Metode ekstraksi DNA dua langkah cepat dan PCR multipleks untuk deteksi dermatofit secara umum dan

Trichophyton rubrum secara khusus dikembangkan dan dievaluasi dengan DNA yang diambil dari budaya
murni dan dari kuku yang sakit secara klinis. DNA dari dermatofit berikut digunakan: Epidermophyton
floccosum, Microsporum audouinii, Microsporum canis, Microsporum gypseum, Microsporum nanum,
Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton rubrum, Trichophyton schoenleinii, Trichophyton soudanense,
Trichophyton terrestre, Trichophyton tonsuran, Trichophyton verrucosum, dan Trichophyton violaceum.

DNA manusia dan DNA dari Setelah jamur nondermatophyte dimasukkan sebagai kontrol: Alternaria,
Aspergillus niger, Candida albicans, Candida glabrata, Candida krusei, Malassezia furfur, Saccharomyces
cerevisiae, dan Scopulariopsis brevicaulis. SEBUAH total 118 sampel kuku yang diterima untuk mikroskopi
rutin dan kultur untuk dermatofit kemudian diuji oleh dua PCR secara terpisah dan dalam format multipleks.
Menggunakan DNA yang diekstraksi dari kultur murni dan PCR pan-dermatofit, PCR spesifik T. rubrum secara
berurutan dan dalam format multipleks yang terdeteksi dengan benar semua dermatofit dan tambahan
diidentifikasi T. rubrum.

Perbandingan diagnostik tradisional evaluasi (mikroskop dan kultur) sampel kuku dengan PCR pada DNA yang
langsung diekstraksi dari kuku menunjukkan Kesepakatan yang sangat baik antara PCR dan mikroskopi,
namun jumlah sampel dengan spesies dermatofit Identifikasi meningkat dari 22,9% menjadi 41,5%, terutama
karena identifikasi T. rubrum oleh PCR dalam sampel mikroskopik positif tapi kultur negatif. Sebagai
kesimpulan, tes diagnostik 5 jam ini ditunjukkan untuk meningkatkan tidak hanya kecepatan tetapi juga
sensitivitas penyelidikan untuk kuku dermatofitosis.

Metode
Strain dan isolat klinis. Dua belas strain jamur dibeli dari
Koleksi Nasional Jamur Patogen (United Kingdom). Isolat klinis
diperoleh dari Laboratorium Mikologi Institut Statens Serum
(SSI) (Denmark) (Tabel 1). Semua isolat klinis diidentifikasi dengan pengamatan
makro dan mikromorfologi

Sampel kuku klinis. Seratus delapan belas sampel kuku diterima untuk rutinitas
Pemeriksaan di Laboratorium Mikologi di SSI termasuk secara prospektif.
Satu-satunya kriteria inklusi adalah adanya sejumlah material yang cukup
untuk penyelidikan dengan mikroskop dan kultur langsung serta analisis PCR.
Persiapan DNA dari kultur dermatofit. Strain dan isolat klinis
dikultur dalam 2 ml media cair Sabouraud dengan sikloheksimida dan
kloramfenikol (SSI Diagnostika, Denmark) dan diinkubasi dengan gemetar untuk naik
sampai 8 hari pada suhu 27 C. Setelah panen, pelet disuspensikan kembali dalam 500 l lisis
buffer (400 mM Tris-HCl [pH 8.0], EDM 60 mM [pH 8.0], 150 mM NaCl, 1%
natrium dodesil sulfat) dan dibiarkan pada suhu kamar selama 10 menit. Selanjutnya, 150 l dari
kalium asetat (pH 4,8) ditambahkan dan tabung diendapkan dan disentrifugasi
(1 menit, 12.000 g). Supernatan dipindahkan ke tabung baru, dan a
volume sama alkohol isopropil ditambahkan. Pelet DNA dicuci
70% etanol Pelet DNA kering dilarutkan dalam 50 l TE (10 mM
Tris, 1 mM EDTA) buffer. Dua mikroliter DNA digunakan pada 20 sampai 50
l dari campuran PCR. Reagen tersebut, kecuali dinyatakan lain, dibeli
dari Sigma (Jerman).
Persiapan DNA dari sampel kuku. Untuk persiapan DNA (1), DNA dari
Sampel kuku diekstraksi dengan inkubasi 10 menit inkubasi pada 100 l
buffer ekstraksi (60 mM sodium bicarbonate [NaHCO3], 250 mM kalium
klorida [KCl] dan 50 mM Tris, pH 9,5) pada suhu 95 C dan penambahan 100 berikutnya
l buffer anti-penghambatan (2% bovine serum albumin). Setelah vortex mixing, ini
Larutan yang mengandung DNA digunakan untuk PCR.
PCR Pan-dermatofit. PCR Pan-dermatofit (1) adalah sebagai berikut. Berdasarkan
perbandingan (VectorNTI; InforMax, Inc.) urutan nukleotida yang berbeda
dermatofita di database nukleotida NCBI, satu set primer mendeteksi a
Fragmen DNA pengkodean kitin sintase 1, panDerm1 (5 GAAGAAGATTGT
CGTTTGCATCGTCTC3) dan panDerm2 (5 CTCGAGGTCAAAAGCACGC
CAGAG3), dirancang. Dua belas strain referensi dermatofit, 89 klinis
isolat dermatofit, 22 isolat jamur nondermatophyte, dan pemurnian manusia
DNA (Tabel 1) diuji. Campuran PCR terdiri dari 10 l PCR Ready Mix
(Sigma, Jerman), 0,2 l masing-masing primer (panDerm1 dan panDerm2) pada 100 M,
dan 4 l DNA dalam volume 20 l. PCR dilakukan di MWG-Biotech
pengendara termal. Profil suhu waktu untuk PCR adalah 45 siklus 30 s pada
94 C, 30 s pada suhu 60 C, dan 30 s pada suhu 72 C, didahului dengan denaturasi awal selama 10 menit.
pada suhu 95 C. Kehadiran produk PCR spesifik sekitar 366 bp itu
diperiksa menggunakan elektroforesis pada gel agarose 1% dan pewarnaan dengan etidium
bromida.
Trichoph

Trichophyton rubrum-specific PCR. Atas dasar penyelarasan (VectorNTI;

InforMax, Inc.) dari urutan spacer 2 transkripsi internal 2 di NCBI
database nukleotida, universal (uni, 5 TCTTTGAACGCACATTGCGCC3)
dan Trichophyton rubrum-specific (Trubrum-rev, 5 CGGTCCTGAGGGCGCT
GAA3) primer dirancang. Setiap reaksi dilakukan dalam volume 20
l dengan penambahan 4 l DNA dari mikroorganisme yang tercantum di atas, 0,2 l dari
masing primer (pada 100 M), dan 10 l PCR ReadyMix (Sigma, Jerman). Itu
amplifikasi dilakukan pada thermal cycler (MWG-Biotech, Germany) dan
terdiri dari satu siklus awal denaturasi selama 5 menit pada suhu 94 C dan 45 siklus
30 s pada suhu 94 C, 30 s pada suhu 60 C, dan 30 s pada suhu 72 C. Setelah siklus termal,
amplikon dielektroforesis dalam gel agarosa 2% dan diwarnai dengan
et

etidium bromida. Untuk menstandardisasi prosedur, konsentrasi DNA berbeda dan siklus termal
diuji (data tidak ditunjukkan). Multiplex PCR. PCR multipleks dilakukan dengan menggunakan
dua rangkaian spesifik primer yang dijelaskan di atas (primer panDerm1 dan panDerm2 dan uni
dan Primer trubrum-rev). Reaksi dilakukan pada kondisi yang berbeda; 0,2 mM masing-masing
primer digunakan. Profil temperatur suhu berikut ini dipilih: satu siklus awal denaturasi selama 5
menit pada suhu 94 C dan 45 siklus 30 detik pada suhu 94 C, 30 s pada suhu 60 C, dan 30
s ekstensi pada 72 C. Setelah siklus termal, amplikon diberi elektroforesis dalam gel agarosa
2% dan diwarnai dengan etidium bromida. Spesifisitas multipleks PCR diuji dengan DNA dari
semua strain yang tercantum dalam Tabel 1 dan dengan DNA manusia. Untuk standarisasi
prosedur, konsentrasi DNA dan siklus termal yang berbeda diuji (data tidak ditunjukkan). The
multiplex PCR (dan secara terpisah pan-dermatophyte dan T. rubrumspecific PCRs) kemudian
dievaluasi dengan menggunakan 97 spesimen kuku yang diterima analisis rutin