1) Tujuan

Untuk memahami prosedur dasar yang terlibat dalam proses isolasi DNA dari berbagai
sumber seperti darah, jaringan, bakteri dll

Theory

Plasmid adalah double stranded, melingkar tambahan DNA kromosom bakteri. Hal ini
digunakan dalam percobaan DNA rekombinan untuk mengkloning gen dari organisme lain
dan membuat jumlah besar dari DNA mereka. Plasmid dapat ditransfer antara spesies yang
sama atau antara spesies yang berbeda. Ukuran plasmid berkisar 1-1000 pasangan basa kilo.
Plasmid merupakan bagian dari mobilomes (total semua unsur genetik bergerak di genom)
seperti transposon atau prophages dan berkaitan dengan konjugasi. Bahkan plasmid terbesar
yang jauh lebih kecil dari DNA kromosom bakteri, yang dapat berisi beberapa juta pasangan
basa.

Istilah 'plasmid' diperkenalkan oleh seorang ahli biologi molekuler Amerika Joshua
Lederberg. Plasmid dianggap sebagai elemen genetik ditransfer atau 'replikon'. Mereka
sebenarnya DNA telanjang. Plasmid adalah alat penting di laboratorium genetika dan
bioteknologi di mana mereka biasanya digunakan untuk memperbanyak atau
mengekspresikan gen tertentu. Plasmid juga digunakan untuk membuat sejumlah besar
protein.

Plasmid encoding Zinc Finger nucleases digunakan untuk memberikan gen terapi untuk situs
kromosom terpilih dengan frekuensi lebih tinggi dari integrasi acak. Terutama ada dua jenis
plasmid: conjugative dan non conjugative. plasmid Conjugative memiliki tra-gen (tra-
transfer) dan dapat melakukan konjugasi. plasmid non conjugative tidak dapat melakukan
konjugasi. Ada kelas menengah plasmid disebut mobilizable plasmid. plasmid Mobilizable
dapat membawa hanya sebagian dari gen yang diperlukan untuk transfer. Mereka dapat
menjadi plasmid conjugative transferring yang parasit jika kehadirannya dalam jumlah yang
tinggi.
1) TA cloning....

TA kloning adalah teknik subcloning yang menghindari penggunaan enzim restriksi yang
lebih mudah dan lebih cepat daripada subcloning tradisional. Teknik ini bergantung pada
kemampuan adenin (A) dan timin (T) (basepairs pelengkap) dari fragmen DNA yang berbeda
untuk berhibridisasi dan diikat bersama-sama oleh enzim liagase. Produk PCR biasanya
diperkuat dengan menggunakan Taq DNA polymerase yang istimewa dengan penambahan
adenin ke ujung 3 'dari produk.

2) CTAB adalah .....

Salah satu teknik yang digunakan untuk solasi DNA tanaman ini adalah dengan
menggunakan CTAB (cationic hexadecyl trimethyl ammonium bromide). CTAB
merupakan detergen yang berguna untuk melarutkan membran plasma sel dan akan
membentuk komplek dengan DNA. CTAB adalah detergen yang berkation yang akan
membentuk komplek presipitasi dengan DNA ketika konsentrasi NaCl di bawah 0,7 M.
Presipitasi DNA dari buffer CTAB dengan adanya etanol atau isopropanol sering
menghasilkan massa bergelatin yang komposisinya tidak diketahui. DNA pada umumya
terlihat jelas dalam massa tersebut, tetapi sulit untuk memisahkannya, sehingga untuk
menghindari terbentuknya massa ini digunakan presipitasi yang tidak menggunakan
alcohol (Chawla, 2003).
Larutan buffer yang biasa digunakan dalam teknik isolasi DNA tanaman adalah
CTAB (Cetyl Trimetyl Ammonium Bromide). Larutan ini dapat melarutkan membrane
plasma dan akan membentuk komplek dengan DNA. Salah satu keunggulan metode ini
adalah tidak dibutuhkannya persiapan yang panjang untuk jaringan tanaman dan dapat
digunakan untuk berbagai jenis jaringan termasuk daun, akar, biji, embrio, endosperma
dan pollen serta kultur suspensi. Metode ini juga dapat diaplikasikan dari ukuran sampel
mulai miligram herbarium, jaringan yang telah menjadi fosil hingga beberapa gram
jaringan yang baru (Chawla, 2003).

3) Metode isolasi DNA dari bakteri, tumbuhan dan hewan

Metode isolasi DNA dari bakteri E.coli

Kultur Bakteri
(E.Coli)
 - Kultur selama 1 malam
- Sentrifuge (mengambil kultur dan
menghilangkan medium)

Larutan I (glucose) Larutan II (NaOH Larutan III

& SDS) NaOH: (netralisasi)
merusak membran
sel
Jika ada larutan SDS : sabun untuk
berkonsentrasi menghancurkan Menggumpal &
tinggi masuk ke membran sel menyatu
dalam sel, dengan
sendirinya
membran sel akan Indikator untuk
rusak melihat lendir Supernatan
lendir dimulut (berisi DNA)
tabung yang
menandakan bahwa
membran sel telah
terpecah
- Treatment PCI (Phenol

DNA bebas dari komponen lain

- Etanol 100% dan NaCl (membantu
pengendapan)

Pengendapan
- Inkubasi
- Cuci dengan EtOH 70%
- Keringkan

DNA murni

Metode isolasi DNA dari tumbuhan

Metode ini hanya untuk sampel daun tanaman. Untuk beberapa
tanaman terutamayang mengandung senyawa fenolik tinggi harus berasal dari daun ke
cambah setelah kotiledon.Bahan ekstraksi dan dilusi merupakan bahan kit dari Sigma-
Aldrich. Modifikasi dilakukan dengan melakukan presipitasi dengan etanol absolute
dan pencucian dengan campuran chloroform isoamyl alkohol.
CARA KERJA
1. Perlu diingat untuk menggunakan alat dan bahan yang steril.
2. Siapkan larutan ekstrak dari Kit Sigma sebanyak 100 mikro liter
pada mikrotube 2 ml.
3. Cuci gunting yang akan digunakan dengan arkohol 70% kemudian keringkan dengan
tissue yang baru.
4. Masukan potongan daun pada mikrotube (daun harus dalam keadaan terendam).
5. Panaskan pada suhu 95 C menggunakan waterbath selama 5 menit.
6. Tambahkan larutan dilusi sebanyak 100 mikroliter.
7. Tambahkan aquades sebanyak 300 mikroliter.
8. Pindahkan cairan pada mikrotube 1500 mikroliter (usahakan
sisa daun tidak terbawa).
9. Tambahkan campuran cloroform isoamylalkohol (CIA
24:1) sebanyak 150 mikroliter. Aduk dengan vortex mixer selama +/- 10 detik.
10. Centrifuge pada kecepatan 15.000 rpm atau +/- 12.000 G
11. Pindahkan supernatan pada mikrotube 1500 mikroliter.
12. Tambahkan etanol absolut 2 kali volume supernatan.
13. Jika suspensi/gumpalan lendir tidak terlihat, dapat dimasukkan ke
dalam freezer selama 10 menit.
14. Centrifuge pada kecepatan 7000 rpm (+/- 5000 G).
15. Buang larutan etanol lalu keringkan diatas kertas tissue.
16. Jika alkohol sudah tidak ada yang menetes, keringkan DNA dengan vacum
pump sampai kering.
17. Larutkan paket DNA dengan air double destilate.

Metode isolasi DNA hewan Drosophila melanogaster dan larva udang Stomatopoda
Sp.
1. Dua puluh ekor D. melanogaster dimasukkan ke dalam 1,5 ml microcentrifuge
tube.
2. D. melanogaster tersebut digerus dengan pestel. Selama penggerusan,
ditambahkan 200 l GT buffer.
3. Selanjutnya, 20 l proteinase K ditambahkan ke dalam sampel dan dilakukan
inverting.
4. Sampel kemudian diinkubasi selama 30 menit dalam suhu 60 0C. Setelah 30
menit, 200 l GBT buffer ditambahkan ke dalam sampel dan dikocok dengan
kuat selama lima detik.
5. Selanjutnya, sampel diinkubasi selama 20 menit pada suhu 60 0C. Sebelum
dilanjutkan pada tahap berikutnya, perlu disiapkan elution buffer yang dipanaskan
hingga suhunya 60 0C.
6. Sampel yang diinkubasi selama 20 menit ditambahkan 200 l etanol absolut dan
dikocok kuat selama 10 detik. Sampel tersebut kemudian dipindahkan ke GD
column.
7. Sementara itu, GD column ditempatkan ke dalam 2 ml collection tube.
Selanjutnya, dilakukan sentrifugasi selama dua menit dengan kecepatan 14.000
rpm.
8. GD column dipindahkan ke 2 ml collection tubebaru, kemudian ditambahkan 400
L W1 buffer. Selanjutnya, dilakukan sentrifugasi selama tiga puluh detik dengan
kecepatan 14. 000 rpm.
 9. Cairan yang terkumpul dalam collection tube dibuang, kemudian
GD column ditempatkan lagi pada collection tube.
10. GD column tersebut ditambahkan 600 L
11. Wash buffer dan dilakukan sentrifugasi selama 30 detik dengan kecepatan 14. 000
rpm.
12. Cairan yang terkumpul di collection tube dibuang,kemudian
GD column ditempatkan lagi dicollection tube dan dilakukan sentrifugasi selama
tiga menit dengan kecepatan 14. 000 rpm.
13. GD colum dipindahkan ke 1,5 ml microcentrifuge tube steril. Sampel
ditambahkan 100 L Elution buffer 60 oC, kemudian tabung dibiarkan selama
lima menit dengan posisi tegak.
14. Selanjutnya, dilakukan sentrifugasi selama 30 detik dengan kecepatan 14.000
rpm. GD column dibuang dan cairan yang terkumpul di microcentrifuge
(mengandung DNA) disimpan di suhu 4 oC atau - 20oC.

4) Miniprep plasmid extraction

a) Ambil 0,5 ml kultur E.coli yang telah dikultur selama 24 jam

b) Tambahkan 0.5ml fenol: kloroform: isoamylalcohol (25: 24: 1). fenol jenuh dengan TE
(10mm Tris, 7,5, 1mM EDTA) sebelum pencampuran dengan kloroform dan isoamylalcohol.
c) Sampel divortex pada kecepatan maksimum selama 1 menit. Atau, vortex selama 10 detik dan
kemudian transfer ke Eppendorf mixer atau rotator over-the-top selama 5 menit.
d) Putar di 12,000g selama 5 menit. Selama spin, mempersiapkan tabung microfuge dengan
0.5ml isopropanol.
e) Setelah dispin dibuang 0,45 fase air atas yang mengganggu interfase dengan hati-hati dan
ditambahkan isopropanol. Aduk rata dan berputar segera di 12.000 g selama 5 menit. Selain
garam dan pendinginan tidak diperlukan.
f) Supernatan dipindahkan dan ditambah 0,5 ml ethanol 70%. Ulangi dan cuci lagi
g) Vakum kering pelet dan menangguhkan di 100ul / ml RNAse). Tentang 5-10ul DNA ini
sekarang dapat dibelah dengan enzim restriksi yang sesuai (s) untuk analisis.