FITRIA MAULITA

LUKAS ADI NUGROHO

TUGAS MANDIRI
MK TABM

1. Praktikum yang anda lakukan selama ini, terbatas pada isolasi DNA pada hewan.
Carilah protokol isolasi DNA pada tumbuhan dan jelaskan masing masing bahan
kimia yang digunakan.

2. Praktikum yang anda lakukan selama ini, terbatas pada isolasi protein pada hewan.
Carilah protokol isolasi protein pada tumbuhan dan jelaskan masing masing bahan
kimia yang digunakan.

CATATAN : Kerjakan secara kelompok ketiklah yang rapi, presentasikan senin minggu
depan
 PROTOKOL ISOLASI DNA TANAMAN
Modifikasi Doyle Doyle
Microtube Kosong
- Ditambahkan 10 l -mercaptoethanol
- Ditambahkan 600 l CTAB 2%
- Ditambahkan PVP
Microtube berisi larutan
- Ditambahkan potongan daun pisang 0,03 gr Perwakilan 1 orang
yang digerus bersama nitrogen cair
- Divortex
Microtube hasil vortex
- Diinkubasi pada suhu 60C selama 30 menit
- Divortex Perwakilan 1 orang
- Didinginkan pada suhu 4C selama 10 menit
- Ditambahkan C:I (24:1) sebanyak 600 l
- Divortex
Microtube hasil vortex
- Disentrifuga 12.000 rpm selama 15 menit (pastikan microtube dibuka-
tutup terlebih dahulu sebelum disentrifuga)
- Aqueous (berisi DNA) diambil sebanyak 400 l ke dalam microtube baru
Microtube baru berisi 400 l aqueous
Perwakilan
- Ditambahkan C:I (24:1) sebanyak 600 l
1 orang
- Divortex
- Disentrifuga 12.000 rpm selama 10 menit (pastikan microtube dibuka-tutup)
- Aqueous dipindahkan ke microtube baru sebanyak 200 l
Microtube berisi 200 l aqueous
- Ditambahkan 200 l isopropanol
- Dibolak-balik Perwakilan 1 orang
- Disentrifuga 12.000 rpm selama 15 menit
Microtube hasil sentrifugasi
- Dibuang supernatan
- Ditambahkan 200 l etanol 70%
- Disentrifuga 12.000 rpm, selama 5 menit Diulang 2 kali
- Dibuang supernatan
Microtube berisi pellet
- Dikeringkan pellet dengan cara dibalik selama 10 menit (hingga etanol kering)
- Ditambahkan 50 l buffer TE 1x , pH 8 sambil diresuspensi Perwakilan 1 orang
- Diketuk-ketuk microtube hingga larutan menjadi homogen
Sampel DNA
 ISOLASI PROTEIN TUMBUHAN
1. Menghancurkan daun sebanyak 0,1 gram dengan mortal dan pestle.
2. Memindahkan homogenate yang dihasilkan ke tabung Eppendorf dan menambahkan
sebanyak 300- 500 l buffer ekstrak dalam keadaan dingin.
3. Menginkubasikan homogenate dalam refrigerator selama 30 menit dengan dishaker sekali
selama 10 menit.
4. Mensentrifugasi homogenat pada 7.000 rpm selama 10 menit dengan suhu 4 oC. Supernatan
yang didapatkan dipindahkan ke tabung Eppendorf baru. Supernatan yang didapatkan sudah
mengandung protein kasar.
5. Mengukur kadar protein hasil ekstraksi.pertama membuat larutan blanko yang terdiri dari 200
l larutan Bradford dan ditambah 800 l akuades. Kedua membuat larutan sampel yang
terdiri dari 10 l protein sampel hasil isolasidan 200 l larutan Bradford, serta ditambah 790
l akuades.
6. Mengukur nilai OD protein sampel dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 595
nm.
7. Menghitung konsentrasi protein dengan rumus Y= 0,0465 X 0,0157 ( Y adalah nilai OD, X
adalah konsetrasi protein).
8. Menyimpan supernatan dalam refrigerator -20o C sampai dilakukan elektroforesis

FUNGSI :
1. -mercaptoethanol = memisahkan protein
2. CTAB = melisis dinding sel
3. PVP = mengurangi efek polifenol
4. Isopropanol = melarutkan sisa-sisa organel selain protein