Abstrak

Diagnosa molekuler terkini dari patogen manusia memberikan informasi terbatas yang seringkali
tidak cukup untuk penyelidikan wabah dan transmisi. Urutan generasi berikutnya (NGS) menentukan
urutan DNA genom bakteri lengkap dalam urutan tunggal, dan dari data ini, informasi tentang
resistensi dan virulensi, serta informasi untuk pengetikan diperoleh, berguna untuk penyelidikan
wabah. Data genom yang diperoleh dapat digunakan lebih lanjut untuk pengembangan tes skrining
khusus wabah. Dalam tinjauan ini, pengenalan umum untuk NGS disajikan, termasuk persiapan
perpustakaan dan karakteristik utama platform NGS yang paling umum, seperti MiSeq (Illumina) dan
Ion PGM (ThermoFisher). Gambaran umum perangkat lunak yang digunakan untuk analisis data
NGS yang digunakan di laboratorium diagnostik mikrobiologi medis di University Medical Center
Groningen di Belanda diberikan. Selanjutnya, penerapan NGS dalam setting klinis dijelaskan, seperti
manajemen wabah, temuan kasus molekuler, karakterisasi dan pengawasan patogen, identifikasi
bakteri dengan cepat menggunakan daerah rRNA 16S-23S, taksonomi, pendekatan metagenomik
pada sampel klinis, dan penentuan dari transmisi mikro organisme zoonosis dari hewan ke manusia.
Akhirnya, kami berbagi visi kami tentang penggunaan NGS dalam mikrobiologi pribadi dalam waktu
dekat, menunjukkan persyaratan tertentu.

Google Terjemahan untuk Bisnis:Perangkat PenerjemahPenerjemah Situs Web

Identifikasi dan karakterisasi mikroorganisme yang menyebabkan infeksi sangat penting untuk
keberhasilan pengobatan, pemulihan dan keamanan pasien. Namun, tidak semua spesies bakteri
dapat berhasil dibudidayakan di laboratorium diagnostik, dan tes molekuler yang tersedia tidak dapat
mendeteksi ciri genetik yang muncul dalam patogen yang berkembang dengan baik yang menyebar
pada manusia, hewan dan lingkungan. Patogen yang tidak dikenali dapat dengan mudah
menyebabkan wabah di rumah sakit, menempatkan pasien pada risiko selama penerimaan rumah
sakit mereka.

Selama dua dekade terakhir, metode diagnostik molekuler telah mengalami perkembangan yang
pesat dan memainkan peran yang semakin penting dalam laboratorium mikrobiologi medis (Buchan
dan Ledeboer,

2014). Metode ini telah mengurangi waktu penyelesaian dari menerima sampel ke hasil akhir, dan
memungkinkan untuk mendeteksi patogen yang tidak dapat diobati. Namun, metode molekuler
membutuhkan pengetahuan apriori tentang spesies patogen yang mungkin ada dalam sampel. Salah
satu metode molekuler yang digunakan dalam laboratorium mikrobiologi medis adalah analisis
urutan gen atau keseluruhan genom patogen.

Analisis sekuens dapat digunakan untuk menjawab berbagai pertanyaan diagnostik, seperti
hubungan genetik bakteri atau virus, deteksi mutasi pada genom virus atau bakteri yang
menyebabkan resistensi terhadap antivirus atau antibiotik, identifikasi jamur melalui analisis sekuens
dari deoksiribonukleos ribosom 18S. asam (rDNA) dari daerah spacer transkripsi internal (ITS) dan
identifikasi bakteri melalui analisis sekuens rRNA 16S
distribusi taksa yang sama, sehubungan dengan M. Uji triangulasi dapat diterapkan pada berbagai
macam rezim sampling yang berbeda yang melibatkan sejumlah biologis dan replikasi. Ini adalah tes
nonparametrik dan dengan demikian kuat terhadap asumsi distribusi populasi. Pada Bagian 2,
pertama-tama kita merumuskan uji triangulasi untuk kasus 3 3 dari tiga sampel biologis, masing-
masing diwakili oleh tiga ulangan. Kami kemudian menggeneralisasi uji triangulasi untuk kasus
sejumlah sampel biologis, masing-masing diwakili oleh sejumlah replikasi yang sewenang-wenang.
Pada Bagian 3, kami mendemonstrasikan penerapan uji triangulasi pada kasus 3 3 dengan
menggunakan sampel tinja manusia. Secara lebih rinci, kami mengumpulkan tiga sampel dari lokasi
yang berbeda (kurang lebih satu sentimeter) di potongan bangku yang sama dan mengurutkan tiga
ulangan untuk masing-masing. Penerapan uji triangulasi menyiratkan bahwa komposisi mikroba dari
feses yang diteliti tidak homogen pada skala makroskopik. Kami menggunakan serangkaian campuran
sampel yang dibuat secara artifisial untuk mempelajari kinerja metode pada pengaturan kontras yang
lebih rendah dan menunjukkan bahwa kinerjanya sama dengan PERMANOVA.

METHODE

Uji triangulasi untuk sampel 3x3

Asumsikan bahwa kita diberi tiga sampel biologis A, B dan C, dan untuk setiap sampel biologis S = A,
B atau C kita diberi tiga ulangan, S1, S2 dan S3. Dengan demikian kami memiliki sembilan sampel
secara total: A1, A2, A3, B1, B2, B3, C1, C2, C3. Selain itu, misalkan M adalah rantai analisis langkah-
langkah spesifik yang menyediakan profil taksonomi untuk semua sampel, dan ukuran yang tidak
sesuai.

Hipotesis nol dan hipotesis alternatif yang menarik dinyatakan sebagai berikut:

H0: sembilan sampel A1,. . ., C3 semua ditarik secara independen sesuai dengan distribusi yang
sama, versus

Ha: Untuk masing-masing dari tiga sampel biologis S = A, B atau C, ketiga ulangan S1, S2, S3 diambil
dari distribusi yang sama untuk S, namun distribusi untuk masing-masing sampel biologis tidak
semuanya identik. Selain itu, mereplikasi dalam sampel biologis yang sama diharapkan lebih mirip
satu sama lain daripada yang ada

dalam sampel biologis yang berbeda.

Untuk mengatasi hipotesis ini, kami mendefinisikan uji triangulasi sebagai uji signifikansi non-
parametrik sederhana untuk H0. Hal ini didasarkan pada konsep triangulasi acak dari sekumpulan
sampel.

Untuk memudahkan eksposisi, pertama-tama kita gambarkan ini untuk setting khusus yang
digunakan dalam studi praktis kita, yaitu tiga sampel biologis, masing-masing diwakili oleh tiga
ulangan. Di bawah ini, kami kemudian akan menyajikan versi umum dari tes ini yang memungkinkan
sejumlah sampel biologis, masing-masing dengan jumlah replikasi sewenang-wenangnya sendiri.

Kita mendefinisikan sebuah triangulasi dari himpunan dari sembilan ulangan A1, A2,. . ., C3 menjadi
graf G = (V, E) dengan simpul set V = {A1, A2,. . ., C3}
dan edge set E terdiri dari tepi yang tidak diarahkan yang membentuk simpul-menguraikan 3-siklus
yang masing-masing melibatkan ulangan dari dua sampel biologis yang tepat. Kami menginginkan
agar triangulasi semacam itu mengandung sebanyak mungkin segitiga, yaitu tiga segitiga seperti pada
Gambar 1.

Kita asumsikan bahwa analisis kandungan taksonomi (atau konten fungsional, jika diinginkan) dari
masing-masing ulangan telah dilakukan dengan menggunakan M dan kita telah memperoleh ukuran
disimilaritas d (Si, Tj) antara dua ulangan Si, Tj

Uji triangulasi V.The dilakukan dalam dua tahap. Pada langkah pertama, kita secara acak memilih
triangulasi tunggal yang melibatkan semua ulangan. Pada Gambar 1 kita menunjukkan satu pilihan
untuk kasus tiga sampel biologis, masing-masing diwakili oleh tiga ulangan. Sebagai Diperlukan,
masing-masing segitiga yang digambarkan mengandung dua ulangan dari sampel biologis yang sama,
dan tiruan ketiga dari sampel biologis yang berbeda. Pada langkah kedua, kita kemudian mengajukan
pertanyaan berikut: Untuk setiap segitiga dalam triangulasi yang dipilih, adalah perbedaan antara
kedua ulangan yang terkandung dalam sampel biologis yang sama kurang dari ketidaksamaan salah
satu dari keduanya terhadap replikasi ketiga dalam segitiga. ? Jika jawabannya ya untuk semua
segitiga, maka tolak H0 dengan taraf signifikansi yang kurang dari 0.05. Untuk melihat ini, perhatikan
bahwa berdasarkan hipotesis nol H0, ketiga pasangan replikasi dalam segitiga memiliki probabilitas
yang sama untuk menunjukkan nilai ketidaksamaan yang paling kecil, 1/3 (atau kurang, dalam kasus
dasi).

Dengan demikian, probabilitas bahwa selalu ada pasangan ulangan yang terkandung dalam sampel
biologis yang sama yang memiliki nilai terkecil di ketiga segitiga paling banyak (1/3) 3 = (1/27) <0,05.
Oleh karena itu, probabilitas untuk menolak hipotesis nol jika benar (yaitu, kesalahan tipe 1) kurang
dari 0,05.

Apakah tes segitiga dapat menolak H0 tidak hanya bergantung pada sampel, tetapi juga pada rincian
metode analisis M, kami ingin menekankannya. Misalnya, jika sampel dianalisis menggunakan
metode resolusi rendah M yang hanya bisa mendeteksi adanya atau tidak adanya bakteri secara
umum, katakanlah, dan jika bakteri terdeteksi.

dalam semua sampel, maka ketidaksamaan akan konstan, dalam hal ini pengujian akan gagal
menolak hipotesis nol. Namun, tentu saja dimungkinkan bahwa penggunaan metode analisis resolusi
tinggi akan menyebabkan penolakan hipotesis nol pada data yang sama. Kami juga ingin menekankan
bahwa penerapan tes hanya melibatkan penggunaan satu triangulasi yang dipilih secara acak. Tes ini
tidak mengharuskan seseorang melihat beberapa triangulasi. Secara khusus, ini membuat tes sangat
mudah diterapkan "dengan tangan".