnya sekitar
60 passangan basa. Sejumlah tertentu divergensi urutan dapat ditolelir dalam peristiwa
rekombinasi homolog, tetapi telah ditunjukkan bahwa gamak ini membedakan antara urutan
yang homoolog sempurna dengan divergensi urutan sebesar 8,2%.

4. metode south-westerm
Metode ini melibatkan suatu membran nitro-selulose angkat-plak tempat
pengadsobsian protein fusi yang teerekspresi. Prosedur untuk melaksanakan angkat-plak
sama dengan prosedur yang baru diekspresikan. Walaupun demikian, penapisan dilakukan
dengan menginkubasi membran dengan suatu oligonukleotida khusus. Kondisi dipilih
sehingga dapat diminimalkan pengikatan tidak khas. Plak yang bereaksi positif diidentifikasi
dengan autoradiograf filter. Karena itu teknik ini menggunakan DNA bertanda radioaktif
untuk mendeteksi polopeptida pada nitroselulose dan disebut prosedur suoth-westerm.
Metode ini sangat berhasil untuk memisahkan klon-klon yang mengekspresikan urutan cDNA
yang berkaitang dengan faktor transkripsi tertentu pada mamalia. Jelaslah bahwa prosedur ini
hanya berhasil:
Apabila kegiatan pengikatan disebabkan oleh satu rantai polipeptida tunggal
Apabila ini dapat diekspresikan dalam bentuk fungsional ketika dalam polipeptida
fusi

5. Metode hibridisasi asam nukleat

Berbagai macam metode deduksi rekombinan yang menggunakan hibridisasi dengan
DNA yang dipisahkan dan dimurnikan dari sel-sel yang mengalami transformasi telah
berhasil dikembangkan.
Koloni yang akan ditapis pertama-tama dibuat lempeng replikanya pada suatu cakram filter
selulosa nitrat yang telah ditempatkan pada permukaan suatu lempeng agar sebelum
dilakukan inokulasi. Suatu set referensi dari koloni-koloni ini akan diperoleh pada lempeng
induk. Filter yang membawa koloni-koloni ini diambil dan diperlakukan dengan alkali
sehingga koloni-koloni bakterinya mengalami lisis dan DNA-nya terdenaturasi. Filter ini
kemudian diperlakukan denggan proteinase K untuk menghilangkan proteinnya dan
meninggalkan DNA terdenaturasi terikat pada selulosa nitrat karena afinitasnya yang tinggi
dengan selulosa nitrat, dalam bentuk suatu cetak-DNA dari koloni-koloni. DNA itu terikat
kuat dengan cara memanaskan fiilternya pada suhu 80C. RNA yang telah tertentu dan
bertanda dihibridisasikan dengan DNA ini dan hasil hibridisasinya dipantau melalui
autoradiografi. Suatu koloni yang cetak DNA-nya memberikan hasil autoradiografi yang
positif kemudian dapat diambil dari lempeng referensi.
Variasi dari prosedur ini dapat diterapkan pada plak-plak fag. Metode ini filter
selulosa nitratnya diterapkan pada permukaan atas lempeng agar, sehingga membentuk
kontak langsung antara plak dan filter. Plak-plak berisipartikel fag dan sejumlah besar
rekombinan DNA yang tidak terpaket. Keduanya yaitu fag dan DNA tidak terpaket terikat
pada filter dan dapat didenaturasi, difiksasi, dihibridisasi, dan sebagainya. Metode ini
merupakann prosedur angkat-plak yang asli dan memiliki keuntungan dalam hal dapat
dibentuknya dengan mudah beberapa cetak DNA yang identik dari satu lempeng tunggal fag.
Hal ini memungkinkan dilakukannya penapisan dalam keadaan ganda, dan karenanya
meningkatkan reliabilitasnya, dan juga memungkinkan sattu set tunggal rekombinan dapat
ditapis dengan dua gamak atau lebih.
Keuntungan terbesar dari metode hibridisasi adalah sifatnya yang umum. Dapat
diterapkan dalam urutan apapun, asalkan tersedia gamak radioaktifnya yang tepat.

Plasmid adalah molekul DNA yang ditemukan pada bakteri terpisah dari kromosom bakteri.

Mereka:

kecil (beberapa ribu pasang basa)

biasanya membawa hanya satu atau beberapa gen
lingkaran
 memiliki satu asal replikasi

Plasmid adalah direplikasi oleh mesin yang sama yang mereplikasi kromosom bakteri.
Beberapa plasmid akan disalin pada tingkat yang sama dengan kromosom, sehingga sel
tunggal cenderung hanya satu salinan plasmid. Plasmid lainnya disalin pada tingkat tinggi
dan sebuah sel tunggal dapat memiliki 50 atau lebih dari gen.

Gen pada plasmid dengan salinan angka tinggi biasanya disajikan pada tingkat tinggi.
Di alam, gen ini sering protein menyandi (misalnya, enzim) yang melindungi bakteri dari satu
atau lebih antibiotik .

Plasmid masuk ke dalam sel bakteri dengan relatif mudah. Hal ini terjadi di alam dan
dapat account untuk penyebaran cepat resistensi antibiotik di rumah sakit dan di tempat lain.
Plasmid dapat sengaja diperkenalkan ke bakteri di laboratorium mengubah sel dengan gen
yang masuk.

2.6 KLONING PADA EUKARYOTE

SEL EUKARIOTIK

Secara taksonomi eukariotik dikelompokkan menjadi empat kingdom, masing-masing

hewan (animalia), tumbuhan (plantae), jamur (fungi), dan protista, yang terdiri atas alga
dan protozoa. Salah satu ciri sel eukariotik adalah adanya organel-organel subseluler dengan
fungsi-fungsi metabolisme yang telah terspesialisasi. Tiap organel ini terbungkus dalam suatu
membran. Sel eukariotik pada umumnya lebih besar daripada sel prokariotik. Diameternya
berkisar dari 10 hingga 100 m. Seperti halnya sel prokariotik, sel eukariotik diselimuti oleh
membran plasma. Pada tumbuhan dan kebanyakan fungi serta protista terdapat juga dinding
sel yang kuat di sebelah luar membran plasma. Di dalam sitoplasma sel eukariotik selain
terdapat organel dan ribosom, juga dijumpai adanya serabut-serabut protein yang disebut
sitoskeleton. Serabut-serabut yang terutama berfungsi untuk mengatur bentuk dan
pergerakan sel ini terdiri atas mikrotubul (tersusun dari tubulin) dan mikrofilamen (tersusun
dari aktin).

MACAM-MACAM KLONING SEL EUKARIOTIK

1. KLONING PADA TUMBUHAN
Sampai hari ini, diketahui sudah cukup banyak DNA hewan dan tumbuhan yang
sudah dikloning. Secara singkat kloning pada sel tumbuhan (baik dari akar, batang, dan
daun) bisa dilakukan dengan cara memotong organ tumbuhan yang di-inginkan. Lalu kita
mencari eksplan, mengambil selnya dan memindahkan ke media berisi nutrisi agar cepat
tumbuh. Eksplan ini akan menggumpal menjadi gumpalan yang bernama kalus. Kalus adalah
cikal bakal akar, batang, dan daun. Kalus kemudian ditanam di media tanah dan akan menjadi
sebuah tanaman baru.
Nama lain dari kloning pada tumbuhan adalah kultur jaringan, yaitu suatu teknik
untuk mengisolasi, sel, protoplasma, jaringan, dan organ dan menumbuhkan bagian tersebut
pada nutrisi yang mengandung zat pengatur tumbuh tanaman pada kondisi aseptik,sehingga
bagian-bagian tersebut dapat memperbanyak diri dan beregenerasi menjadi tanaman
sempurna kembali.
Ada dua teori dasar yang berpengaruh dalam kultur jaringan. Yang pertama adalah
teori bahwa sel dari suatu organisme multiseluler di mana pun letaknya, sebenarnya sama
dengan sel zigot karena berasal dari satu sel tersebut. Yang kedua adalah teori totipotensi sel
atau Total Genetic Potential. Artinya, setiap sel yang memiliki potensi genetik mampu
memperbanyak diri dan berdiferensiasi menjadi suatu tanaman lengkap.
Dalam kultur jaringan ada beberapa factor yang mempengaruhi regenerasi
tumbuhannya, yaitu :

1. Bentuk regenerasi dalam kultur in vitro, seperti pucuk adventif atau embrio
somatiknya

2. Eksplan, yaitu bagian tanaman yang digunakan sebagai bahan awal untuk
perbanyakan tanaman. Yang penting dalam eksplan ini adalah factor varietas, umur,
dan jenis kelaminnya. Bagian yang sering menjadi ekspan adalah pucuk muda,
kotiledon, embrio, dan sebagainya.

3. Media tumbuh, karena di dalam media tumbuh terkandung komposisi garam

anorganik, zat pengatur tumbuh, dan bentuk fisik media.

4. Zat pengatur tumbuh tanaman. Faktor yang perlu diperhatikan dalam penggunaan zat
ini adalah konsentrasi, urutan penggunaan dan periode masa induksi dalam kultur
tertentu.
 5. Lingkungan Tumbuh yang dapat mempengruhi regenerasi tanaman meliputi
temperatur, panjang penyinaran, intensitas penyinaran, kualitas sinar, dan ukuran
wadah kultur.

2. KLONING PADA HEWAN

Kloning hewan adalah suatu proses dimana keseluruhan organisme hewan dibentuk
dari satu sel yang diambil dari organisme induknya dan secara genetika membentuk individu
baru yang identik sama. Artinya, hewan kloning ini adalah duplikat yang persis sama baik
dari segi sifat dan penampilannya seperti induknya, dikarenakan adanya kesamaan DNA.
Di alam, sebenarnya kloning bisa saja terjadi. Reproduksi aseksual pada beberapa
jenis organisme dan penemuan mengenai munculnya sel kembar dalam satu telur juga
merupakan apa yang disebut dengan kloning. Dengan kemajuan bioteknologi sekarang ini,
bukan mustahil untuk menciptakan lebih lanjut mengenai kloning pada hewan.
Pertama kali para ilmuwan berusaha membentuk sel kloning pada hewan tidak
berhasil selama bertahun-tahun lamanya. Kesuksesan pertama yang diraih oleh ilmuwan pada
saat mereka berhasil mengkloning seekor kecebong dari sel embrio di tubuh katak dewasa.
Namun demikian, kecebong tersebut tidak pernah berhasil tumbuh menjadi katak dewasa.
Kemudian, dengan menggunakan nuclear trasnfer di sel embrio, para ilmuwan mulai
melakukan penelitian terhadap kloning hewan mamalia. Tapi sekali lagi, hewan-hewan
tersebut tidak pernah mencapai hidup yang panjang.
Proses kloning hewan melalui tahap berikut, yaitu mengekstrak nukleus DNA dari
suatu sel embrio kemudian ditanamkan dalam sel telur yang sebelumnya intinya sudah
dihilangkan. Kadang-kadang proses ini distimulasi oleh manusia menggunakan alat dan
bahan-bahan kimia. Sel telur yang sudah dibuahi ini kemudian dimasukkan kembali ke dalam
tubuh sel hewan inangnya dan membentuk sifat yang identik.

3. KLONING PADA MANUSIA

Setelah sukses dengan teknologi kloning hewan menyusui, sekarang hanya tinggal
menunggu waktu, timbulnya kabar yang melaporkan lahirnya manusia hasil kloning.
Contohnya saja pada Eve, yang dikabarkan adalah bayi perempuan pertama hasil kloning,
namun kebenaran beritanya masih belum bisa dipastikan. Ada lagi berita mengenai hasil
kloning permintaan dari pasangan homoseksual dari Belanda. Namun, bukti-bukti konkrit
mengenai manusia hasil kloningannya sama sekali tidak ada.
Kloning pada manusia terdapat dua cara. Petama, Kloning manusia dapat berlangsung
dengan adanya laki-laki dan perempuan dalam prosesnya. Proses ini dilaksanakan dengan
mengambil sel dari tubuh laki-laki, lalu inti selnya diambil dan kemudian digabungkan
dengan sel telur perempuan yang telah dibuang inti selnya. Sel telur ini setelah bergabung
dengan inti sel tubuh laki-laki lalu ditransfer ke dalam rahim seorang perempuan agar dapat
memeperbanyak diri, berkembang, berubah menjadi janin, dan akhirnya dilahirkan sebagai
bayi. Bayi ini merupakan keturunan dengan kode genetik yang sama dengan laki-laki yang
menjadi sumber pengambilan sel tubuh.
Kedua, Kloning manusia dapat pula berlangsung di antara perempuan saja tanpa
memerlukan kehadiran laki-laki. Proses ini dilaksanakan dengan mengambil sel dari tubuh
seorang perempuan, kemudian inti selnya diambil dan digabungkan dengan sel telur
perempuan yang telah dibuang inti selnya. Sel telur ini setelah bergabung dengan inti sel
tubuh perempuan lalu ditransfer ke dalam rahim perempuan agar memperbanyak diri,
berkembang, berubah menjadi janin, dan akhirnya dilahirkan sebagai bayi. Bayi yang
dilahirkan merupakan keturunan dengan kode genetik yang sama dengan perempuan yang
menjadi sumber pengambilan sel tubuh. Hal tersebut mirip dengan apa yang telah berhasil
dilakukan pada hewan domba.
Adapun teknik rekayasa genetika yang umum dilakukan adalah sebagai berikut :
A.Perbanyakan(Pengklonan)DNA
Kloning DNA umumnya adalah perbanyakan DNA rekombinan, yaitu DNA yang sudah
direkayasa dengan teknik penggabungan/penyisipan gen (DNA) dari organisme satu ke dalam
genom organisme lain (transplantasi gen/teknologi plasmid). Contohnya : kloning gen
penghasil insulin dari kelenjar pankreas manusia, disisipkan ke dalam plasmid bakteri
Escherichia coli, sehingga bakteri dapat mengekspresikan gen tersebut dan menghasilkan
insulin manusia dalam jumlah yang banyak, mengingat bakteri sangat cepat membelah diri
dan bertambah banyak dengan cepat.
Mekanisme Penyisipan Gen/DNA :

1. DNA yang ingin disisipkan, diisolasi dan dipotong oleh enzim endonuklease restriksi,
ditempat yang urutan nukleotidanya spesifik.
 2. DNA yang akan digunakan sebagai inang, misalnya plasmid bakteri E. coli, diisolasi
dan dipotong pula oleh enzim yang sama. Plasmid ini biasanya disebut sebagai vektor
pengklon.

3. Fragmen DNA kemudian disisipkan ke dalam vektor dan disatukan oleh enzim
endonuklease ligase.

4. Plasmid yang telah disisipi, dimasukkan kembali ke dalam bakteri, kemudian bakteri
tersebut dikembangbiakan menjadi banyak, sehingga rekombinan pun ikut bertambah
banyak, demikian pula hasil ekspresi gennya.

B. Kloning Gen Eukariotik dalam Plasmid Bakteri

Pengekspresian gen eukariot di dalam ruang lingkup gen prokariot sangatlah sulit,
karena kedua gen tersebut susunannya berbeda, selain itu adanya daerah bukan pengkode
(intron) di dalam DNA eukariotik yang cukup panjang, dapat mencegah ekspresi gen yang
benar oleh sel prokariot.Untuk mengatasi hal tersebut, maka ketika enzim restriksi memotong
DNA eukariot, dibagian hulu fragmen DNA tersebut harus disisipi oleh promoter prokariot.
Pada saat gen eukariot disisipkan, bakteri dapat mengenali promoter, dan langsung
mengekspresikan gen tersebut. Untuk hal yang kedua, bisa diatasi dengan merubah mRNA
menjadi DNA komplementer (complementary DNA/cDNA), menggunakan enzim
transkriptase balik (reverse transcriptase), yaitu enzim yang diisolasi dari retrovirus. mRNA
bisa digunakan karena pada mRNA, intronnya telah dikeluarkan pada saat proses splicing.
Setelah DNA ditransplantasi menghasilkan DNA rekombinan, maka DNA tersebut
harus dimasukkan kembali ke dalam inang, supaya bisa berekspresi. Pemasukkan DNA
rekombinan bisa dengan cara elektroporasi (memberikan kejutan listrik untuk membuka
membran sel), atau dengan cara penyuntikan (mikroinjeksi), atau dengan cara transformasi,
yaitu penyerapan DNA rekombinan dari larutan.
C. Kloning DNA secara In Vitro
Pengklonan DNA di dalam sel tetap merupakan metode terbaik untuk mempersiapkan
gen tertentu dalam jumlah banyak. Namun ketika sumber DNA sangat sedikit dan tidak
murni, maka dapat digunakan metode PCR (Polymerase Chain Reaction), sehingga setiap
fragmen DNA dapat disalin beberapa kali dengan cepat dan diperkuat (amflipikasi) tanpa
menggunakan sel. Mekanisme PCR dapat dilihat pada gambar 3. Adapun yang dibutuhkan
dalam PCR ini adalah enzim DNA polimerase yang tahan panas, potongan DNA untai
tunggal sebagai primer, dan pasokan nukleotida.
 Sejak tahun 1985, PCR telah banyak digunakan dalam penelitian biologis kedokteran,
sosial, dan hukum. Contohnya : PCR digunakan untuk memperkuat DNA gajah purba
(Mamoth), yang telah berusia 40.000 tahun, PCR digunakan untuk mendeteksi pelaku
kejahatan dari sampel DNA air mani, darah atau jaringan tubuh pelaku lainnya, atau PCR ini
digunakan untuk mendeteksi patogen yang sulit terdeteksi, seperti DNA virus HIV.

2.6.2 kloning vektor untuk eukharyotik

kloning vektor untuk eukharyotik

Seleksi didasarkan pada gizi bukan obat. Ragi sel yang auxotrophic (tidak dapat
mensintesis komponen penting, seperti asam amino) hanya bisa tumbuh ketika
gizi ditambah, atau jika fungsi gizi hilang disediakan oleh gen yang terdapat
pada plasmid atau kromosom ekstra.
 Banyak vektor eukariotik mengandung kedua sinyal eukariotik dan prokariotik dan dapat
direplikasi dalam kedua jenis sel. Ini disebut vektor shuttle.

Seringkali, banyak kloning dilakukan dalam sistem prokariotik dan kemudian

vektor rekombinan ditanam dalam sel eukariotik.

Mengapa tidak hanya mengungkapkan semua gen di prokariota? Mengapa

transfer ke eukariota untuk ekspresi?
Ragi YEp plasmid episomal
YIp - Yeast integrative plasmid

YRps - Yeast replicative plasmid

YACs - Yeast artificial chromosome (600-1400 kb capacity)

Vektor kloning untuk tanaman yang lebih tinggi

Agrobacterium tumefaciens
Sistem ini berasal dari bakteri yang menyebabkan penyakit pada tanaman mahkota empedu.
Selama infeksi, plasmid Ti diintegrasikan ke dalam DNA kromosom tanaman.
Baculovirus
 2.7 KEUNTUNGAN DAN KERUGIAN KLONING

1. MANFAAT KLONING

Secara garis besar kloning bermanfaat:

1.Untuk pengembangan ilmu pengetahuan.

Manfaat kloning terutama dalam rangka pengembangan biologi, khususnya reproduksi-

embriologi dan diferensiasi.

2. Untuk mengembangkan dan memperbanyak bibit unggul.

Seperti telah kita ketahui, pada sapi telah dilakukan embrio transfer. Hal yang serupa tentu
saja dapat juga dilakukan pada hewan ternak lain, seperti pada domba, kambing dan lain-
lain. Dalam hal ini jika nukleus sel donornya diambil dari bibit unggul,maka anggota klonnya
pun akan mempunyai sifat-sifat unggul tersebut. Sifat unggul tersebut dapat lebih meningkat
lagi, jika dikombinasikan dengan teknik transgenik. Dalam hal ini ke dalam nukleus zigot
dimasukkan gen yang dikehendaki, sehingga anggota klonnya akan mempunyai gen
tambahan yang lebih unggul.

3.Untuk tujuan diagnostik dan terapi

Sebagai contoh jika sepasang suami isteri diduga akan menurunkan penyakit genetika
thalasemia mayor. Dahulu pasangan tersebut dianjurkan untuk tidak mempunyai anak.
Sekarang mereka dapat dianjurkan menjalani terapi gen dengan terlebih dahulu dibuat klon
pada tingkat blastomer. Jika ternyata salah satu klon blastomer tersebut mengandung kelainan
gen yang menjurus ke thalasemia mayor, maka dianjurkan untuk melakukan terapi gen pada
blastomer yang lain, sebelum dikembangkan menjadi blastosit. Contoh lain adalah
mengkultur sel pokok (stem cells) in vitro, membentuk organ atau jaringan untuk
menggantikan organ atau jaringan yang rusak.

4.Menolong atau menyembuhkan pasangan infertil mempunyai turunan

Manfaat yang tidak kalah penting adalah bahwa kloning manusia dapat
membantu/menyembuhkan pasangan infertil mempunyai turunan. Secara medis infertilitas
dapat digolongkan sebagai penyakit, sedangkan secara psikologis ia merupakan kondisis
yang menghancurkan, atau membuat frustasi. Salah satu bantuan ialah menggunakan teknik
fertilisasi in vitro . (in vitro fertilization = IVF). Namun IVF tidak dapat menolong semua
pasangan infertil. Misalnya bagi seorang ibu yang tidak dapat memproduksi sel telur atau
seorang pria yang tidak dapat menghasilkan sperma, IVF tidak akanmembantu.Dalam
hubungan ini, maka teknik kloning merupakan hal yang revolusioner sebagai pengobatan
infertilitas, karena penderita tidak perlu menghasilkan sperma atau telur. Mereka hanya
memerlukan sejumlah sel somatik dari manapun diambil, sudah memungkinkan mereka
punya turunan yang mengandung gen dari suami atau istrinya.

2. KERUGIAN KLONING

1. Kloning pada manusia akan menghilangkan nasab.

2. Kloning pada perempuan saja tidak akan mempunyai ayah.

3. Menyulitkan pelaksanaan hokum-hukum syara. Seperti, hokum pernikahan, nasab,

nafkah, waris, hubungan kemahraman, hubungan ashabah, dan lain-lain.
 BAB. 3

PENUTUP

3.1 Kesimpulan
Tujuan dari kloning adalah untuk mendapatkan populasi yang identik (serupa) pada
organisme, sel, virus, atau molekul DNA
Prosedur dari kloning terdiri dari empat bagian diantaranya adalah
fragmentasi pemutusan sebuah untai DNA
ligasi - perekatan bersama potongan-potongan DNA dalam urutan yang diinginkan
transfeksi - memasukkan potongan-potongan yang baru terbentuk DNA ke dalam
sel
penyaringan / seleksi - memilih keluar sel yang berhasil transfected dengan DNA
baru
untuk menyisipkan plasmid ke ecolli digunakan vektor, macam-macam vektor
diantaranya yang sering digunakan adalah
Plasmid : ekstrakromosom dari bakteri (double stranded)
Bakteriofaga : virus lamda, untai tunggal
Cosmid : plasmid yang dimodifikasi menjadi bentuk lingkar
Phasmid : hasil silang antar plasmid dan faga (vektor sintetik)
Untuk melakukan seleksi pada seleksi dan penepisan rekombinan ada beberapa
metode yang bisa dipilih diantaranya adalah
metode genetic
imunokimia
south-westrem
hibridisasi asam nukleat,dan
rekombinasional
 DAFTAR PUSTAKA

Campbell, N.A, etc. 2009. Biologi. 8th edition. San Fransisco : Pearson Benjamin Cumming

Djuminar, A. 2006. Biologi Molekuler. Bandung : Poltekkes Jurusan Analis Kesehatan

F, Robert, dkk. 1995. Basic Genetics. England : Wm.C. Brown Publishers

J, Peter,Russell.1994. Fundamental of Genetics. New York : HarperCollins College

Publishers

Nur Azhar, T. 2008. Dasar-dasar Biologi Molekuler. Bandung : Penerbit Widya Padjadjaran

http://bioweb.wku.edu/courses/biol350/CloningVectEuk9/Review.html