REKAYASA GENETIKA

Berikut ini dikemukakan arti rekayasa genetika (genetic enginecring) yang dikutip dari tiga
sumber

Rekayasa genetika adalah manipulasi sifat genetik suatu organisme dengan cara
mengintroduksi atau mengeliminasi gen-gen tertentu (Miclos, dkk, 1990).
Rekayasa genetika adalah manipulasi genetic dalam sel untuk menghasilkan suatu sifat
yang dikehendaki yang biasanya disebut teknologi rekombinan DNA (Rasmussen, dkk,
1990).
Rekayasa genetika adalah teknik mengubah konstitusi genetik sel atau individu dengan
cara pemindahan selektif, insersi atau dengan modifikasi gen balik yang individual maupun
yang berupa perangkat gen (Klug, dkk, 1994).

Berdasarkan kutipan tersebut,pada rekayasa genetika terdapat manipulasi atas materi

genetik dengan cara menambah atau menghilangkan gen tertentu. Berbagai fenomena genetik
alami jika dicermati dapat menjadi model alami dari teknik rekayasa genetika contohnya crossing
over, gene pick up, transduksi, dll. Fenomena ini terjadi pemutusan, penyambungan, serta
perpindahan bagian materi genetik yang dapat mengakibatkan penambahan atau perpindahan suatu
gen atau beberapa gen.

PROSES REKAYASA GENETIKA

Menurut Smith dan Byars (1990) terdapat berbagai teknik yang digunakan dalam teknik
rekayasa genetika meliputi teknik vektor, injeksi mikro, fusi protoplas, dan elektoporasi. Selain itu
klug menambahkan juga teknik kopresipitassi kalsium pospat dan endositosis dan dikenal pula
teknik proyektil mikro.

Transfer Vektor

Transfer vektor merupakan cara memasukan suatu gen ke sel baru dengan menggunakan
pembawa (carrier) khusus yang memanfaatkan proses alami seperti pada transfer DNA oleh
bakteri dan virus. Vektoryang digunakan adalah plasmid, bakteriofage dan cosmid (russel, 1992).
 Secara kimiawi vektor-vektor tersebut adalah molekul DNA. Sebagai vektor suatu molekul
DNA harus memiliki sifat-sifat yang harus dimiliki DNA seperti di bawah ini (Klug, dkk.,1994)

Molekul DNA mampu melekukan replikasi sendiri maupun replikasi segmen DNA
yang diinsersikan bebas dari replikasi kromosom sel inang dengan cara membuahi
suatu ori
Molekul DNA harus mengandung sejumlah tapak pemutusan enzim retrisi khusus
yang bermanfaat untuk insersi segmen-segmen DNA.
Molekul DNA harus membuhai suatu penenda yang dapat dimanfaatkan.
Molekul DNA harus mudah terbebas kembali ari sel inang.

Selain sifat-sifat itu ada pula sifat lain yang diharapkan (Old dan Primrose, 1989)

Betar molekul rendah

Adanya kemampuan untukmemberikan sifat fenotip yang dipilih dengan segera
pada sel inang.

a. Plasmid

Plasmid terbentuk secara alami invitro. Plasmid terdapat pada E. coli (plasmid RSF 2124
merupakan derifat dari plasmid ColE1). Plasmid-plasmid itu terdapat pada E.coli (plasmid
RSF2124 merupakan derivat dari plasmid CoE1).
b. Bakteriofag

Bakteriofag yang banyak digunakan dalam teknologi DNA rekombinan pada E.coli adalah
fag . Seluruh gen fag sudah diidentifikasi dan dipetakan urut-urutan genom secara keseluruhan
sudah diketahui. Seluruh derivat fag yang digunakan sebagai vektor transfer sudah direkayasa
sehingga hanya siklus titik saja. Derivat-derivat fag lebih dari 100 derivat yang dimanfaatkan
sebagai vektor dibuat dengan cara membuang berbagai bagian kelompok gen di daerah tengah.

Selain bakteriofag yang digunakan sebagai vektor, salah satunya adalah M 13. Materi
genetik pada M 13 berupa DNA unit tunggal. Jika M 13 menginfeksi suatu sel bakteri, DNA unting
tunggal bereplikasi menghasilkan suatu model DNA unting ganda yang disebut RF (Replikasi
Form). Molekul RF setara dengan plasmid dan DNA asing dapat diinsersikan ke tapak-tapak
pemutusan enzim retriksi tunggal yang ada pada genom. Susunan dari molekul RF terdiri dari
suatu unting tunggal (+) yang mengandung satu unting segmen DNA yang diinsersikan. Klon
DNA unting tunggal yang di hasilkan oleh M 13 dapat digunakan untuk pengurutan DNA atau
sebagai templet untuk perubahan urut-urutan klon akibat mutasi.

c. Kosmid (cosmid)

Kosmid adalah vektor yang dibangun di laboratorium memanfaatkan urut-urutan cos dan
fag yang berguna untuk pemasukan/pegumpulan kromosom ke dalam kepala fag dan
memanfaatkan pula urut-urutan (bagian tengah kosmid) untuk fungsi resistensi terhadap antibiotik
serta replikasi. Kosmid dirakit dan plasmid dan fag , contoh plasmid yang digunakan Pbr322.
d. Vektor ulang-alik (Shuttle vectors)

Selain vektor-vektor transfer seperti plasmid, bakterio fag , dan kosmid yang digunakan
untuk pengklonan DNA, vektor lain yang dimanfaatkkan untuk memanfaatkan untuk memasukkan
molekul-molekul DNA rekombinan ke dalam sel prokariotik maupun eukariotik. Vektor-vektor
semacam itu disebut vektor ulang alik atau shuttlr vectors. Vektor ulang alik atau shuttlr vectors
adalah vektor pengklon yang dapat bereplikasi di dalam dua atau lebih mahkluk hidaup inang.

3. Injeksi mikro, fusi protoplas, elektroporasi, kopresipitasi kalsium fosfat dan endositosis,
serta proyeksi mikro

Pada injeksi mikro menggunakan jarum mikroskopis,untuk memasukkan DNA melalui

membran sel sasaran, termasuk ke dalam inti sel. Pada fusi protoplas terjadi pelarutan dua
membran sel dari sel-sel yang berbeda sehingga dua sel dapat di gabung menjadi satu, misalnya
fusi antara sel sel-sel yang di kultur dengan protoplas bakteri yang mengandung DNA eksogen.
Fusi protoplas, suatu sistem transformasi yang memanfaatkan liposom yang tersusun dari suatu
lipida kationik. Pemanfaatan liposom sebagai suatu sistem transformasi atau transfeksi yang
disebut sebagai lipofeksi (lipofection).

Pada teknik eletroporasi menggunakan listrik untuk menciptakan lubang kecil di membran
sel yang akan dimanfaatkan untuk pemindahan DNA ke dalam sel. Berkenaan dengan
elektroporasi informasi dari Old dan Primrose (1989) menyebutkan bahwa pada pendedahan
singkat kejutan listrik berkekuatan antara 4000-8000 V, sel-sel memperoleh DNA eksogen dan
larutan sekitar (tampaknya melalui lubang-lubang yang terbentuk sesaat pada membran plasma)
dengan kejutan listrik akan meningkatkan frekuensi efisien transformasi (Potter dkk., 1984 dalam
Old dan Primrose, 1989).

Pada teknik kopresipitasi kalsium fosfat dan endositosis tampaknya butir-butir kopresipitas
kalsium fosfat dan DNA masuk ke dalam sel melalui endositosis fagositosis (Old dan Primrose,
1989). Pada teknik ini merupakan cara umum memasukkan suatu DNA ke dalam sel-sel mamalia.

Pada teknik proyeksi mikro, DNA ataupun RNA ditembakkan ke dalam sel (Klein dkk.,
1987 dalam Old dan Primrose 1989), teknik ini merupakan suatu cara yang sama sekali baru untuk
memasukkan asam nuklet ke dalam sel tumbuhan memanfaatkan kecepatan tinggi. Pada teknik
proyeksi mikro membutuhkan kultur sel ataupun perlakuan jaringan resipien.

Prosedur Dasar Teknologi DNA Rekombinan

Urutan proses yang menjadi prosedur dasar pada teknik DNA rekombinan yang diperantai
vektor akan dikemukakan lebih lanjut (Klug dkk., 1994).

Pembuatan fragmen DNA dengan bantuan enzim nuklease retriksi yang mengenal dan
memotong molekul DNA pada urut-urutan nukleotida yang spesifik

Segmen-segmen digabung ke molekul DNA lain dengan bantuan vektor. Vektor dapat
bereplikasi secara otonom sehingga memfasilitasi manipulasi dan identifikasi molekul
DNA yang baru terbentuk.

Vektor yang sudah terinsersi segmen DNA ditransfer ke suatu sel inang. Molekul DNA
rekombinan direplikasi menghasilkan berlusin-lusin yang disebut klon-klon.

Segmen-segmen DNA yang diklon dapat diambil dari sel inang.

Sel-sel inang yang mengandung DNA rekombinan mewariskan kepada seluruh sel turunan,
menghasilkan suatu populasi sel-sel identik yang semua membawahi urut-urutan yang
dklon.

Secara potensial, DNA diklon dapat ditranskripsikan, RNA-d ditranslasikan serta produk-
produk gen diisolasi dan di kaji.

Peran Enzim Endonuklease Retriksi

 Pada urutan pertama proses yang menjadi prosedur dasar teknik DNA rekombinan yang
diperantai oleh vektor enzim endonuklease dibutuhkan untuk memotong molekul DNA dalam
rangka pembuatan fragmen DNA. Molekul DNA rekombinan tidak dapat dibentuk tanpa abntuan
enzim endunuklease restiksi. Penanaman endunuklease restiksi di beri nama berdasarkan macam
makhluk hidup tempat enzim tersebut diisolasi secara konvensional digunakan sistem tiga huruf
dalam posisi huruf miring yang diikuti dengan suatu angka romawi.

Enzim endonuklease retriksi terbagi menjadi dua kelompok atau tipe (Russel, 1992). Tipe
I akan mengenali suatu urutan pasangan nukelotida yang spesifik pada DNA dan selanjutnya
memotong DNA pada suatu tapak tidak spesifik jauh dari urutan. Enzim endonuklease restiksi tipe
I tidak terlalu bermanfaat untuk pembentukan molekul DNA rekombinan. Enzim endonuklease
restiksi tipe II suatu urutan pasangan nukleotida spesifik pada DNA namun tipe ini memotong
DNA di dalam urutan (Russel,1992). Enzim endonuklease restriksi bermanfaat untuk
pembentukan molekul DNA rekombinan.

Untuk pengenalan ezim endonuklease restriksi tipe II memeliki suatu sumbu simetri yang
melewati titik tengah urutan pengenalan (Russel, 1992). Dalam urutan basa 5 3 pada unting
DNA sama dengan urutan basa 5 3 pada komplementernya.

Enzim endonuklease restriksi sudah diisolasi dari sejumlah besar strain bakteri yang
berbeda (Russel, 1992). Oleh karena itu setiap enzim memotong DNA pada suatu pasangan
nukleotida yang spesifik untuk enzim yang bersangkutan, jumlah potongan yang dibuat enzim
pada suatu molekul DNA tertentu tergantung pada jumlah berapa kali urutan pengenalan
ditemukan pada DNA.

Enzim endonuklease restriksi tipe II menghasilkan ujung-ujung lancip yang memiliki nilai
khusus pada pengklonal fragmen-fragmen DNA jika kedua ujung tajam hasil pemotongan bertemu
dalam larutan, maka akan berbentuk pasangan basa yang sempurna.

Peluang jumlah tapak pemutusan pada suatu DNA oleh enzim endonuklease restriksi II
dapat dihitung dalam kaitannya dengan jumlah pasangan nukleotida pada setiap urutan pengenal,
sepanjang keberadaan tiap pasangan nukleotida bersifak acak. Peluang jumlah tersebut
ditunjukkan pada tabel berikut.
 Pasangan nukleotida pada tapak Probabilitas kejadian
restriksi

4 (1/4)4 = 1 dalam 256 bp

5 (1/4)5 = 1 dalam 1024 bp

6 (1/4)6 = 1 dalam 4096 bp

8 (1/4)8 = 1 dalam 65, 476 bp

11 (1/4)11

Seleksi Klon Rekombinan

Pada urutan dari fragmen DNA restriksi yang ditranskripsikan menjadi RNA atau membuat
peta urut-urutan hasil hibridisasi dengan fragmen-fragmen restriksi. Oleh karena itu, Southern
mengembangkan suatu metode untuk mendeteksi fragmen-fragmen di dalam sel agarose yang
komplementer denga urutan RNA atau DNA tertentu, metode ini dikenal dengan Southern
Blotting. Pada inti metode ini mentransfer makro molekul dari gel yang berarti telah di pisahkan
secara elektroforesis ke suatu permukaan membran.
PERTANYAAN & JAWABAN

1. Bagaimana proses injeksi mikro, fusi protoplas, elektroporasi, kopresipitasi kalsium fosfat
dan endositosis, serta proyeksi mikro?

Jawab: Pada injeksi mikro menggunakan jarum mikroskopis,untuk memasukkan DNA

melalui membran sel sasaran, termasuk ke dalam inti sel. Fusi protoplas, suatu sistem
transformasi yang memanfaatkan liposom yang tersusun dari suatu lipida kationik.
Pemanfaatan liposom sebagai suatu sistem transformasi atau transfeksi yang disebut
sebagai lipofeksi (lipofection). Pada teknik elektroporasi menggunakan listrik untuk
menciptakan lubang kecil di membran sel yang akan dimanfaatkan untuk pemindahan
DNA ke dalam sel. Pada teknik kopresipitasi kalsium fosfat dan endositosis tampaknya
butir-butir kopresipitas kalsium fosfat dan DNA masuk ke dalam sel melalui endositosis
fagositosis. Pada teknik ini merupakan cara umum memasukkan suatu DNA ke dalam sel-
sel mamalia. Pada teknik proyeksi mikro, DNA ataupun RNA ditembakkan ke dalam sel,
teknik ini merupakan suatu cara yang sama sekali baru untuk memasukkan asam nuklet ke
dalam sel tumbuhan memanfaatkan kecepatan tinggi. Pada teknik proyeksi mikro
membutuhkan kultur sel ataupun perlakuan jaringan resipien.

2. Apakah yang membedakan antara enzim endonuklease retriksi?

Jawab: Tipe I akan mengenali suatu urutan pasangan nukelotida yang spesifik pada DNA
dan selanjutnya memotong DNA pada suatu tapak tidak spesifik jauh dari urutan. Enzim
endonuklease restiksi tipe I tidak terlalu bermanfaat untuk pembentukan molekul DNA
rekombinan. Enzim endonuklease restiksi tipe II suatu urutan pasangan nukleotida spesifik
pada DNA namun tipe ini memotong DNA di dalam urutan. Enzim endonuklease restriksi
tipe II memeliki suatu sumbu simetri yang melewati titik tengah urutan pengenalan. Dalam
urutan basa 5 3 pada unting DNA sama dengan urutan basa 53 pada
komplementernya.

3. Apa yang dimaksud dengan kosmid, jelaskan !

Jawab: Kosmid merupakan vektor yang dibangun di laboratorium memanfaatkan urut-

urutan cos dan fag yang berguna untuk pemasukan/pegumpulan kromosom ke dalam
kepala fag dan memanfaatkan pula urut-urutan (bagian tengah kosmid) untuk fungsi
resistensi terhadap antibiotik serta replikasi. Kosmid dirakit dan plasmid dan fag