A.

LATAR BELAKANG

Kebutuhan manusia akan pangan terus meningkat. Kebutuhan ini tidak akan

pernah berhenti dalam kehidupan makhluk hidup. Selain kebutuhan terhadap

pangan, kebutuhan terhadap mutu pangan pun terus meningkat. Kontaminan

mikrobiologis merupakan salah satu penyebab mutu pangan berkurang dan menjadi

tidak aman untuk dikonsumsi. Mutu pangan dapat dinilai dari tingkat kontaminan

mikroba patogen.

Escherichia coli pertama kali diidentifikasikan oleh dokter hewan Jerman,

Theodor Escherich dalam studinya mengenai sistem pencernaan pada bayi hewan.

Pada tahun 1885, beliau menggambarkan organisme ini sebagai komunitas bakteri

coli (Escherich 1885) dengan membangun segala perlengkapan patogenitasnya di

infeksi saluran pencernaan. Escherichia coli merupakan bakteri yang banyak

dijumpai pada pangan terutama pada pangan yang memiliki kandungan protein

tinggi seperti daging segar. Strain pathogen Escherichia coli dapat menimbulkan

penyakit diare berdarah , pembengkakan dan kelainan ginjal, demam, kelainan

saraf, bahkan kematian (Velcerc et al., 2002 dalam Usmiati dan Marwati, 2007).

Escherichia coli ATCC 25922 merupakan strain Escherichia coli yang sering

digunakan utnuk tes kerentanan antibiotik. Strain Escherichia coli ATCC 25922

tidak menghasilkan racun Shiga like toxin yang dapat menyebabkan diare akut pada

manusia.

Bakteri Asam Laktat (BAL) merupakan bakteri kelompok gram positif,

tidak berbentuk spora, dan dapat membentuk kokus maupun batang, yang

memproduksi asam laktat sebagai produk akhir dalam fermentasi karbohidrat. BAL

dapat bersumber dari makanan, feses, maupun air susu ibu (ASI). Berdasarkan

-2-
penelitian yang dilakukan Puspawati & Nocianitri, 2012, diperoleh 28 isolat bakteri

asam laktat dari ASI. Dari 28 isolat BAL tersebut, terdapat 9 isolat BAL yang

memiliki karatkeristik sebagai probiotik. Karakteristik dari 9 isolat BAL tersebut

adalah memiliki karakteristik gram positif, katalase negatif, bentuk koloni bulat,

batang pendek dan seperti huruf Y, mampu tumbuh pada suhu 10oC sampai suhu

45oC, tahan dan mampu tumbuh pada media yang mengandung garam NaCl,

bersifat homofermentatif (tidak memproduksi gas CO2 dari glukosa), tidak

membentuk dekstran dari sukrosa, tahan dan mampu tumbuh pada pH 2 sampai pH

6, mampu tumbuh pada kondisi lingkungan yang mengandung garam empedu dari

konsentrasi 0,2 mM sampai 0,6 mM.

BAL dapat digunakan sebagai probiotik. Salah satu sifat bakteri probiotik

adalah memiki kemampuan (aktivitas) antimikroba terhadap mikroba patogen.

Aktivitas antimikroba disebabkan oleh senyawa-senyawa metabolit yang

dihasilkan seperti asam organik, CO2, H2O2, diasetil, dan bakteriosin. Beberapa

strain bakteri asam laktat dapat memproduksi protein bakteriosin yang dapat

mencegah mikroba pembusuk dan patogen (Anon, 2009 dalam Ruzanna, 2011).

Bakteriosin merupakan peptida yang bersifat antimikroba yang diproduksi

oleh bakteri yang bersifat menghambat pertumbuhan bakteri lain. Beberapa galur

BAL dapat menghasilkan senyawa protein yang disebut bakteriosin, dan bersifat

bakterisidal terhadap bakteri gram positif dan gram negatif (Tahara et al., 1996

dalam Usmiati dan Marwati, 2007).

Pemakaian bakteriosin komersial sebagai pengawet sudah dilakukan di

beberapa negara dan diaplikasikan pada beberapa jenis makanan. Bakteriosin

merupakan senyawa protein yang dieksresikan oleh bakteri yang bersifat

-3-
menghambat pertumbuhan bakteri lain. Bakteriosin banyak diteliti karena

berpotensi sebagai pengawet makanan alami dan dapat diaplikasikan di bidang

farmasi.

Dari penelitian yang dilakukan Sundari (2014), diketahui bahwa BAL yang

diisolasi dari ASI memiliki aktivitas antimikroba yang berasal dari bakteriosin.

Namun belum diketahui waktu optimum dan daya penghambatannya. Berdasarkan

hal tersebut, maka perlu dilakukan peneelitian untuk mengetahui waktu produksi

bakteriosin yang optimum yang dihasilkan oleh bakteri asam laktat dan daya

penghambatannya terhadap bakteri Escherichia coli ATCC 25922.

B. RUMUSAN MASALAH

1. Kapan waktu optimum produksi bakteriosin dari BAL yang diisolasi

dari ASI?

2. Bagaimana daya penghambatan bakteriosin dari bakteri asam laktat

yang disolasi dari ASI terhadap bakteri Escherichia coli ATCC 25922?

C. HIPOTESIS

1. BAL yang diisolasi dari ASI akan memproduksi bakteriosin pada waktu

tertentu.

2. Bakteriosin yang dihasilkan BAL yang diisolasi dari ASI memiliki daya

penghambatan terhadap bakteri Escherichia coli ATCC 25922.

D. TUJUAN PENELITIAN

Penelitian ini bertujuan untuk :

1. Mengetahui waktu optimum produksi bakteriosin dari BAL yang

diisolasi dari ASI.

-4-
 2. Mengetahui daya penghambatan bakteriosin dari BAL yang diisolasi

dari ASI terhadap bakteri Escherichia coli ATCC 25922.

E. MANFAAT PENELITIAN

Manfaat dari penelitian ini adalah :

1. Sebagai informasi untuk mengetahui waktu optimum produksi

bakteriosin dari BAL yang diisolasi dari ASI serta daya

penghambatannya terhadap bakteri Escherichia coli ATCC 25922..

2. Bakteriosin dari BAL yang diisolasi dari ASI dapat diaplikasikan pada

produk pangan sebagai pengawet.

F. TINJAUAN PUSTAKA

G.1. Bakteriosin

Bakteriosin merupakan peptida antimikroba yang diproduksi oleh bakteri

yang bersifat menghambat pertumbuhan bakteri lain. Beberapa galur BAL dapat

menghasilkan senyawa protein yang disebut bakteriosin, dan bersifat bakterisidal

terhadap bakteri gram positif dan gram negatif (Tahara et al., 1996 dalam Usmiati

dan Marwati, 2007). Umumnya ukuran peptida bakteriosin berkisar antara 3 hingga

6 kDa.

Bakteriosin pertama kali ditemukan oleh A. Gratia pada tahun 1925, dengan

senyawa yang dikenal sebagai colicin yang berasal dari Eschericia coli V dan dapat

menghambat pertumbuhan Eschericia coli S. Bakteriosin dapat membunuh bakteri

dengan cara menghambat sintesis dinding sel bakteri (Jack, et al, 1995; Fimland, et

al, 2002; Quadri, 2002; dalam Evelina, 2012)

Pemakaian bakteriosin komersial sebagai pengawet sudah dilakukan di

beberapa negara dan diaplikasikan pada beberapa jenis makanan. Bakteriosin dapat

-5-
diproduksi oleh Lactococcus, Lactobacillus, dan Pediococcus yang diisolasi dari

berbagai bahan makanan, misalnya nisin diproduksi oleh Lactococcus lactis,

pediosin AcH dihasilkan oleh Pediococcus acidilactic. Beberapa kelebihan

bakteriosin sehingga potensial digunakan sebagai pengawet yaitu :

1. Bukan bahan toksik dan mudah mengalami degradasi oleh enzim

proteolitik karena merupakan senyawa protein.

2. Tidak membahayakan mikroflora usus karena mudah dicarna oleh

enzim saluran pencernaan.

3. Dapat mengurangi penggunaan bahan kimia sebagai pengawet pangan.

4. Stabil terhadap pH dan suhu yang cukup luas sehingga tahan terhadap

proses pengolahan yang melibatkan asam dan basa, serta kondisi panas

dan dingin (Cleveland, et al., 2001 dalam Usmiati dan Marwati, 2007).

Berdasarkan sifat kimia, struktur, dan fungsinya, bakteriosin dibagi menjadi

empat kelompok. Bakteriosin kelas I memiliki ciri ciri yaitu mempunyai berat

molekul lebih kecil dari 5 kDa, mengandung lanthionine dan methyl lanthionine.

Kelompok ini dibagi lagi menjadi dua tipe, yaitu tipe A dan tipe B berdasarkan

struktur kimia dan aktivitas antimikrobanya. Tipe A berbentuk ulir, bermuatan

positif dan aktivitasnya berhubungan dengan pembentukan pori pada membran sel.

Contoh dari tipe ini adalah, nisin dan lacticin (Lactococcus lactis), lactoccin

(Lactococcus sake), gallidermin (Staphylococcus gallinarum), dan epidermin

(Staphylococcus epidermidis). Sedangkan tipe B berbentuk globular, bermuatan

negatif atau netral, dan aktivitas antimikrobanya terkait dengan penghambatan

enzim spesifik. Contohnya, mersacidin (Bacillus subtilis), actagardin

-6-
(Actinoplasnes sp.), dan cinnamycin (Strepomyces cinnamones) (Nes et al., 1996;

dalam Suparjo, 2008).

Bakteriosin kelas II, mempunyai berat molekul lebih kecil dari 10 kDa, heat

stable, dan tidak mengandung asam amino lantionin. Kelas ini dibagi menjadi tiga

subkelas, yaitu bakteriosin yang mempunyai efek anti-listerial (IIa) contohnya

sakacin A dari bakteri Lactobacillus sake LB706, bakteriosin dengan dua peptida

(IIb) contohnya lactococcin M dari bakteri Lactococcus lactis, dan bakteriosin yang

disekresikan melalui sec-dependent contohnya acidocin B dari bakteri

Lactobacillus acidophilus M46 (Martinez et al., 2000; Oscarriz and Pisabarro,

2001; dalam Suparjo, 2008).

Bakteriosin kelas III ciri cirinya mempunyai berat molekul lebih dari 30

kDa dan heat labile. Sedangkan bakteriosin Kelompok IV, terdiri dari satu atau

lebih non proteinaceous tambahan, lipid atau kelompok-kelompok karbohidrat

yang diperlukan untuk aktivitas (Oscarriz dan Pisabarro, 2001; dalam Suparjo,

2008).

Struktur kimia yang beragam menyebabkan bakteriosin mempunyai

pengaruh yang berbeda terhadap fungsi fungsi sel. Bakteriosin gram-positif

merupakan senyawa aktif membran yang bekerja melalui pembentukan pori pada

sel target, menghambat aktivitas enzim, pertumbuhan spora, atau pembentukan

septum (Jack et al., 1995; dalam Evelina, 2012). Secara umum, bakteriosin juga

dapat mengganggu pembentukan asam nukleat, menyebabkan terganggunya

transfer informasi genetik yang selanjutnya akan menginaktivasi atau merusak

materi genetik sehingga terganggunya proses pembelahan sel untuk pembiakan

(Suparjo, 2008).

-7-
 Beberapa bakteriosin menjadi sangat sensitif dan menjadi inaktif dengan

perubahan pH. Bakteriosin sangat lebih toleran pada asam dibanding dengan pH

alkalis yang ekstrim. Kriteria kestabilan panas pada bakteriosin sangat sulit

ditetapkan, hal ini tergantung keadaan pemurnian (Suarsana, 2000; dalam Suparjo,

2008).

G.2. Bakteri Asam Laktat

Bakteri asam laktat (BAL) secara luas digunakan sebagai starter untuk

fermentasi minuman, daging, dan sayuran. BAL merupakan bakteri kelompok

gram positif, tidak membentuk spora, dan dapat membentuk kokus maupun batang,

serta memproduksi asam laktat sebagai produk akhir dalam fermentasi karbohidrat.

BAL berhubungan dengan fermentasi makanan dan pakan ternak, dan juga

merupakan bakteri yag secara normal berhubungan dengan kesehatan permukaan

mukosa manusia dan hewan (Salminen, et al., 2004; Nair and Surendran, 2005

dalam Ruzanna, 2011).

Beberapa strain BAL dapat memproduksi protein bakteriosin yang dapat

lebih mencegah mikroba pembusuk dan patogen (Anon, 2009 dalam Ruzanna,

2011). Strain BAL yang dapat digunakan sebagai probiotik antara lain berasal dari

genus Lactobacillus, Pediococcus, Leuconostoc, Lactococcus, dan Streptococcus

(Hutkins, 2006).

Genus Lactobacillus berbentuk batang yang bervariasi dari batang yang sangat

pendek sampai batang yang panjang. Genus bakteri ini juga bersifat mikroaerofilik,

katalase negatif, dan gram positif. Salah satu spesies dari Lactobacillus adalah

Lactobacillus acidophilus (Hutkins, 2006). Lactobacillus acidophilus merupakan

bakteri gram positif berbentuk kokus atau batang, bersifat non motil dan non spora

-8-
yang memproduksi asam laktat sebagai produk utama dari metabolisme fermentasi

dan menggunakan laktosa sebagai sumber karbon utama dalam memproduksi

energi (Buttris, 1997). Lactobacillus acidophilus dapat tumbuh baik dengan

oksigen ataupun tanpa oksigen, dan bakteri ini dapat hidup pada lingkungan yang

sangat asam sekalipun, seperti pada pH 4-5 atau dibawahnya (Sandine, 1979).

Genus Pediococcus berbentuk kokus berpasangan atau bergerombol, gram

positif, katalase negatif, dan bersifat mikroaerofilik (Hutkins, 2006). Salah satu

spesies dari Pediococcus adalah Pediococcus acidilactici. Pediococcus acidilactici

biasanya ditemukan dalam sayuran difermentasi , produk susu fermentasi dan

daging (Barros et al., 2001).

Genus Leuconostoc bersifat gram positif, selnya berbentuk kokus, tersusun

berpasangan atau berbentuk rantai, tidak bergerak, tidak berspora, katalase negatif,

anaerob fakultatif, bersifat non motil dan mesofil (Hutkins, 2006). Salah satu spesies

dari Leuconostoc adalah Leuconostoc mesenteroides. Leuconostoc mesenteroides

memiliki sifat khusus yaitu mampu hidup pada kadar gula, garam dan alkohol yang

tinggi serta mampu memfermentasi monosakarida dan disakarida. Leuconostoc

mesenteroides biasanya digunakan dalam proses fermentasi makanan seperti

sauerkraut, sosis, yogurt, kecap, dan acar (Hutkins, 2006).

Genus Streptococcus berbentuk kokus yang berpasangan atau berantai dengan

ukuran 0,7 0,9 m, bersifat gram positif, tidak membentuk spora, non motil, bersifat

aerobik maupun anaerobic fakultatif (Hutkins, 2006). Salah satu spesies dari genus ini

adalah Streptococcus thermophilus. Streptococcus thermophilus merupakan bakteri

yang sering digunakan dalam proses pembuatan yoghurt, selain Lactobacillus.

Bakteri satu ini juga digunakan sebagai starter kultur bagi makanan olahan susu

lainnya, misalnya saja pada keju mozarella (Awad et al., 2005).

-9-
 Genus Lactococcus bersifat anaerob fakultatif, non-mortil, dan suhu optimal

pertumbuhannya pada suhu 30oC (Hutkins, 2006). Memiliki bentuk kokus,

berpasangan atau rantai pendek. Salah satu spesies Lactococcus adalah Lactococcus

lactis. Lactococcus lactis adalah salah satu bakteri yang terlibat dalam pembuatan

yoghurt. Bakteri ini bahkan membedakan yoghurt dengan produk olahan susu jenis

lain. Bakteri ini akan bekerja sama dengan bakteri Lactobacillus bulgaricus dalam

memfermentasi susu segar untuk mengubahnya menjadi yoghurt (Anon, 2014b).

Bakteri Lactobacillus bulgaricus akan berperan dalam pembentukan aroma

yoghurt, sedangkan Lactococcus lactis berperan dalam pembentukan rasa dari

yoghurt (Anon, 2014b).

BAL termasuk mikroba yang aman jika ditambahkan dalam pangan karena

sifatnya tidak toksik dan tidak menghasilkan toksin. BAL sering juga disebut food

grade microorganism atau dikenal sebagai mikroba yang Generally Recognized As

Safe (GRAS) yaitu mikroba yang tidak berisiko terhadap kesehatan, bahkan

beberapa jenis bakteri tersebut berguna bagi kesehatan. BAL bermanfaat untuk

peningkatan kualitas higienitas dan keamanan pangan melalui penghambatan

secara alami terhadap mikroorganisme patogen. BAL dapat berfungsi sebagai

pengawet makanan karena mampu memproduksi asam organik, menurunkan pH

lingkungannya dan mengekskresikan senyawa yang mampu menghambat

mikroorganisme patogen seperti H2O2, diasetil, CO2, asetaldehid, isomer asam

asam-amino, dan bakteriosin (Kusmiati dan Malik, 2002).

G.3. Escherichia coli

Escherichia coli adalah bakteri gram negatif, berbentuk batang, tidak

berspora, serta tergolong dalam keluarga Enterobacteriaceae. Kebanyakan

- 10 -
Escherichia coli ditemukan sebagai flora normal di saluran usus manusia maupun

hewan. Selain itu Escherichia coli dapat mudah tumbuh pada berbagai media kultur

sederhana maupun sintetik sederhana dengan suhu optimum 370C dalam kondisi

aerobik (Sussman, 1997; dalam Kusuma, 2010).

Escherichia coli pertama kali diidentifikasikan oleh dokter hewan Jerman,

Theodor Escherich dalam studinya mengenai sistem pencernaan pada bayi hewan.

Pada tahun 1885, beliau menggambarkan organisme ini sebagai komunitas bakteri

coli (Escherich 1885) dengan membangun segala perlengkapan patogenitasnya di

infeksi saluran pencernaan. Nama Bacterium coli sering digunakan sampai pada

tahun 1991 ketika Castellani dan Chalames menemukan genus Escherichia dan

menyusun tipe spesies Escherichia coli.

Escherichia coli ATCC 25922 merupakan strain Escherichia coli yang tidak

menghasilkan racun Shiga like toxin. Keracunan Shiga like toxin pada manusia dapat

menyebabkan diare akut berdarah (Marlina dkk., 2009 dalam Juniathati, 2011). Strain ini

sering digunakan untuk tes kerentanan antibiotik dan relatif aman digunakan di

laboratorium.

Escherichia coli adalah anggota flora normal usus. Escherichia coli

berperan penting dalam sintesis vitamin K, konversi pigmen-pigmen empedu,

asam-asam empedu dan penyerapan zat-zat makanan. Escherichia coli menjadi

patogen jika jumlah bakteri ini dalam saluran pencernaan meningkat atau berada di

luar usus. Escherichia coli menghasilkan enterotoksin yang menyebabkan beberapa

kasus diare. Penyakit yang disebabkan oleh Escherichia coli yaitu infeksi saluran

kemih, diare, sepsis, dan meningitis.

G.4. Air Susu Ibu

- 11 -
 Air Susu Ibu (ASI) merupakan makanan alamiah yang ideal untuk bayi,

terutama pada bulan-bulan pertama, ASI mengandung semua gizi yang dibutuhkan

untuk membangun dan menyediakan energi bagi pertumbuhan dan perkembangan

bayi secara optimal. Disamping itu, ASI mengandung beberapa zat anti terhadap

penyakit-penyakit yang keberadaannya tidak diberikan melalui jalan lain

Didalam ASI terkandung nutrisi yang diperlukan bayi untuk pertumbuhan

dan mengandung zat-zat kekebalan yang sangat penting untuk mencegah timbulnya

penyakit, serta mudah dicerna oleh pencernaan bayi. Dengan demikian ASI adalah

makanan terbaik bagi bayi, oleh karena itu setiap bayi setidaknya memperoleh ASI.

ASI yang keluar dari kelenjar susu ibu pada dasarnya dapat dibagi menjadi

tiga macam ASI berdasarkan waktu keluarnya serta kandungan zat gizinya. ASI

yang keluar pertama kali setelah ibu melahirkan disebut kolostrum. Setelah

kolustrum tidak keluar lagi, ASI disebut sebagai ASI masa transisi dan setelah masa

itu tepatnya 10 hari kelahiran ASI disebut ASI matang ASI dewasa.

G.5. Komposisi ASI

ASI mengandung berbagai macam nutrisi yang sangat berguna bagi

pertumbuhan bayi. Secara garis besar ASI dibedakan dalam 3 stadium yaitu

kolostrum, air susu transisi/peralihan dan air susu matur, dimana komposisi nutrisi

ketiga stadium tersebut berbeda.

Kolostrum adalah ASI yang pertama kali keluar pada akhir kelahiran. Zat

Kolustrum mengandung tinggi protein, mineral, garam, vitamin A, nitrogen, sel

darah putih dan antibodi yang tinggi daripada ASI matur. Namun sedikit

- 12 -
mengandung lemak dan sedikit hidrat arang. Kolustrum dihasilkan oleh payudara

dari lima bulan pertama kehamilan pertama sampai tujuh hari setelah melahirkan.

Kolustrum berwarna kekuning-kuningan. Peralihan dari kolostrum ke susu biasa

(yang matang) membutuhkan waktu dua minggu. Komposisi ASI dapat dilihat pada

Tabel 1.

Tabel 1. Komposisi ASI (Anon, 2014a)

G.6. Mikroba Pada ASI

ASI banyak mengandung zat gizi protein, karbohidrat, lemak, vitamin,

mineral, imunnoglobulin, dan enzim. Selain zat gizi, pada ASI yang selama ini

dianggap steril terdapat berbagai jenis bakteri yang dapat menstimulasi sistem

kekebalan tubuh bayi. Sejak tahun 1975, sebagian peneliti sudah menguji

keberadaan bakteri di dalam ASI. Hasil serangkaian penelitian menunjukkan bahwa

terdapat bakteri baik (prebiotik), bakteri oportunis (bakteri yang dalam jumlah

cukup tidak berbahaya namun jika jumlahnya meningkat akan menimbulkan

penyakit), dan bakteri patogen di dalam ASI. Contoh bakteri baik yang ditemukan

pada ASI adalah Lactobacilli dan beberapa tipe Bifidobacterium. Bakteri berperan

penting untuk menstimulasi daya tahan tubuh, membantu pematangan imunitas,

- 13 -
serta melindungi tubuh dari infeksi. Selain peran dalam sistem daya tahan tubuh,

bakteri juga membantu produksi mikronutrien seperti vitamin.

G. KERANGKA KONSEP

Kerangka konsep dapat dilihat pada Gambar 1.

Bahan :
Isolat BAL dari ASI

Proses : Variabel yang diamati :

1. Uji konfirmasi Zona bening yang terbentuk
2. Produksi bakteriosin dari berbagai waktu
3. Aktivitas penghambatan inkubasi
terhadap bakteri
Escherichia coli ATCC
25922
4. Isolasi bakteriosin

Gambar 1. Kerangka Konsep Penelitian

- 14 -