DERIVATISASI PADA HPLC

Derivatisasi melibatkan suatu reaksi kimia antara suatu analit dengan suatu reagen untuk mengubah sifat fisika-kimia suatu
analit. Tujuan utama penggunaan derivatisasi pada HPLC adalah untuk:

1. Meningkatkan deteksi
2. Merubah struktur molekul atau polaritas analit sehingga akan menghasilkan puncak kromatografi yang lebih baik
3. Merubah matriks sehingga diperoleh pemisahan yang lebih baik
4. Menstabilkan analit yang sensitif.5)

Detektor yang paling banyak digunakan dalam HPLC adalah detektor UV-Vis sehingga banyak metode yang dikembangkan untuk
memasang atau menambahkan gugus kromofor yang akan menyerap cahaya pada panjang gelombang tertentu. Di samping itu,
juga dikembangkan suatu metode untuk menghasilkan fluorofor (senyawa yang mamapu berfluoresensi) sehingga dapat dideteksi
dengan fluorometri.7)
Suatu reaksi derivatisasi harus mempunyai syarat-syarat sebagai berikut, yakni: produk yang dihasilkan harus mampu menyerap
baik sinar ultraviolet atau sinar tampak atau dapat membentuk senyawa berfluoresen sehingga dapat dideteksi dengan
spektrofluorometri; proses derivatisasi harus cepat dan menghasilkan produk yang sebesar mungkin (100 %); produk hasil
derivatisasi harus stabil selama proses derivatisasi dan deteksi; serta sisa pereaksi untuk derivatisasi harus tidakmenganggu
pemisahan kromatografi.7)

Berbagai macam bahan penderivat telah tersedia antara lain :

Gugus fungsional Reagen untuk dapat dideteksi Reagen untuk dapat
dengan UV-Vis dideteksi dengan Fluoresen
Asam-asam p-nitrobenzil-N,N- 4-bromometil-7-
kaboksilat; asam- diisopropilisourea (PNBDI); 3,5- asetoksikumarin;
asam lemak;asam- dinitrobenzil-N,N- 4-bromometil-7-
asam fosfat diisopropilisourea (DNBDI); p- metoksikumarin;
bromofenasil bromida (PBPB)
Alkohol 3,5-dinitrobenzil klorida (DNBC); 4-
dimetilaminiazobenzen-4-sulfinil
(Dabsyl-Cl); 1-naftilisosianat (NIC-1).
Aldehid; keton p-nitrobenziloksiamin hidroklorida Dansil hidrazin
(PNBA); 3,5-dinitrobenziloksiamin
hidroklorida (DNBA);
Amin primer Fluoresamin
o-ftalaldehid (OPA)
Amin primer (1o) dan 3,5-dinitrobenzil klorida (DNBC); N- 7-kloro-4-nitrobenzo-2-oksa-
sekunder (2o) suksinimidil-p-nitrofenilasetat 1,3-diazol (NBD-Cl); 7-fluoro-
(SNPA); N-suksinimidil-3,5- 4-nitrobenzo-2-oksa-1,3-
dinitrofenilasetat (SDNPA); 4- diazol (NBD-F); Dansil klorida
dimetilaminiazobenzen-4-sulfinil
(Dabsyl-Cl); 1-naftilisosianat (NIC-1).
Asam-asam amino 4-dimetilaminiazobenzen-4-sulfinil Fluoresamin
(peptida) (Dabsil-Cl) o-ftalaldehid (OPA)
7-kloro-4-nitrobenzo-2-oksa-
1,3-diazol (NBD-Cl); 7-fluoro-
4-nitrobenzo-2-oksa-1,3-
diazol (NBD-F);
Derivatisasi ini dapat dilakukan sebelum analit memasuki kolom (pre-column derivatization) atau setelah analit keluar dari kolom
(post-column derivatization). http://lansida.blogspot.com/2010/07/hplc-kromatografi-cair-kinerja-tinggi.html
2.1 PENGERTIAN KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (HPLC)
HPLC adalah alat yang sangat bermanfaat dalam analisis. Bagian ini menjelaskan bagaimana pelaksanaan dan penggunaan serta
prinsip HPLC yang sama dengan kromatografi lapis tipis dan kromatografi kolom. HPLC secara mendasar merupakan perkembangan
tingkat tinggi dari kromatografi kolom. Selain dari pelarut yang menetes melalui kolom dibawah grafitasi, didukung melalui tekanan
tinggi sampai dengan 400 atm. Ini membuatnya lebih cepat. HPLC memperbolehkan penggunaan partikel yang berukuran sangat
kecil untuk material terpadatkan dalam kolom yang mana akan memberi luas permukaan yang lebih besar berinteraksi antara fase
diam dan molekul-molekul yang melintasinya. Hal ini memungkinkan pemisahan yang lebih baik dari komponen-komponen dalam
campuran.
http://www.idonbiu.com/2009/10/mengenal-kromatografi-cair-kinerja.html
2.2 JENIS HPLC
Pemisahan dengan HPLC dapat dilakukan dengan fase normal (jika fase diamnya lebih polar dibanding dengan fase geraknya) atau
fase terbalik (jika fase diamnya kurang non polar dibanding dengan fase geraknya). Berdasarkan pada kedua pemisahan ini, sering
kali HPLC dikelompokkan menjadi HPLC fase normal dan HPLC fase terbalik. Selain klasifikasi di atas, HPLC juga dapat
dikelompokkan berdasarkan pada sifat fase diam dan atau berdasarkan pada mekanisme sorpsi solut, dengan jenis-jenis HPLC
sebagai berikut:

1. Kromatografi Adsorbsi
Prinsip kromatografi adsorpsi telah diketahui sebagaimana dalam kromatografi kolom dan kromatografi lapis tipis. Pemisahan
kromatografi adsorbsi biasanya menggunakan fase normal dengan menggunakan fase diam silika gel dan alumina, meskipun
demikian sekitar 90% kromatografi ini memakai silika sebagai fase diamnya. Pada silika dan alumina terdapat gugus hidroksi yang
akan berinteraksi dengan solut. Gugus silanol pada silika mempunyai reaktifitas yang berbeda, karenanya solut dapat terikat secara
kuat sehingga dapat menyebabkan puncak yang berekor.

2. Kromatografi fase terikat

Kebanyakan fase diam kromatografi ini adalah silika yang dimodifikasi secara kimiawi atau fase terikat. Sejauh ini yang digunakan
untuk memodifikasi silika adalah hidrokarbon-hidrokarbon non-polar seperti dengan oktadesilsilana, oktasilana, atau dengan fenil.
Fase diam yang paling populer digunakan adalah oktadesilsilan (ODS atau C18) dan kebanyakan pemisahannya adalah fase terbalik.
Sebagai fase gerak adalah campuran metanol atau asetonitril dengan air atau dengan larutan bufer. Untuk solut yang bersifat asam
lemah atau basa lemah, peranan pH sangat krusial karena kalau pH fase gerak tidak diatur maka solut akan mengalami ionisasi
atau protonasi. Terbentuknya spesies yang terionisasi ini menyebabkan ikatannya dengan fase diam menjadi lebih lemah dibanding
jika solut dalam bentuk spesies yang tidak terionisasi karenanya spesies yang mengalami ionisasi akan terelusi lebih cepat.

3. Kromatografi penukar ion

KCKT penukar ion menggunakan fase diam yang dapat menukar kation atau anion dengan suatu fase gerak. Ada banyak penukar
ion yang beredar di pasaran, meskipun demikian yang paling luas penggunaannya adalah polistiren resin. Kebanyakan pemisahan
kromatografi ion dilakukan dengan menggunakan media air karena sifat ionisasinya. Dalam beberapa hal digunakan pelarut
campuran misalnya air-alkohol dan juga pelarut organik. Kromatografi penukar ion dengan fase gerak air, retensi puncak
dipengaruhi oleh kadar garam total atau kekuatan ionik serta oleh pH fase gerak. Kenaikan kadar garam dalam fase gerak
menurunkan retensi solut. Hal ini disebabkan oleh penurunan kemampuan ion sampel bersaing dengan ion fase gerak untuk gugus
penukar ion pada resin.
4. Kromatografi Pasangan ion
Kromatografi pasangan ion juga dapat digunakan untuk pemisahan sampel-sampel ionik dan mengatasi masalah-masalah yang
melekat pada metode penukaran ion. Sampel ionik ditutup dengan ion yang mempunyai muatan yang berlawanan.

5. Kromatografi Eksklusi Ukuran

Kromatografi ini disebut juga dengan kromatografi permiasi gel dan dapat digunakan untuk memisahkan atau menganalisis
senyawa dengan berat molekul > 2000 dalton.
Fase diam yang digunakan dapat berupa silika atau polimer yang bersifat porus sehingga solut dapat melewati porus (lewat
diantara partikel), atau berdifusi lewat fase diam. Molekul solut yang mempunyai BM yang jauh lebih besar, akan terelusi terlebih
dahulu, kemudian molekul-molekul yang ukuran medium, dan terakhir adalah molekul yang jauh lebih kecil. Hal ini disebabkan solut
dengan BM yang besar tidak melewati porus, akan tetapi lewat diantara partikel fase diam. Dengan demikian, dalam pemisahan
dengan eksklusi ukuran ini tidak terjadi interaksi kimia antara solut dan fase diam seperti tipe kromatografi yang lain.

6. Kromatografi Afinitas
Dalam kasus ini, pemisahan terjadi karena interaksi-interaksi biokimiawi yang sangat spesifik. Fase diam mengandung gugus-gugus
molekul yang hanya dapat menyerap sampel jika ada kondisi-kondisi yang terkait dengan muatan dan sterik tertentu pada sampel
yang sesuai (sebagaimana dalam interaksi antara antigen dan antibodi). Kromatografi jenis ini dapat digunakan untuk mengisolasi
protein (enzim) dari campuran yang sangat kompleks.

http://lansida.blogspot.com/2010/07/hplc-kromatografi-cair-kinerja-tinggi.html
2.3 PRINSIP DASAR HPLC
Prinsip kerja HPLC adalah sebagai berikut :
Dengan bantuan pompa fasa gerak cair dialirkan melalui kolom ke detektor. Cuplikan dimasukkan ke dalam aliran fasa gerak
dengan cara penyuntikan. Di dalam kolom terjadi pemisahan komponen-komponen campuran. Karena perbedaan kekuatan interaksi
antara solut-solut terhadap fasa diam. Solut-solut yang kurang kuat interaksinya dengan fasa diam akan keluar dari kolom lebih
dulu. Sebaliknya, solut-solut yang kuat berinteraksi dengan fasa diam maka solut-solut tersebut akan keluar kolom dideteksi oleh
detektor kemudian direkam dalam bentuk kromatogram kromatografi gas. Seperti pada kromatografi gas, jumlah peak menyatakan
konsentrasi komponen dalam campuran. Computer dapat digunakan untuk mengontrol kerja sistem HPLC dan mengumpulkan serta
mengolah data hasil pengukuran HPLC.

2.4 INSTRUMENTASI KROMATOGRAFI CAIRAN KINERJA TINGGI

Instrumentasi Kromatografi Cairan Kinerja Tinggi, yaitu:

A. Fasa Gerak
Fasa gerak dalam HPLC adalah berupa zat cair dan disebut juga eluen atau pelarut. Berbeda dengan kromatografi gas, HPLC
mempunyai lebih banyak pilihan fasa gerak, dibandingkan dengan fasa gerak untuk kromatografi gas. Dalam kromatografi gas, fasa
gerak hanya sebagai pembawa solute melewati kolom menuju detektor. Sebaliknya dalam HPLC,fasa gerak selain berfungsi
membawa komponen-komponen campuran menuju detector, fasa gerak dapat berinteraksi dengan solute-solut. Oleh karena itu,
fasa gerak dalam HPLC merupakan salah satu faktor penentu keberhasilan proses pemisahan.
PERSYARATAN FASA GERAK HPLC
Zat cair yang akan digunakan sebagai fasa gerak HPLC harus memenuhi beberapa persyaratan berikut:
Zat cair harus bertindak sebagai pelarut yang baik untuk cuplikan yang akan di analisis.
Zat cair harus murni sekali untuk menghindarkan masuknya kotoran yang dapat menganggu interpretasi kromatogram.
Zat cair harus jernih sekali untuk menghindarkan penyumbatan pada kolom.
Zat cair harus mudah diperoleh, murah, tidak mudah terbakar, dan tidak beracun.
Zat cair tidak kental.
Sesuai dengan detektor.

JENIS FASA GERAK

Fasa gerak untuk kromatografi partisi, adsorpsi, dan penukar ion bersifat interaktif dalam arti fasa gerak berinteraksi dengan
komponen-komponen cuplikan. Akibatnya, waktu retensi sangat dipengaruhi oleh jenis pelarut. Sebaliknya fasa gerak untuk
kromatografi eksklusi bersifat non interaktif. Oleh karena itu, waktu retensi dengan kromatografi ini tidak bergantung pada
komposisi fasa gerak.
B. Pompa
Pompa dalam HPLC dapat dianalogikan dengan jantung pada manusia yang berfungsi untuk mengalirkan fasa gerak cair melalui
kolom yang berisi serbuk halus. Pompa yang dapat digunakan dalam HPLC harus memenuhi persyaratan :
1. Menghasilkan tekanan sampai 600 psi
2. Keluaran bebas pulsa
3. Kecepatan alir berkisar antara 0,1-10 mL/menit
4. Bahan tahan korosi
Dikenal tiga jenis pompa yang masing-masing memiliki kenutungan dan kekurangannya yaitu pompa reciprocating, displacement
dan pneumatic.

Pompa reciprocating
Jenis pompa ini sekarang banyak dipakai. Pompa ini terdiri dari ruangan kecil tempat pelarut yang dipompa dengan cara gerakan
piston mundur-maju yang dijalankan oleh motor. Piston berupa batang gelas dan berkontak langsung dengan pelarut.
Pompa displacement
Pompa ini menyerupai syringe (alat suntik) terdiri dari tabung yang dilengkapi pendorong yang digerakan oleh motor. Pompa ini
juga menghasilkan aliran yang cenderung tidak bergantung tekanan baik kolom dan viskositas pelarut. Selain itu, keluaran pompa
ini bebas pulsa. Akan tetapi pompa ini keterbatasan kapasitas pelarut (250 mL) dan tidak mudah untuk melakukan pergantian
pelarut.
Pompa pneumatic
Dalam pompa ini pelarut di dorong oleh gas bertekanan tinggi. Pompa jenis ini murah dan bebas pulsa. Akan tetapi mempunyai
keterbatasan kapasitas dan tekanan yang dihasilkan (<2000 psi) serta kecepatan alir bergantung pada viskositas pelarut dan
tekanan balik kolom.

C. Unit Sistem Penyuntikan Atau Penginjeksian Sampel

Gambar 2. Tipe injektor katup putaran

Kadang kala, faktor ketidaktepatan pengukuran HPLC terletak pada keterulangan pemasukan cuplikan ke dalam peking kolom.
Masalahnya, kebanyakan memasukan cuplikan ke dalam kolom dapat menyebabkan band broadening. Oleh karena itu, cuplikan
yang dimasukkan harus sekecil mungkin, beberapa puluh mikroliter. Selain itu, perlu diusahakan tekanan tidak menurun ketika
memasukkan cuplikan ke dalam aliran fasa gerak. Berikut beberapa teknik pemasukan cuplikan ke dalam sistem HPLC :
1. Injeksi Syringe
Alat yang paling dulu dan paling mudah untuk memasukkan cuplikan adalah syringe. Syringe disuntikkan melalui septum (seal
karet) dan untuk ini dirancang syringe yang tahan tekanan sampai 1500 psi. akan tetapi keterulangan injeksi syringe ini sedikit lebih
baik dari 2-3 % dan sering lebih jelek.
2. Injeksi stop-flow
Injeksi stop-flow adalah jenis injeksi syringe kedua tapi di sini aliran pelarut dihentikan sementara, sambungan pada ujung kolom
dibuka dan cuplikan disuntikan langsung ke dalam ujung kolom. Setelah menyambungkan kembali kolom maka pelarut dialirkan
kembali.
3. Kran Cuplikan
Jenis pemasukan cuplikan ini disebut juga loop dan paling banyak digunakan. Untuk memasukkan cuplikan ke dalam aliran fasa
gerak perlu dua langkah: (a) sejumlah volume cuplikan disuntikkan ke dalam loop dalam posisi load, cuplikan masih berada dalam
loop, (b) kran diputar untuk mengubah posisi load menjadi posisi injeksi dan fasa gerak membawa cuplikan ke dalam kolom. Loop
dapat diganti-ganti dan tersedia berbagai ukuran volume dari 5 hingga 500L. Dengan sistem pemasukan cuplikan ini
memungkinkan memasukkan cuplikan pada tekanan 7000 psi dengan ketelitian tinggi. Juga loop mikro tersedia dengan volume 0,5
hingga 5 L.
D. Kolom
Ada 2 jenis kolom pada HPLC yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor. Kolom merupakan bagian HPLC yang mana terdapat
fase diam untuk berlangsungnya proses pemisahan solut/analit.
Kolom mikrobor mempunyai 3 keuntungan yang utama dibanding dengan kolom konvensional, yakni:
Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau lebih kecil dibanding dengan kolom konvensional karena pada kolom
mikrobor kecepatan alir fase gerak lebih lambat (10 -100 l/menit).
Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih ideal jika digabung dengan spektrometer massa.
Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat, karenanya jenis kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah
sampel terbatas misal sampel klinis.
Kebanyakan fase diam pada HPLC berupa silika yang dimodifikasi secara kimiawi, silika yang tidak dimodifikasi, atau polimer-
polimer stiren dan divinil benzen. Permukaan silika adalah polar dan sedikit asam karena adanya residu gugus silanol (Si-OH). Silika
dapat dimodifikasi secara kimiawi dengan menggunakan reagen-reagen seperti klorosilan. Reagen-reagen ini akan bereaksi dengan
gugus silanol dan menggantinya dengan gugus-gugus fungsional yang lain.
Oktadesil silika (ODS atau C18) merupakan fase diam yang paling banyak digunakan karena mampu memisahkan senyawa-senyawa
dengan kepolaran yang rendah, sedang, maupun tinggi. Oktil atau rantai alkil yang lebih pendek lagi lebih sesuai untuk solut yang
polar. Silika-silika aminopropil dan sianopropil (nitril) lebih cocok sebagai pengganti silika yang tidak dimodifikasi. Silika yang tidak
dimodifikasi akan memberikan waktu retensi yang bervariasi disebabkan karena adanya kandungan air yang digunakan.
E. Detektor
Detektor pada HPLC dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu: detektor universal (yang mampu mendeteksi zat secara umum, tidak
bersifat spesifik, dan tidak bersifat selektif) seperti detektor indeks bias dan detektor spektrometri massa; dan golongan detektor
yang spesifik yang hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan selektif, seperti detektor UV-Vis, detektor fluoresensi, dan
elektrokimia.

Idealnya, suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai berikut:

1. Mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel.
2. Mempunyai sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut pada kadar yang sangat kecil.
3. Stabil dalam pengopersiannya.
4. Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran pita.
5. Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada kisaran yang luas (kisaran dinamis linier).
6. Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak.
Beberapa detektor yang paling sering digunakan pada HPLC antara lain :

http://lansida.blogspot.com/2010/07/hplc-kromatografi-cair-kinerja-tinggi.html

Fase diam (Stationary phase)

Fase diam merupakan salah satu komponen yang penting dalam proses pemisahan
dengan kromatografi. kenapa? karena dengan adanya interaksi dengan fase diamlah
terjadi perbedaan waktu retensi (tR) dan terpisahnya komponen senyawa analit.

Fase diam dapat berupa bahan padat atau porous (berpori) berbentuk molekul kecil
atau cairan yang umumnya dilapiskan pada padatan pendukung.
http://denikrisna.wordpress.com/2010/10/23/kromatografi-dasar/

Fase gerak (Mobile phase)

Fase gerak merupakan pembawa analit dapat bersifat inert maupun berinteraksi
dengan analit tersebut. Nah fase gerak ini g melulu hanya cairan. Tapi juga dapat
berupa gas inert yang umumnya dapat dipakai sebagai carrier gas senyawa mudah
menguap (volatil)

SISTEM PERALATAN HPLC

Instrumentasi HPLC pada dasarnya terdiri atas: wadah fase gerak, pompa, alat untuk
memasukkan sampel (tempat injeksi), kolom, detektor, wadah penampung buangan fase gerak,
dan suatu komputer atau integrator atau perekam.
Diagram skematik sistem kromatografi cair seperti ini :
1. Wadah Fase gerak dan Fase gerak
Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Wadah pelarut kosong ataupun labu
laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak. Wadah ini biasanya dapat menampung
fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut(1).
Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampur yang secara
keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh
polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponen-komponen sampel. Untuk
fase normal (fase diam lebih polar daripada fase gerak), kemampuan elusi meningkat dengan
meningkatnya polaritas pelarut. Sementara untuk fase terbalik (fase diam kurang polar daripada
fase gerak), kemampuan elusi menurun dengan meningkatnya polaritas pelarut.

Fase gerak sebelum digunakan harus disaring terlebih dahulu untuk menghindari partikel-partikel
kecil ini. Selain itu, adanya gas dalam fase gerak juga harus dihilangkan, sebab adanya gas akan
berkumpul dengan komponen lain terutama di pompa dan detektor sehingga akan mengacaukan
analisis.

Elusi dapat dilakukan dengan cara isokratik (komposisi fase gerak tetap selama elusi) atau
dengan cara bergradien (komposisi fase gerak berubah-ubah selama elusi) yang analog dengan
pemrograman suhu pada kromatografi gas. Elusi bergradien digunakan untuk meningkatkan
resolusi campuran yang kompleks terutama jika sampel mempunyai kisaran polaritas yang
luas.4)

Fase gerak yang paling sering digunakan untuk pemisahan dengan fase terbalik adalah campuran
larutan bufer dengan metanol atau campuran air dengan asetonitril. Untuk pemisahan dengan
fase normal, fase gerak yang paling sering digunakan adalah campuran pelarut-pelarut
hidrokarbon dengan pelarut yang terklorisasi atau menggunakan pelarut-pelarut jenis alkohol.
Pemisahan dengan fase normal ini kurang umum dibanding dengan fase terbalik.2)

2. Pompa
Pompa yang cocok digunakan untuk HPLC adalah pompa yang mempunyai syarat sebagaimana
syarat wadah pelarut yakni: pompa harus inert terhadap fase gerak. Bahan yang umum dipakai
untuk pompa adalah gelas, baja tahan karat, Teflon, dan batu nilam. Pompa yang digunakan
sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak
dengan kecepatan alir 3 mL/menit. Untuk tujuan preparatif, pompa yang digunakan harus
mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan 20 mL/menit.
Tujuan penggunaan pompa atau sistem penghantaran fase gerak adalah untuk menjamin proses
penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat, reprodusibel, konstan, dan bebas dari
gangguan. Ada 2 jenis pompa dalam HPLC yaitu: pompa dengan tekanan konstan, dan pompa
dengan aliran fase gerak yang konstan. Tipe pompa dengan aliran fase gerak yang konstan sejauh
ini lebih umum dibandingkan dengan tipe pompa dengan tekanan konstan.6)

3. Tempat penyuntikan sampel

Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung ke dalam fase gerak yang mengalir
di bawah tekanan menuju kolom menggunakan alat penyuntik yang terbuat dari tembaga tahan
karat dan katup teflon yang dilengkapi dengan keluk sampel (sample loop) internal atau
eksternal.
 Posisi pada saat memuat sampel Posisi pada saat menyuntik sampel

4. Kolom dan Fase diam

Ada 2 jenis kolom pada HPLC yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor. Kolom
merupakan bagian HPLC yang mana terdapat fase diam untuk berlangsungnya proses pemisahan
solut/analit.

Kolom mikrobor mempunyai 3 keuntungan yang utama dibanding dengan kolom konvensional,
yakni:

Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau lebih kecil dibanding dengan
kolom konvensional karena pada kolom mikrobor kecepatan alir fase gerak lebih lambat
(10 -100 l/menit).
Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih ideal jika
digabung dengan spektrometer massa.
Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat, karenanya jenis kolom
ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas misal sampel klinis.

Meskipun demikian, dalam prakteknya, kolom mikrobor ini tidak setahan kolom konvensional
dan kurang bermanfaat untuk analisis rutin.3]
Kebanyakan fase diam pada HPLC berupa silika yang dimodifikasi secara kimiawi, silika yang
tidak dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren dan divinil benzen. Permukaan silika adalah polar
dan sedikit asam karena adanya residu gugus silanol (Si-OH).
Silika dapat dimodifikasi secara kimiawi dengan menggunakan reagen-reagen seperti klorosilan.
Reagen-reagen ini akan bereaksi dengan gugus silanol dan menggantinya dengan gugus-gugus
fungsional yang lain.

Oktadesil silika (ODS atau C18) merupakan fase diam yang paling banyak digunakan karena
mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran yang rendah, sedang, maupun tinggi.
Oktil atau rantai alkil yang lebih pendek lagi lebih sesuai untuk solut yang polar. Silika-silika
aminopropil dan sianopropil (nitril) lebih cocok sebagai pengganti silika yang tidak dimodifikasi.
Silika yang tidak dimodifikasi akan memberikan waktu retensi yang bervariasi disebabkan
karena adanya kandungan air yang digunakan.

5. Detektor HPLC
Detektor pada HPLC dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu: detektor universal (yang mampu
mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan tidak bersifat selektif) seperti detektor
indeks bias dan detektor spektrometri massa; dan golongan detektor yang spesifik yang hanya
akan mendeteksi analit secara spesifik dan selektif, seperti detektor UV-Vis, detektor fluoresensi,
dan elektrokimia.

Idealnya, suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai berikut:

1. Mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel.

2. Mempunyai sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut pada kadar yang
sangat kecil.
3. Stabil dalam pengopersiannya.
4. Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran pita.
5. Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada kisaran yang luas
(kisaran dinamis linier).
6. Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak.2)

Beberapa detektor yang paling sering digunakan pada HPLC dengan karakteristik detektor
seperti berikut :
 Detektor Sensitifitas Kisaran Karakteristik
(g/ml) linier
Absorbansi Uv-vis
Fotometer filter 5 x 10-10 104 Sensitivitas bagus, paling
Spektrofotometer 5 x 10-10 105 sering digunakan, selektif
spektrometer photo- > 2 x 10-10 105 terhadap gugus-gugus dan
diode array struktur-struktur yang
tidak jenuh.
Fluoresensi 10-12 104 Sensitifitas sangat bagus,
selektif, Tidak peka
terhadap perubahan suhu
dan kecepatan alir fase
gerak.
Indeks bias 5 x 10-7 104 Hampir bersifat universal
akan tetapi sensitivitasnya
sedang. Sangat sensitif
terhadap suhu, dan tidak
dapat digunakan pada
elusi bergradien
Elektrokimia
Konduktimetri 10-8 104 Peka terhadap perubahan
Amperometri 10-12 105 suhu dan kecepatan alir
fase gerak, tidak dapat
digunakan pada elusi
bergradien. Hanya
mendeteksi solut-solut
ionik. Sensitifitas sangat
bagus, selektif tetapi
timbul masalah dengan
adanya kontaminasi
elektroda.
JENIS HPLC
Pemisahan dengan HPLC dapat dilakukan dengan fase normal (jika fase diamnya lebih polar
dibanding dengan fase geraknya) atau fase terbalik (jika fase diamnya kurang non polar
dibanding dengan fase geraknya). Berdasarkan pada kedua pemisahan ini, sering kali HPLC
dikelompokkan menjadi HPLC fase normal dan HPLC fase terbalik.
Selain klasifikasi di atas, HPLC juga dapat dikelompokkan berdasarkan pada sifat fase diam dan
atau berdasarkan pada mekanisme sorpsi solut, dengan jenis-jenis HPLC sebagai berikut:
1. Kromatografi Adsorbsi
Prinsip kromatografi adsorpsi telah diketahui sebagaimana dalam kromatografi kolom dan
kromatografi lapis tipis. Pemisahan kromatografi adsorbsi biasanya menggunakan fase normal
dengan menggunakan fase diam silika gel dan alumina, meskipun demikian sekitar 90%
kromatografi ini memakai silika sebagai fase diamnya. Pada silika dan alumina terdapat gugus
hidroksi yang akan berinteraksi dengan solut. Gugus silanol pada silika mempunyai reaktifitas
yang berbeda, karenanya solut dapat terikat secara kuat sehingga dapat menyebabkan puncak
yang berekor.3)

2. Kromatografi fase terikat

Kebanyakan fase diam kromatografi ini adalah silika yang dimodifikasi secara kimiawi atau fase
terikat. Sejauh ini yang digunakan untuk memodifikasi silika adalah hidrokarbon-hidrokarbon
non-polar seperti dengan oktadesilsilana, oktasilana, atau dengan fenil. Fase diam yang paling
populer digunakan adalah oktadesilsilan (ODS atau C18) dan kebanyakan pemisahannya adalah
fase terbalik.
Sebagai fase gerak adalah campuran metanol atau asetonitril dengan air atau dengan larutan
bufer. Untuk solut yang bersifat asam lemah atau basa lemah, peranan pH sangat krusial karena
kalau pH fase gerak tidak diatur maka solut akan mengalami ionisasi atau protonasi.
Terbentuknya spesies yang terionisasi ini menyebabkan ikatannya dengan fase diam menjadi
lebih lemah dibanding jika solut dalam bentuk spesies yang tidak terionisasi karenanya spesies
yang mengalami ionisasi akan terelusi lebih cepat.3)

3. Kromatografi penukar ion

KCKT penukar ion menggunakan fase diam yang dapat menukar kation atau anion dengan suatu
fase gerak. Ada banyak penukar ion yang beredar di pasaran, meskipun demikian yang paling
luas penggunaannya adalah polistiren resin.
Kebanyakan pemisahan kromatografi ion dilakukan dengan menggunakan media air karena sifat
ionisasinya. Dalam beberapa hal digunakan pelarut campuran misalnya air-alkohol dan juga
pelarut organik. Kromatografi penukar ion dengan fase gerak air, retensi puncak dipengaruhi
oleh kadar garam total atau kekuatan ionik serta oleh pH fase gerak. Kenaikan kadar garam
dalam fase gerak menurunkan retensi solut. Hal ini disebabkan oleh penurunan kemampuan ion
sampel bersaing dengan ion fase gerak untuk gugus penukar ion pada resin.

4. Kromatografi Pasangan ion

Kromatografi pasangan ion juga dapat digunakan untuk pemisahan sampel-sampel ionik dan
mengatasi masalah-masalah yang melekat pada metode penukaran ion. Sampel ionik ditutup
dengan ion yang mempunyai muatan yang berlawanan.2)
5. Kromatografi Eksklusi Ukuran
Kromatografi ini disebut juga dengan kromatografi permiasi gel dan dapat digunakan untuk
memisahkan atau menganalisis senyawa dengan berat molekul > 2000 dalton.
Fase diam yang digunakan dapat berupa silika atau polimer yang bersifat porus sehingga solut
dapat melewati porus (lewat diantara partikel), atau berdifusi lewat fase diam. Molekul solut
yang mempunyai BM yang jauh lebih besar, akan terelusi terlebih dahulu, kemudian molekul-
molekul yang ukuran medium, dan terakhir adalah molekul yang jauh lebih kecil. Hal ini
disebabkan solut dengan BM yang besar tidak melewati porus, akan tetapi lewat diantara partikel
fase diam. Dengan demikian, dalam pemisahan dengan eksklusi ukuran ini tidak terjadi interaksi
kimia antara solut dan fase diam seperti tipe kromatografi yang lain.

6. Kromatografi Afinitas
Dalam kasus ini, pemisahan terjadi karena interaksi-interaksi biokimiawi yang sangat spesifik.
Fase diam mengandung gugus-gugus molekul yang hanya dapat menyerap sampel jika ada
kondisi-kondisi yang terkait dengan muatan dan sterik tertentu pada sampel yang sesuai
(sebagaimana dalam interaksi antara antigen dan antibodi).
Kromatografi jenis ini dapat digunakan untuk mengisolasi protein (enzim) dari campuran yang
sangat kompleks.2)

Cara Kerja H
Mula-mula solven diambil melalui pompa. Solven ini dikemudian masuk ke dalam katup injeksi
berbutar, yang dipasang tepat pada sampel loop. Dengan pertolongan mikrosiring, sampel
dimasukan ke dalam sampel loop yang kemudian bersama-sama dengan solven masuk ke dalam
kolom. Hasil pemisahan dideteksi oleh detector, yang penampakannya ditunjukan oleh perekam
(pencatat = recorder). Tekanan solven di atur dengan pengatur dan pengukur tekanan. Pompa
pemasuk solven pada tekanan konstan hingga tekanan kurang lebih 4500 psi dengan laju alir
rendah, yakni beberapa milliliter per menit.
Rekorder menghasilkan kromatogram zat-zat yang dipisahkan dari suatu sampel. Tahap
pemekatan dengan ekstraksi solven dan penguapan untuk memperkecil volum sering kali
diperlukan sebelum pengerjaan sampel dengan HPLC. Hal ini terutama sering dilakukan untuk
analisis senyawa-senyawa hidrokarbon aromatic polisiklik (PAH) atau residu pestisida dalam
makanan.
Sebagai alternative lain, sampel air dapat di absorpsi oleh suatu adsorben padat (C8 atau C18
yang terikat pada silica gel), diikuti dengan desorpsi dalam suatu solven yang kemudian
langsung dimasukan kedalam kolom. Suatu solven dengan polaritas rendah, misalnya CH3 berair
yang secara bertingkat mengalami perubahan menjadi CH3OH murni, menjamin pemisahan
yang baik pada C-18 yang terikat pada silica gel.

Kelebihan HPLC
KCKT dapat dipandang sebagai pelengkap Kromatografi Gas (KG). Dalam banyak hal kedua
teknik ini dapat digunakan untuk memperoleh efek pemisahan yang sama membaiknya. Bila
derivatisasi diperlukan pada KG, namun pada KCKT zat-zat yang tidak diderivatisasi dapat
dianalisis. Untuk zat-zat yang labil pada pemanasan atau tidak menguap, KCKT adalah pilihan
utama. Namun demikian bukan berarti KCKT menggantikan KG, tetapi akan memainkan
peranan yang lebih besar bagi para analis laboratorium. Derivatisasi juga menjadi populer pada
KCKT karena teknik ini dapat digunakan untuk menambah sensitivitas detektor UV Visibel yang
umumnya digunakan.
KCKT menawarkan beberapa keuntungan dibanding dengan kromatografi cair klasik, antara
lain:
Cepat: Waktu analisis umumnya kurang dari 1 jam. Banyak analisis yang dapat diselesaikari
sekitar 15-30 menit. Untuk analisis yang tidak rumit (uncomplicated), waktu analisi kurang dari
5 menit bisa dicapai
Resolusi : Berbeda dengan KG, Kromatografi Cair mempunyai dua rasa dimana interaksi selektif
dapat terjadi. Pada KG, gas yang mengalir sedikit berinteraksi dengan zat padat; pemisahan
terutama dicapai hanya dengan rasa diam. Kemampuan zat padat berinteraksi secara selektif
dengan rasa diam dan rasa gerak pada KCKT memberikan parameter tambahan untuk mencapai
pemisahan yang diinginkan.
Sensitivitas detektor : Detektor absorbsi UV yang biasa digunakan dalam KCKT dapat
mendeteksi kadar dalam jumlah nanogram (10-9 gram) dari bermacam- macam zat. Detektor-
detektor Fluoresensi dan Elektrokimia dapat mendeteksi jumlah sampai picogram (10-12 gram).
Detektor-detektor seperti Spektrofotometer Massa, Indeks Refraksi, Radiometri, dll dapat juga
digunakan dalam KCKT
Kolom yang dapat digunakan kembali : Berbeda dengan kolom kromatografi klasik, kolom
KCKT dapat digunakan kembali (reusable). Banyak analisis yang bisa dilakukan dengan kolom
yang sma sebelum dari jenis sampel yang diinjeksi, kebersihan dari solven dan jenis solven yang
digunakan
Ideal untuk zat bermolekul besar dan berionik: zat-zat yang tidak bisa dianalisis dengan KG
karena volatilitas rendah , biasanya diderivatisasi untuk menganalisis psesies ionik. KCKT
dengan tipe eksklusi dan penukar ion ideal sekali untuk mengalissis zat-zat tersebut.
Mudah rekoveri sampel: Umumnya setektor yang digunakan dalam KCKT tidak menyebabkan
destruktif (kerusakan) pada komponen sampel yang diperiksa, oleh karena itu komponen sampel
tersebut dapat dengan mudah sikumpulkan setelah melewati detector. Solvennya dapat
dihilangkan dengan menguapkan ksecuali untuk kromatografi penukar ion memerlukan prosedur
khusus.
http://www.pdf.com/kromatografi-cair-kinerja-tinggi.html
2.7 APLIKASI HPLC DALAM KEHIDUPAN
Beberapa aplikasi HPLC dalam kehidupan :
o HPLC dengan prinsip kromatografi banyak digunakan pada industri farmasi dan pestisida.
o Zat- zat dengan kepolaran berbeda yaitu antara sedikit polar sampai polar dapat dipisahkan
dengan HPLC berdasarkan partisi cair-cair.
o Asam-asam nukleat dapat dipisahkan dengan kolom penukar ion yang dikombinasikan dengan
kolom butiran berlapis zat berpori
o Morfin, heroin dan semacamnya telah dapat dipisahkan dengan rezin Zipax-SAX.
o Dapat memisahkan vitamin-vitamin yang larut dalam air.
o Digunakan untuk menentukan berat molekul polimer dan masalah-masalah biokimia.
o Kromatografi cairan kinerja tinggi (KCKT/HPLC) digunakan untuk memisahkan golongan-
golongan takatsiri, misalnya terpenoid tiggi, segala jenis senyawa fenol, alkaloid, lipid dan gula.