PENGENALAN ALAT SPEKTROFOTOMETER

KM Sitepu1, Riskawati2
1
Mahasiswa Prodi Ilmu dan Teknologi Pangan, UNHAS,
2
Asisten Mata Kuliah Aplikasi Teknik Laboratorium, Prodi Ilmu dan Teknologi Pangan, Universitas Hasanuddin

ABSTRAK

Spektrofotometer adalah alat yang digunakan untuk menganalisis suatu larutan berdasarkan
absorbansi larutan terhadap panjang gelombang tertentu. Analisis menggunakan
spektrofotometer memerlukan kurva standar sebagai acuan analisis sampel yang dibuat
berdasarka larutan standar. Larutan standar adalah larutan yang telah diketahui
konsentrasinya. Praktikum ini dilakukan untuk mengetahui prinsip kerja spektrofotometer,
proses pembuatan kurva standar dan pengujian protein metode lowry. Metode yang digunakan
adalah metode lowry. Larutan standar BSA dibuat dengan konsentrasi 100 ppm, 200 ppm, 300
ppm, 400 ppm, 500 ppm, dan 1000 ppm kemudian ditambahkan 2,75 ml larutan C dan 0,25 m
folin lalu larutan dianalisis menggunakan spektrofotometer. Hasil absorbansi larutan tersebut
dibuat kurva standarnya. Berdasarkan dua kurva standar yang dibuat, kurva standar pertama
memiliki nilai regresi 0,9802 sementara kurva standar kedua 0,2209.
Kata Kunci : Kurva standar, Larutan Standar, Metode Lowry, Spektrofotometer

I. PENDAHULUAN konsentrasinya secara pasti. Pembuatan

a. Latar Belakang
Spektrofotometer adalah alat pengukur
absorbansi suatu larutan yang didasari atas
hukum Lambert-Beeer yang menyatakan
bahwa apabila ada cahaya yang melewati
suatu media (larutan), sebagian cahaya akan
diserap, sebagian akan dipantulkan dan
sebagian akan diteruskan. Berdasarkan
panjang gelombangnya, spektrofotometer
terbagi menjadi spektrofotometer UV,
spektrofotometer visible (VIS), dan
spektrofotometer UV-VIS.
Analisis menggunakan spektrofoto-
meter membutuhkan kurva standar sebagai
acuan dalam menganalisis suatu sampel.
Kurva standar adalah kurva hubungan
antara absorbansi dengan konsentrasi.
Kurva standar digunakan sebagai acuan
dalam menganalisis suatu sampel.
Pembuatan kurva standar dilakukan dengan
membuat larutan standar. Larutan standar
adalah larutan yang diketahui
larutan standar membutuhkan ketelitian
yang tinggi agar hasil yang didapatkan tidak
bias.
Salah satu analisis suatu sampel yang
dapat dilakukan menggunakan spektrofoto-
meter adalah analisis kadar protein.
Analaisis kadar protein adalah menguji
suatu sampel yang diduga mengandung
protein. Salah satu metode pengujian
protein adalah metode Lowry. Metode
Lowry adalah metode pengujian protein
pada sampel menggunakan beebrapa
reagen, apabila dalam suatu sampel terdapat
protein, sampel akan berwarna biru.
Berdasarkan paparan di atas, dilakukanlah
praktikum pengujian kadar protein
menggunakan metode lowry dan
spektrofotometer.
b. Tujuan Praktikum
Tujuan dari praktikum ini adalah:
1. Mengetahui prinsip kerja
spektrofotometer
 2. Mengetahui proses pembuatan Tabel 08. Tabel Hasil Analisa
kurva standar Spektrofotometri
3. Mengetahui pengujian protein No. Konsentrasi Absorbansi I Absorbansi II
1 100 ppm 0,227 0,267
metode lowry 2 200 ppm 0,307 0,556
3 300 ppm 0,381 0,527
c. Rumusan Masalah 4 400 ppm 0,520 0,279
Analisis sampel menggunakan 5 500 ppm 0,540 0,573
6 600 ppm 0,671 0,564
spektrofotometer membutuhkan kurva Sumber: Data Primer Laboratorium Kimia Analisa dan
standar yang dibuat dengan membuat Pengawasan Mutu Pangan 2017.
larutan standar terlebih dahulu. Oleh
karena itu, dilakukan pengenceran agar Gambar 01. Kurva Standar I Larutan
absorbansi yang didapatkan tidak terlalu Standar BSA
tinggi.
Kurva Standar I
II. METODOLOGI PRAKTIKUM y = 0.0874x + 0.1352

Absorbansi
0.6 R = 0.9802
a. Alat dan Bahan 0.4
Alat yang digunakan pada praktikum 0.2
ini adalah gelas beaker (pyrex), pipet ukur 100 200 300 400 500 1000
(iwakii), bulb (eyela), spektrofotometer Konsentrasi (ppm)
(Sequoia Turner), kuvet, mikropipet
Sumber: Data Primer Laboratorium Kimia Analisa dan
(Eppendorf), tabung reaksi (pyrex), dan rak
Pengawasan Mutu Pangan 2017.
tabung.
Bahan yang digunakan pada praktikum Gambar 02. Kurva Standar II Larutan
ini adalah larutan A, larutan B, larutan C, Standar BSA
folin, BSA (Bouvin Serum Albumin) dan
aquades. Kurva Standar II
1 y = 0.0368x + 0.3322
Absorbansi

b. Prosedur Praktikum R = 0.2209

Larutan BSA dibuat dengan
konsentrasi 100 ppm, 200 ppm, 300 ppm,
400 ppm, 500 ppm dan 1000 ppm. Masing-
masing larutan BSA ditambahkan larutan C
sebanyak 2,75 ml lalu didiamkan selama 15
menit. Kemudian masing-masing larutan
BSA ditambahkan folin sebanyak 0,25 ml
kemudian diinkubasi selama 30 menit.
Larutan kemudian dianalisis menggunakan
spektrofotometer dengan menggunakan
panjang gelombang 650 nm.
III. HASIL DAN PEMBAHASAN
a. Hasil
Adapun data hasil yang diperoleh
dalam praktikum ini disajikan dalam tabel
berikut:
0.5
0
100 200 300 400 500 1000
Konsentrasi (ppm)
Sumber: Data Primer Laboratorium Kimia Analisa dan
Pengawasan Mutu Pangan 2017.
b. Pembahasan
Spektrofotometer adalah alat yang
digunakan untuk menganalisis suatu larutan
berdasarkan panjang gelombangnya. Kerja
spektrofotometer berdasarkan hukum
Lambert-Beer, bila cahaya monokromatik
melalui suatu media (larutan), maka
sebagian cahaya tersebut akan diserap,
sebagian dipantulkan, dan sebagian lagi
diteruskan. Spektrofotometer terdiri dari
beberapa bagian, yaitu sumber cahaya,
monokromator, wadah sampel (kuvet),
detektor dan visual display. Hal ini sesuai
dengan Gandjar (2007) yang menyatakan
bahwa spektrofotometer digunakan untuk
mengukur energy relatif jika energy
tersebut ditransmisikan, direfleksikan atau
diemisikan sebagai fungsi panjang
gelombang.
Spektrofotometer mengukur absor-
bansi pada suatu larutan. Absorbansi adalah
banyaknya cahaya atau energi yang diserap
oleh partikel-partikel dalam larutan.
Semakin banyak partikel yang terkandung
dalam sampel, maka absorbansi akan
semakin tinggi, begitu pun sebaliknya. Hal
ini sesuai dengan Neldawati (2013) yang
menyatakan bahwa Absorbansi adalah
perbandingan intensitas sinar yang diserap
dengan intensitas sinar datang. Cahaya yang
diserap oleh sampel diukur sebagai
absorbansi (A).
Kurva standar adalah kurva yang
menunjukkan hubungan antara absorbansi
dengan konsentrasi larutan. Larutan yang
digunakan adalah larutan yang menjadi
acuan analisis dan telah diketahui
konsentrasinya. Kurva standar yang bagus
jika nilai regresinya (R2) mendekati satu.
Hal ini sesuai dengan Vogel (1994) yang
menyatakan bahwa Metode spektro-
fotometri memerlukan dibuatnya suatu
kurva standar (disebut juga kurva referensi
atau kalibrasi) untuk konstituen yang akan
ditentukan.
Larutan standar adalah larutan yang
telah diketahui konsentrasi dan nilai
absorbansinya. Larutan standar dibuat
berdasarkan sampel yang akan dianalisis.
Perlakuan yang diberikan oleh larutan
standar harus sama dengan yang diberikan
oleh sampel. Hal ini sesuai dengan Day
(1999) yang menyatakan bahwa Larutan
standar adalah larutan yang konsentrasinya
sudah diketahui secara pasti.
Pada praktikum ini, dibuat dua kurva
standar dengan larutan yang berbeda namun
jenis dan konsentrasinya sama. Pada kurva
standar pertama, nilai regresinya (R2)
adalah 0,9802 sementara kurva standar
kedua nilai regresinya 0,2209. Kedua kurva
tersebut memiliki nilai regresi yang jauh
berbeda. Berdasarkan hukum Lambert-
Beer, absorbansi dialurkan terhadap
konsentrasi sehingga diperoleh suatu alur
garis lurus jika hukum Beer dipatuhi. Pada
kurva standar pertama, garis yang
menunjukkan hubungan antara absorbansi
dengan konsentrasi mendekati bentuk
linear, meskipun konsentrasi 400 ppm dan
500 ppm mengalami penurunan nilai
absorbansi.
Pada kurva standar kedua, data yang
dihasilkan tidak beraturan. Grafik
mengalami penurunan mulai dari
konsentrasi 200 ppm sampai 400 ppm
kemudian grafik meningkat pada
konsentrasi 500 ppm dan terjadi penururnan
pada konsentrasi 1000 ppm. Dari dua kurva
standar yang dibuat, kurva standar pertama
nilai regresinya mendekati angka satu
dibandingkan dengan kurva standar kedua
yang tidak mendekati angka satu, sehingga
kurva standar pertama lebih baik dari kurva
standar kedua. Adanya perbedaan bentuk
kurva standar diduga karena keterampilan
dalam menggunakan mikropipet yang
berbeda sehingga hasil yang didapatkan
berbeda.
Metode Lowry adalah salah satu
metode analisis protein. Metode lowry
merupakan pengembangan dari metode
biuret. Reagen yang digunakan pada
metode lowry adalah larutan A yang
merupakan larutan Na2CO3 dalam 100 ml
NaOH, larutan B yang merupakan larutan
Cu2SO4 dalam kalium natrium tartrat,
larutan C yang merupakan campuran
larutan A dan B, dan larutan folin. Metode
lowry akan menghasilkan warna biru
apabila pada sampel terdeteksi protein.
Metode lowry dapat dibuat menggunakan
sampel yang sedikit dibandingkan metode
biuret karena lebih sensitif 100 kali, namun
karena kesensitifannya metode lowry lebih
banyak interferensinya. Hal ini sesuai
dengan Soeharsono (2006) yang
menyatakan bahwa metode Lowry
mengkombinasikan pereaksi biuret dengan
pereaksi lain (Folin-Ciocalteauphenol)
yang bereaksi dengan residu tyrosine dan
tryptophan dalam protein. Reaksi ini
menghasilkan warna kebiruan yang bisa Soeharsono. 2006. Biokimia 1. Yogyakarta:
dibaca di antara 500 750 nm. UGM Press.
Vogel, A.I. 1994. Kimia Analisis
Kuantitatif Anorganik. Edisi 4.
KESIMPULAN DAN SARAN Jakarta: Penerbit buku kedokteran
EGC.
a. Kesimpulan
Kesimpulan setelah dilakukan praktikum
pembuatan larutan yaitu:
1. Spektrofotometer adalah alat yang
mengukur absorbansi suatu sampel.
Ketika cahaya melewati suatu
sampel, sebagian cahaya akan
dipantulkan, sebagian lagi akan
diserap dan sebagian lagi
diteruskan. Spektrofotometer
didasarkan hukum Lambert-Beer.
2. Kurva standar adalah kurva
hubungan antara absorbansi dengan
konsentrasi berdasarkan larutan
yang diketahui konsentrasinya.
3. Metode lowry merupakan pengujian
protein menggunakan beberapa
reagen, yaitu larutan A, larutan B,
larutan C dan folin. Pada metode
Lowry, sampel yang mengandung
protein akan berwarna biru.

b. Saran
Sebaiknya pada praktikum ini
menggunakan metode lain untuk pengujian
protein sebagai perbandingan antara satu
metode dengan metode lain. selain itu,
sebaiknya alat-alat yang digunakan tidak
mengalami kerusakan sehingga tidak
menyebabkan bias pada data hasil
praktikum.

DAFTAR PUSTAKA
Day, Underwood, (1999). Kimia Analisis
Kuantitatif. Jakarta: Erlangga
Gandjar, Ibnu Gholib. 2007. Kimia Farmasi
Analisis. Yogyakarta : Pustaka
Pelajar.
Neldawati., Ratnawulan., Gusnedi. 2013.
Analisis Nilai Absorbansi dalam
Penentuan Kadar Flavonoid untuk
Berbagai Jenis Daun Tanaman Obat.
Pillar of physics. Vol 2. Hlm 76-83.
JURNAL PRAKTIKUM
APLIKASI TEKNIK LABORATORIUM

PENGENALAN ALAT PEKTROFOTOMETER

NAMA : NURFATIAH ALAWIAH

NIM : G311 16 506
KELOMPOK : V (LIMA)
ASISTEN : RISKAWATI

LABORATORIUM KIMIA ANALISA DAN PENGAWASAN MUTU PANGAN

PROGRAM STUDI ILMU DAN TEKNOLOGI PANGAN
DEPARTEMEN TEKNOLOGI PERTANIAN
FAKULTAS PERTANIAN
UNIVERSITAS HASANUDDIN
MAKASSAR
2017