Tugas individu : Praktikum Imunologi Farmasi

Mata acara praktik : Uji aktivitas makorfag dan

Dosen pengampu : Muthi Ikawati, M.Sc., Apt.
Kelas : 2015 B
Golongan : III
Topik : Optimization of Polysaccharide-Rich Fractionation from Morinda
citrifolia L. Fruit Based on Immunostimulatory Effect In Vitro
Kontributor:
1. Arief Adi Nugroho 15/382122/FA/10498
 OPTIMIZATION OF POLYSACCHARIDE-RICH FRACTIONATION FROM
Morinda citrifolia L. FRUIT BASED ON IMMUNOSTIMULATORY EFFECT IN
VITRO

Buah mengkudu yang memiliki nama latin Morinda citrifolia L. ternyata memiliki
banyak kandungan, yakni protein, skopoletin, polisakarida, asam askorbat, proxeronin dan
proxeroninase (Sjabana dan Bahalwan, 2002). Berdasarkan beberapa penelitian pada
kandungan polisakarida pada buah mengkudu yang telah dilakukan, memiliki khasiat utama
yaitu menstimulasi sistem imun atau dikenal dengan istilah immunomodulator/
immunostimulator. Mengingat banyak kandungan senyawa pada buah mengkudu, perlu
dilakukan pengoptimalan fraksinasi yang kaya akan polisakarida dengan 4 macam metode
isolasi polisakarida yang berbeda-beda. Mengingat banyak kandungan senyawa pada buah
mengkudu. Hal tersebut menjadikan dasar atas tujuan dilakukannya penelitian ini. Polisakarida
merupakan senyawa polar sehingga dapa dipresipitasi dengan pelarut etanol atau non polar
lainnya. 4 metode yang digunakan untuk mengisolasi polisakarida, antara lain :
1. Metode I berdasarkan prosedur isolasi Morinda citrifolia oleh Nayak dan Mengi
(2010).
2. Metode II berasal dari isolasi polisakarida yang menstimulasi sistem imun dari edible
fungus (Yin dkk, 2007)
3. Metode III berasal dari prosedur isolasi polysaccharide-rich fraction dari buah
mengkudu yang segar (Furusama dkk, 2003)
4. Metode IV diperoleh dari fraksinasi polisakarida dari Yu Ping feng Powder (Chen dkk,
2006)
Metode I, II, dan IV menggunakan sampel buah mengkudu kering yang sudah
ditumbukhalus, namun pada metode III menggunakan buah mengkudu mentah dan segar.
Metode IV terdiri dari 2 sub bagian yang dapat terbentuk presipitasi dari fraksinasi yaitu
presipitasi dengan 60% dan 95 % etanol.
Bahan-bahan yang digunakan yaitu buah mengkudu mentah berwarna putih kekuningan
dari fakultas farmasi, UGM, Yogyakarta beserta bahan-bahan yang digunakan untuk isolasi
dengan berbagai macam metode dan sel makrofag dan limfosit berasal dari mencit Balb/c
jantan in vitro diperoleh dari LPPT UGM.
Hasil yang diperoleh dari fraksi yang kaya akan polisakarida dari metode I, II, III, Iva dan
IVb yaitu 4,44%, 9,69%, 0,03%, 0,78% dan 2,32% b/b. hasil yang diperoleh sedikit berbeda
dari penelitian yang dahulu. hasil analisis kuantitatif total kandungan polisakarida yang
dihitung dengan metode Phenol Sulfuric Acid (Dextran) yaitu 25,98% b/b (metode Idan III),
28,50% b/b (metode II), 13,79% b/b (metode IVa) dan 32,58% b/b (metode IVb). Pad ametode
III, hasil yang diperoleh berbeda dan dilaporkan bahwa fraksi hampir seluruhnya terdiri atas
karbohidrat. Tingkat kemurnian fraksi rendah yang dihasilkan pada penelitian dapat
disebabkan tahap pemurnian yang digunakan kurang dibandingkan metode yang digunakan
oleh Furusawa dkk (2003). Uji kualitatif yang digunakan diantaranya test molisch yang
menghasilkan positif, tes reducing sugar ang menunjukkan hasil postif, tes kromofor pada
semua metode positif, uji protein tube dan fenolik menunjukkan hasil negative dan uji-uji yang
lain.
Uji aktivitas makrofag beserta isolasinya menggunakan larutan RPMI untuk menumbuhkan
kultur tersebut. Uji ini dilakukan dengan fagositosis lateks secara in vitro dan menggunakan
24 wells plate yang sebelumnya dimasukkan coverslips. Setelah diberi perlakuan, sel dikultur
selama 24 jam. Kemudian untuk pengamatannya diberi larutan Giemsa 2%v/v, difiksasi dulu
dengan methanol dan dicuci dengan air destilasi serta ditungu hingga kering. Lateks yang
dimakan / difagositosis oleh makrofag akan terlihat bening ketika dilakukan pengamatan
dengan inverted microscope. Lalu dilakukan pengamtan dan dihitung jumlah makrofag yang
memfagositosis lateks untuk menghitung indeks fagositosis makrofag. Kontrol positif yang
diugnakan adalah 10 L LPS (Liposakarida, Merck, Jerman). Hasil uji immunostimulator tiap
fraksi menunjukkan beragam variasi. Rasio fagositosis menunjukkan jumlah makroag dalam
100 makrofag yang mana secara aktif memfagositosis lateks. Indeks fagositosis menunjukkan
jumlah lateks yang difagositosis oleh 100 makrofag. Berdasakan beberapa penelitian, terdapat
hubungan aktivitas imunomodulator dari senyawa polisakarida berkolerasi positif dengan
peningkaan berat molekul senyawa polisakarida tersebut. Polisakarida mudah mengikat
senyawa fenolik secara intramolekuler dimana terjadi perubahan konformasi molekuler dari
karbohidrat. Dilihat dari tabel penelitian, metode III memiliki kandungan fenolik yang rendah
dan menunjukakn rata-rata aktivitas tinggi fagositosis oleh makrofag pada berbagai volume.
Sedangkan pada metode I memiliki kandungan senyawa fenolik yang tinggi sehingga data yang
ditunjukkan pada table yaitu aktivitas makrofag yang rendah.
Uji proliferasi dan isolasi limfosit menggunakan isolasi jaringan limpa dari mencit Balb/c
dan akan ditumbuhkan dalam kultur dengan media RPMI 1640. Sel limfosit akan dihitung
dengan hemositometer. Sel yang sudah diuji dan akan dikultur dalam incubator CO2 37oC.
suspense limfosit akan didistribusikan ke dalam 96 wells microplates yang sebelumnya
ditambahkan vaksin hepatitis B dan akan diinkubasi selama 24 jam dalam incubator yang sama.
Lalu ditambahkan 100L suspensi sampel dan diinkubasi selama 48 jam. Uji proliferasi
limfosit dengan menggunakan MTT assay. Denisitas optical ditentukan dengan microplate
reader pada 550nm. Control yang digunakan PHA 5g/L (10L) hasil yang diperloeh dari
penelitian ini yaitu metode IVb emnunjukkan potensi tinggi dalam proliferasi limfosit,
sedangkan metode III sebaliknya. Secara umum, aktivitas yang diamati tidak tergantung pada
konsentrsai untuk aktivitas makrofag sama seperti proliferasi limfosit, kecuali untuk metode
II.
Kesimpulan dari penelitian ini yaitu aktivitas tinggi fagositosis oleh terdapat pada ekstrak
sampel dengan menggunakan metode III, sedangkan stimulasi proliferasi limfosit tinggi
terdapat pada ekstrak sampel dengan menggunakan metode IVb.
Referensi
Chen, XT, Li Y, Wang HL, Cheng WM, Zhang L, Ge JF, 2006, Immunomodulating Effects of
Fractioned Polysaccharides Isolated from Yu-Ping-Feng-Powder in Cyclophosphamide-
Treated Mice, The American Journal of Chinese Medicine, 34(4): 631-641.
Furusawa E, Hirazumi A, Story S, Jensen J, 2003, Antitumour Potential of a Polysaccharide-
rich Substance from the Fruit Juice of Morinda citrifolia (Noni) on Sarcoma 180 Ascites
Tumour in Mice, Phytother Res, 17: 1158-1164.
Nayak S, Mengi S, 2010, Preliminary Physicochemical and Phytochemical Evaluation of
Morinda citrifolia Fruit Extractives, Int J Pharm and Pharm Sci, 2(4):150-154
Sasmito, Ediati, Triana Hertiani, Senda Kartika, Faradhyta Maharani Putri, Vania Setiawan
dan Longina Narastika, 2015, Optimization of Polysaccharide-Rich Fractionation from
Morinda citrifolia L. Fruit Based on Immunostimulatory Effect In Vitro, Indonesian J.
Pharm, 26(2) : 78 85.
Sjabana NA, Bahalwan, 2002, Khasiat dan Manfaat Mengkudu, cetakan I. Agromedia Pustaka,
Jakarta, pp.2-7.
Yin, Y, Fu, W, Fu, M, He, G, Traore L, 2007, The Immune Effect of Edible Fungus
Polysaccharides Compounds in Mice, Asia Pac J Clin Nutr, 16 (1) : 258-260.