Anda di halaman 1dari 29

LAPORAN PRAKTIKUM KULTUR JARINGAN TUMBUHAN

STERILISASI DAN PEMBUATAN MEDIA

Disusun oleh : Kelompok III


1. Nurul Husna (15308141049 )
2. Riska Wahyu Kurniasih (15308144001 )
3. Isnani Deyana Andini (15308144006 )
4. Aulia Devi Purnama (15308144012)
Biologi E

PROGRAM STUDI BIOLOGI


JURUSAN PENDIDIKAN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS NEGERI YOGYAKARTA
2018
BAB I

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Kultur jaringan merupakan salah satu metode yang biasa digunakan dalam
pengembangan Bioteknologi Tumbuhan. Prosedur dari metode ini terdiri dari
pemeliharaan dan pertumbuhan jaringan tanaman (sel, kalus, protoplas) serta organ
(batang, akar, embrio) pada kultur aseptis (in vitro). Metode kultur jaringan digunakan
untuk perbanyakan tanaman, modifikasi genotip (plant breeding), produksi metabolit
sekunder, pemeliharaan plasma nutfah, penyelamatan embrio (embryo rescue) (Hartmann
dkk, 1997). Prinsip dasar kultur jaringan adalah totipotensi sel, yang mengungkapkan
bahwa suatu sel atau jaringan tumbuhan dapat tumbuh menjadi individu yang sempurna
apabila berada dalam media dan lingkungan yang sesuai. Teknik kultur jaringan
tumbuhan dapat menghasilkan bibit tanaman yang seragam dalam jumlah besar dan
dalam waktu yang singkat, sehingga kultur jaringan merupakan cara yang praktis untuk
memproduksi bibit unggul dalam jumlah banyak dan cepat.
Tujuan dari kultur jaringan adalah untuk membiakkan bagian tanaman dalam
ukuran yang sekecil-kecilnya seperti organ tanaman, sel, jaringan, protoplas, kloropls dan
sebagainya sehingga menjadi banyak tanaman kecil (klon), oleh karena itu diperlukan
laboratorium khusus kultur jaringan yang selalu mengutamakan dan memperhatikan
tingkat sterilitas dari ruang-ruangnya, sehingga dapat terhindar dari kontaminasi mikrobia
yang tidak dikehadaki. Selain diperlukan laboratorium khusus untuk kultur jaringan, hal
lain yang tidak kalah penting untuk diperhatikan yaitu keseterilan dari peralatan dan
bahan-bahan yang digunakan selama melakukan kultur jaringan. Peralatan kulur jaringan
yang bermacam-macam dari segi bentuk dan ukuran sangat perlu diperhatikan
kesterilannya, karna sumber kontaminan utama dapat berasal dari peralatan yang
digunakan. Oleh sebab itu sebelum melakukan praktik kultur jaringan diperlukan tahap
preparasi yang berkegiatan untuk mensterilkan semua alat dan bahan yang akan
digunakan.
Agar bagian organ tanaman yang dikulturkan dapat tumbuh dengan baik, maka
terdapat beberapa syarat tumbuh yang perlu diperhatikan, yaitu media tumbuh steril
nutrisi tercukupi, segala kegiatan kultur dilakukan secara aseptis, kondisi iklim klimatik
harus sesuai dan eksplan berupa sel, jaringan atau irisan organ tanama yang digunakan
harus memiliki viabilitas yang tinggi. Media tumbuh buatan diperlukan eksplan untuk
mendukung terjadinya morfogenesis dan pertumbuhan. Dalam teknik kultur jaringan hal
lain yang perlu diperhatikan adalah komposisi media kultur dan zat pengatur tumbuh
yang tepat serta sumber eksplan yang digunakan untuk menghasilkan plantlet sangat erat
hubungannya selain faktor lainnya yaitu cahaya, suhu dan kelembaban pada lingkungan
sekeliling media (Rainiyati, 2009). George & Sherington, 1984 ; Saad & Elshahed, 2012
dalam Rindang Dwiyani (2015) menyebutkan bahwa secara umum media buatan tumbuh
eksplan mengandung komponen hara makro, hara mikro, gula, vitamin, myoinositol, zat
pengatur tumbuh, pemadat media, asam amin dan senyawa organik alami.
Berdasarkan penjelasan diatas, maka dilakukan praktikum kultur jaringan guna
mengenalkan mahasiswa pada tahapan preparasi kegiatan kultur jaringan termasuk dalam
kegiatan sterilisasi alat dan bahan, serta pembuatan media kulur jaringan.

B. Rumusan Masalah
1. Bagaimana cara sterilisasi alat yang digunakan dalam laboratorium kultur jaringan
tumbuhan?
2. Bagaimana cara membuat media kultur jaringan tumbuhan?

C. Tujuan
1. Mengetahui cara sterilisasi alat yang digunakan dalam laboratorium kultur jaringan
tumbuhan.
2. Mengetahui cara membuat media kultur jaringan tumbuhan.
BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

A. Kultur Jaringan Tumbuhan


Teknik kultur jaringan adalah suatu metode untuk mengisolasi bagian dari
tanaman, seperti protoplasma, sel, sekelompok sel, jaringan, dan organ, serta
menumbuhkannya dalam kondisi aseptik sehingga bagian-bagian tersebut dapat
memperbanyak diri dan beregenerasi menjadi tanaman lengkap (Gunawan, 1987).
Menurut Basri (2004), kultur jaringan merupakan suatu tehnik mengisolasi bagian
tanaman, baik berupa organ, jaringan, sel ataupun protoplasma dan selanjutnya
mengkultur bagian tanaman tersebut pada media buatan dengan kondisi lingkungan yang
steril dan terkendali. Bagian-bagian tanaman tersebut dapat beregenerasi hingga
membentuk tanaman lengkap (George dan Sheringtoh, 1983; Vasil, 1988).
Schwann dan Schleiden dalam Pierik (1987) menyebutkan bahwa, kultur in vitro
dapat diartikan sebagai bagian jaringan yang dibiakkan di dalam tabung inkubasi atau
cawan petri dari kaca atau material tembus pandang lainnya. Secara teoritis teknik kultur
jaringan dapat dilakukan untuk semua jaringan, baik dari tumbuhan, hewan, bahkan juga
manusia, karena berdasarkan teori Totipotensi Sel (Total Genetic Potential), bahwa setiap
sel memiliki potensi genetik seperti zigot yaitu mampu memperbanyak diri dan
berediferensiasi menjadi tanaman lengkap. Sel dari suatu organisme multiseluler di mana
pun letaknya, sebenarnya sama dengan sel zigot karena berasal dari satu sel tersebut,
setiap sel berasal dari satu sel.
Penggunaan kultur jaringan untuk pembiakan klonal didasarkan pada anggapan
bahwa jaringan secara genetik tetap stabil jika dipisahkan dari tanaman induk dan
ditempatkan dalam kultur (Setiawan 2008). Menurut Gamborg dan Phillips (1995, dalam
Nugroho 2005), aplikasi kultur organ, jaringan, dan sel tanaman memerlukan teknik yang
steril. Pemeliharaan pada kondisi steril atau aseptik sangat penting untuk keberhasilan
prosedur kultur jaringan.
Menurut Lestari (2011), teknologi kultur jaringan ini mempunyai beberapa
kelebihan bila dibandingkan dengan perbanyakan tanaman dari benih, antara lain :
1. Tanaman yang dihasilkan mempunyai keseragaman genetik yang lebih tinggi bila
dibandingkan dengan tanaman yang berasal benih.
2. Mempunyai sifat yang sama dengan induknya.
3. Mempunyai kecepatan multiplikasi yang tinggi.
4. Tidak terlalu membutuhkan tempat yang luas.
5. Pada beberapa jenis tanaman tertentu tanaman yang dihasilkan dari kultur jaringan ini
mempunyai kelebihan tahan terhadap penyakit, kesehatan dan mutu bibit lebih
terjamin.
6. Kecepatan pertumbuhan bibit lebih cepat dibandingkan dengan perbanyakan
konvensional.
7. Pengadaan bibit tidak tergantung musim.
8. Biaya pengangkutan bibit relatif lebih murah dan mudah
Ada empat faktor yang mempengaruhi pertumbuhan dan morfogenesis dalam
kultur in vitro, yaitu genotipe, media kultur, lingkungan tumbuh, dan eksplan yang
digunakan (George dan Sherrington,1984).

a. Eksplan
Menurut Yusnita (2003), penggunaan eksplan yang bersifat meristematik
umumnya memberikan keberhasilan pembentukan embrio somatik yang lebih tinggi.
Eksplan yang dapat digunakan berupa aksis embrio zigotik muda dan dewasa,
kotiledon, mata tunas, epikotil maupun hipokotil. Umur fisiologi, umur ontogenik,
ukuran eksplan, serta bagian tanaman yang diambil merupakan hal yang harus
dipertimbangkan dalam memilih eksplan yang akan digunakan sebagai bahan awal
kultur. Umumnya bagian tanaman yang digunakan sebagai eksplan merupakan
jaringan muda yang aktif tumbuh.
b. Media kultur
Media kultur jaringan dibedakan menjadi media dasar dan media perlakuan.
Media dasar adalah kombinasi zat yang mengandung hara esensial (makro dan
mikro), sumber energi dan vitamin. Dalam teknik kultur jaringan dikenal puluhan
macam media dasar. Media dasar yang paling sering dan banyak digunakan adalah
komposisi media dari Murashige dan Skoog (Gunawan, 1992).
Selain faktor jenis eksplan dan genotip tanaman, regenerasi tanaman juga
dipengaruhi oleh komposisi media yang digunakan. Masing-masing jenis eksplan/sel
dan genotip tanaman memerlukan komposisi media yang berbeda-beda (Pierik 1987).
Menurut Wattimena et al. (1992), media untuk menumbuhkan sel/eksplan tanaman
pada dasarnya berisi unsur hara makro, mikro, dan gula sebagai sumber karbon.
Selain itu, media kultur juga dilengkapi dengan zat besi, vitamin, mineral, dan zat
pengatur tumbuh.
c. Zat pengatur tumbuh
Zat pengatur tumbuh adalah persenyawaan organik selain nutrien yang dalam
jumlah sedikit (1 mM) dapat merangsang, menghambat, atau mengubah pola
pertumbuhan dan perkembangan tanaman (Moore, 1979 dalam Gunawan, 1992). Zat
pengatur tumbuh sangat berperan di dalam mengarahkan pertumbuhan sel tanaman.
Kombinasi zat pengatur tumbuh yang tepat akan menghasilkan pertumbuhan sel yang
optimal (Wattimena et al., 1992). Penggunaan zat pengatur tumbuh di dalam kultur
jaringan tergantung pada arah pertumbuhan jaringan tanaman yang diinginkan. Jenis
dan konsentrasi zat pengatur tumbuh yang tepat untuk setiap tanaman tidak sama,
tergantung pada genotip serta kondisi fisiologi jaringan tanaman (Lestari, 2011).
Menurut Gunawan (1992), dua golongan zat pengatur tumbuh dalam kultur jaringan
yang sangat penting adalah sitokinin dan auksin.
d. Genotip
Menurut Wattimena et al. (1992), genotip merupakan salah satu faktor yang
lebih dominan dalam mempengaruhi pertumbuhan dan morfogenesis tanaman dalam
kultur jaringan. Media dan kondisi fisik lingkungan tumbuh kultur seringkali berbeda
antara satu genus dengan yang lain, atau spesies tanaman tertentu dengan spesies yang
lain. Bahkan antar varietas yang memiliki sifat dekat membutuhkan lingkungan dan
media yang berbeda. Setiap jenis eksplan atau sel dan genotip tanaman memerlukan
komposisi media yang berbeda-beda.
B. Sterilisasi
Dalam melakukan kultur jaringan tumbuhan dalam media, diperlukan alat-alat
yang menunjang dalam usaha mengupayakan agar kultur tidak mengalami kontaminasi.
Saat melakukan kultur jaringan tumbuhan, peralatan laboratorium merupakan unsur
penting yang harus ada. Peralatan yang digunakan dalam laboratorium pun haruslah steril
agar dapat menunjang pekerjaan saat mengkultur jaringan tumbuhan dan hal tersebut
merupakan syarat mutlak. Artinya, pada bahan serta peralatan yang akan digunakan harus
bebas dari mikroorganisme yang tidak diinginkan seperti fungi yang dapat merusak media
pertumbuhan atau bahkan jaringan yang dikultur itu sendiri (Suriawira,2005).
Sterilisasi adalah proses dimana seluruh mikroorganisme hidup dihancurkan.
Mikroorganisme tersebut dapat dimatikan dengan uap atau pemanasan. Jika kita
mengatakan itu steril, berarti telah benar-benar bebas dari mikroorganisme. Secara umum,
sterilisasi merupakan keamanan laboratorium yang utama (Benson, 2001). Sterilisasi
adalah segala kegiatan dalam kultur jaringan harus dilakukan di tempat yang steril, yaitu
di laminar flow dan menggunakan alat-alat yang juga steril. Sterilisasi juga dilakukan
terhadap peralatan, yaitu menggunakan etanol yang disemprotkan secara merata pada
peralatan yang digunakan. Teknisi yang melakukan kultur jaringan juga harus steril
(Dwiyani, 2015).
Menurut Hadioetomo (1993), ada tiga cara yang umum digunakan dalam
sterilisasi yaitu :
1. Penggunaan panas
Bila panas digunakan bersama – sama dengan uap air maka disebut sterilisasi panas
lembut atau sterilisasi basah, bila tanpa kelembapan maka disebut sterilisasi panas
kering atau sterilisasi kering
2. Penggunaan bahan kimia
Sterilisasi kimiawi dapat dilakukan dengan menggunakan gas atau radiasi..
3. Penyaringan (Filtrasi)

Metode sterilisasi yang umum digunakan dalam laboratorium kultur jaringan ialah yang
menggunakan panas (Hadioetomo, 1993).

Mikroorganime hidup di segala tempat (tanah, air, udara, bahkan pada permukaan
tubuh). Keberadaan mereka yang ada di segala tempat dapat menyulitkan proses
pengkulturan jaringan tumbuhan untuk memperoleh kultur yang bebas kontaminasi dari
mikroorganisme lain (Hadioetomo, 1993). Salah satu faktor penentu keberhasilan kultur
jaringan adalah tahap sterilisasi. Kegiatan sterilisasi ini meliputi pada: sterilisasi pada
lingkungan kerja, sterilisasi pada alat-alat dan media tanam, dan terilisasi bahan tanaman
(eksplan). Kegiatan sterilisasi ini sangat penting untuk dilakukan, karena kontaminasi
pada kultur jaringan dapat berasal dari:

1. Eksplan, baik kontaminasi eksternal maupun internal.


2. Organisme kecil yang masuk ke dalam media, seperti semut.
3. Botol kultur atau alat-alat yang kurang steril.
4. Lingkungan kerja dan ruang kultur yang kotor.
5. Kecerobohan dalam bekerja (Tasumolang, 2013).
C. Media
Menurut Hendaryono dan Wijayani (1994), medium adalah tempat tumbuh
eksplan. Pemilihan medium menjadi faktor yang sangat penting dalam menentukan
keberhasilan kerja pada kultur in vitro karena tujuan dan kebutuhan nutrisi setiap
tanaman berbeda. Studi literatur sangat diperlukan untuk mengembangkan atau
memodifikasi medium kultur. Modifikasi dari medium kutur yang telah ada umumnya
didasarkan pada trial and error (Smith, 2000).
Ada dua bentuk media yaitu padat dan cair, pemilihan medium tergantung dari
tujuannya. Menurut Hendaryono dan Wijayani (1994), berikut ini adalah macam-macam
medium dasar, yaitu:

1. Medium MS (Murashige and Skoog), untuk semua macam tanaman terutama


tanaman herbaceous.
2. Medium B5 atau Gamborg, untuk suspensi sel.
3. Medium White, untuk kultur akar.
4. Medium VW (Vacin and Went), untuk medium anggrek.
5. Medium Nitsch and Nitsch, untuk kultur tepung sari dan kultur sel.
6. Medium Sohenk dan Hildebrandt, untuk tanaman monokotil.
7. Medium Woody Plant Medium (WPM), untuk tanaman berkayu.
8. Medium N6, untuk tanaman serealia terutama padi.
George & Sherington, 1984 ; Saad & Elshahed, 2012 dalam Rindang Dwiyani
(2015) menyebutkan bahwa secara umum media buatan tumbuh eksplan mengandung
komponen sebagai berikut :
a. Hara Makro
Hara makro adalah unsur hara esensial yang dibutuhkan dalam jumlah banyak
oleh tanaman, yaitu nitrogen (N), posfor (P), kalium (K), kalsium (Ca), magnesium
(Mg), dan sulfur (S).
b. Hara Mikro
Hara mikro adalah unsur hara esensial yang dibutuhkan dalam jumlah sedikit
oleh tanaman, yaitu ferum/zat besi (Fe), manganese (Mn), zinc (Zn), cobalt (Cu) dan
molybdenum (Mo). Baik hara makro maupun hara mikro keduanya diberikan dalam
bentuk garam inorganik.
c. Gula
Jenis gula yang umum digunakan dalam kultur in vitro adalah sukrosa,
jumlahnya berkisar 2-3% atau 20-30 gram/liter media. Selain sukrosa, beberapa jenis
gula lainnya adalah laktosa, galaktosa, maltose, glukosa dan fruktosa. Gula diberikan
pada media kultur sebagai sumber karbohidrat untuk respirasi karena tanaman kultur
bersifat heterotroph, tidak dapat melakukan fotosintesis untuk menghasilkan
karbohidrat.
d. Vitamin
Vitamin dibutuhkan tanaman sebagai katalisator dalam berbagai proses
metabolism. Vitamin digunakan untuk pertumbuhan sel serta proses diferensiasi sel
dan jaringan yang ditanam secara in vitro
e. Myo-inositol
Myo-inositol adalah senyawa golonga karrbohidrat yang ditambahakan pada
media kultur dalam jumlah sedikit dengan tujuan untuk menstimulassi pertumbuhan
sel pada banyak spesies tanaman.
f. Zat Pengatur Tumbuh
Umumnya ada dua golongan zat oengatur tumbuh (ZPT) yang digunakan
dalam kultur in-vitro, yakni golongan auksin dan sitokinin. ZPT golongan auksin
yang biasa digunakan dalam kultur in-vitro adalah indole-3-acetic acid (IAA), indole-
3-butricacide (IBA), 2,4-dichlorophenoxy-acetic acid (2,4-D) dan naphthalene-acetic
acid (NAA). ZPT dari golongan sitokinin adalah BA (Benzyladenine), BAP (6-
furfurylaminopurine) dan TDZ (thiadizuron). Rasio kedua golongan ZPT ini akan
mempengaruhi arah morfogenesis yang terjadi pada kultur.
g. Pemadat Media
Penambahan senyawa pemadat bertujuan untuk membuat media menjadi padat
maupun semi padat. Pemadat tersebut dapat berupa agar, agarose atau gellan gum.
Media kultur sebaiknya tidak terlalu padat agar penyerapan nutrisi dapat berjalan
baik. Demikian pula pada perkecambahan biji secra in-vitro, diperlukan media semi
padat untuk mempermudah terjadinya perkecambahan.
h. Asam Amino
Asama amino tidak selalu harus ditambahkan pada media kultur, namun
diperlukan untuk kultur sel dan kultur protoplas. Asam amino menyediakan sumber
nitrogen untuk pertumbuhan sel.
7. Senyawa Organik Alami
Senyawa organik alami seperti air kelapa, santan kelapa, jus/ekstrak tomat,
ekstrak pisang, ekstrak kentang dan lain sebagainya seringkali ditambahkan pada
media kultur untuk menstimulasi pertumbuhan sel/jarigan kultur. Kebutuhan akan
jenis dan jumlahnya tergantung spesies tanamannya.
BAB III

METODE

A. Waktu dan Tempat


1. Waktu
a. Sterilisasi alat : Rabu, 21 Febuari 2018
b. Pembuatan media : Rabu, 07 Maret 2018 dan Kamis, 08 Maret 2018
2. Tempat
Laboratorium Kultur Jaringan Tumbuhan, FMIPA UNY
B. Alat dan Bahan
Alat yang digunakan dalam praktikum adalah autoclave, keranjang autoclave,
timbangan analitik, kompor, panci, hot plate, magnetic stirrer, erlenmeyer 1000 ml,
micro pipet, tip pipet, botol jam beserta tutupnya, botol infuse, petridish kecil, gelas ukur
250 ml, pinset, sendok pengaduk, pisau, rak alat plastik, pH stick, plastik, kertas payung,
karet gelang, selotip dan tisu. Adapun bahan yang digunakan dalam praktikum adalah
makronutrien, besi (fe), mikronutrien, vitamin, myoinositol, sukrosa, agar, NaOH 1 N,
dan aquadest,
C. Cara Kerja
1. Sterilisasi Alat

Sterilisasi alat dilakukan dengan langkah sebagai berikut : pertama, alat yang
akan disterilkan disiapkan. Alat yang dibutuhkan diambil oleh masing-masing
kelompok sejumlah yang diperlukan. Botol infuse berjumlah …., botol jam berjumlah
6 buah setiap kelompok beserta tutup dan petridish kecil berjumlah …. Botol infuse,
botol jam beserta tutup, dan petridish dipastikan terlebih dahulu dalam keadaan yang
bersih. Jika kurang bersih, alat-alat yang akan digunakan harus dibersihkan terlebih
dahulu degan cara dicuci menggunakan sabun cuci kemudian dikeringkan dengan
ditiriskan dan dilap. Setelah bersih, bagian mulut botol infuse ditutupi menggunakan
plastik dan diikat menggunakan karet gelang hingga tertututp rapat. Sedangkan
petridish kecil ditata sebanyak enam petri enam petri¸ kemudian dibungkus
menggunakan kertas payung dan direkatkan menggunakan selotip. Sama halnya
dengan botol infuse dan botol jam, pinset dan sendok pengaduk yang akan digunakan
dalam praktikum disterilkan dengan langkah yang sama seperti sebelumnya yaitu
ditutup rapat satu sisi pinset maupun sendok pengaduk dengan menggunakan kertas
payung yang dililit hingga sisi satunya, kemudian sisi tersebut direkatkan
menggunakan selotip.
Jika alat-alat yang akan disterilkan telah siap untuk dilakukan sterilisasi, alat-
alat tersebut dimasukkan dan ditata di dalam keranjang autoclave. Apabila semua
sudah tertata di keranjang autoclave, keranjang autoclave kemudian dimasukkan ke
dalam autoclave dengan suhu 1210C tekanan 1 atm. Autoclave ditutup rapat dan
dikancing. Ditunggu proses autoclave nya ± 30 menit tiap satu kali autoclave.
2. Pembuatan media
Disiapkan semua alat dan bahan, kemudian dihitung banyaknya masing-
masing larutan stok yang dibutuhkan untuk membuat media dengan volume total 1,2
L menggunakan rumus pengenceran yaitu M1×v1= M2×v2. Aturan pemakaian larutan
stok makronutrient pada label adalah 40 𝑚𝑙⁄𝐿, sehingga untuk membuat medium NP
1,2 L dibutuhkan 48 ml larutan stok makronutrient. Aturan pemakaian larutan stok
besi pada label adalah 5 𝑚𝑙⁄𝐿, sehingga banyaknya larutan stok besi yang digunakan
untuk membuat 1,2 L media NP adalah 6 ml. Untuk aturan pemakaian larutan stok
mikronutrient pada label 2 𝑚𝑙⁄𝐿, sehingga untuk membuat media NP 1,2 L
dibutuhkan larutan stok mikronutrient sebanyak 2,4 ml. Pada label larutan stok
vitamin aturan pemakaiannya adalah 4 𝑚𝑙⁄𝐿, sehingga banyaknya larutan stok yang
dibutuhkan untuk membuat media NP 1,2 L sebanyak 4,8 ml. Sedangkan aturan
pemakaian larutan stok myoinositol adalah 40 𝑚𝑙⁄𝐿 sama dengan aturan pemakaian
larutan stok makronutrien. Maka banyaknya larutan stok myoinositol yang dibutuhkan
𝑔𝑟
adalah 48 ml. Untuk sukrosa (gula) aturan pemakaiannya adalah 20 ⁄𝐿, sehingga
untuk membuat media dengan volume 1,2 L dibutuhkan gula sebanyak 2,4 g
(lampiran 3).

Setelah takaran untuk masing-masing larutan stok, dan gula dihitung, langkah
selanjutnya adalah diambil aquadest sebanyak 400 ml dan dituangkan ke dalam
erlemeyer 1000 ml. Satu persatu larutan stok dimasukkan dengan berurutan sesuai
aturan yang ada, yaitu makronutrient, besi, mikronutrient, vitamin, myoinositol, gula,
dan agar-agar. Larutan stok maktonutrient dimasukkan ke dalam erlenmeyer 1000 ml
yang telah berisi 400 ml aquadest sebanyak 48 ml, kemudian dihomogenkan
menggunakan magnetic stirrer dan ditunggu hingga homogen. Setelah homogen
larutan stok berikunya dimasukkan, yaitu larutan stok besi sebanyak 6 ml, larutan
mikronutrient sebanyak 2,4 ml, larutan vitamin sebanyak 4,8 ml, larutan myoinositol
sebanyak 48 ml, dan gula sebanyak 24 gram. Masing-masing larutan stok dimasukkan
setelah larutan stok sebelumnya homogen (lampiran 1).

Setelah semua larutan stok dimasukkan ke dalam 400 ml aquadest dan sudah
homogen, larutan tersebut diukur volumenya menggunakan gelas ukur. Dari
pengukuran didapatkan volume sebanyak 525 ml. Kemudian, campuran dari larutan
tersebut dibagi ke dalam erlenmeyer, untuk pembuatan media NP tanpa hormon
volume 600 ml dalam botol jam, diambil larutan stok media sebanyak 262,5 ml.
Untuk pembuatan media NP tanpa hormon volume 200 ml dalam erlenmeyer, diambil
larutan stok media sebanyak 87,5 ml. Pembuatan media NP dengan penambahan 2,4
D volume 200 ml dalam erlenmeyer, diambil larutan stok media sebanyak 87,5 ml.
Kemudian untuk media NP dengan penambahan BA volume 200 ml dalam
erlenmeyer, diambil larutan stok media sebanyak 87,5 ml (lampiran 2).

Semua larutan media yang sudah dibagi ke erlenmeyer masing-masing


sebanyak 600 ml untuk pembuatan media NP tanpa hormon, 200 ml untuk disimpan,
200 ml untuk media NP dengan penambahan hormon 2,4 D dan 200 ml untuk media
NP dengan penambahan hormon BA disiapkan. Kemudian media NP tanpa hormon
(600 ml), diukur pH-nya. Jika pH asam, maka NaOH ditambahkan hingga pH kira-
kira menjadi 5,0-6,0. Lalu ditambah agar sebanyak 4,2 gram dan aquadest steril
hingga volume menjadi 600 ml. Pada media yang disimpan (200 ml), diukur pula pH-
nya. Jika pH asam, maka NaOH ditambahkan hingga pH kira-kira menjadi 5,0-6,0.
Kemudian ditambah agar sebanyak 1,4 gram dan aquadest steril hingga volume
menjadi 200 ml (lampiran 2).

Pada media NP dengan penambahan hormon 2,4 D (200 ml) ditambahkan


hormon 2,4 D sebanyak 4 ml. Lalu diukur pH-nya, jika pH terlalu asam maka NaOH
ditambahkan hingga pH menjadi 5,0-6,0. Setelah itu ditambah agar sebanyak 1,4
gram dan aquadest hingga volume menjadi 200 ml. Untuk media NP dengan
penambahan hormon BA (200 ml), hormon BA ditambahkan sebanyak 0,4 ml atau
400 mikroliter. Kemudian diukur pH-nya, jika pH terlalu asam maka NaOH
ditambahkan hingga pH menjadi 5,0-6,0. Setelah pH 5,0-6,0 larutan media ditambah
agar sebanyak 1,4 gram. dan aquadest hingga volume menjadi 200 ml (lampiran 2).
Langkah berikutnya adalah semua media dipanaskan, pemanasan media bisa
menggunakan hot plate dan magnetic stirrer hingga mendidih atau dididihkan
menggunakan panci dan kompor. Setelah mendidih, pada media NP tanpa hormon
(600 ml) dituang ke dalam 8 botol jam, dan ditutup dengan tutup plastik. Kemudian
penutup tersebut diikat menggunakan karet gelang. Untuk media NP tanpa hormon
(200 ml), media NP dengan penambahan 2,4 D dan media NP dengan penambahan
BA ditutup dengan tutup plastik, kemudian diberi label keterangan nama media.
Langkah terakhir, semua media disterilisasi menggunakan autoclave dengan suhu
1210C tekanan 1 atm selama ±20 menit (lampiran 2).
BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil

Tabel 1. Takaran Larutan Stok yang digunakan untuk Membuat Media New
Phaeleonopsis (NP) 1,2 L

No. Larutan Stok Ukuran/1000 ml (1 L) Ukuran/1200 ml (1,2 L)


1 Makronutrien 40 ml 48 ml
2 Besi 5 ml 6 ml
3 Mikronutrien 2 ml 2,4 ml
4 Vitamin 4 ml 4,8 ml
5 Myoinositol 40 ml 48 ml
6 Gula 20 gr 24 gr
7 Agar 7 gr 8,4 gr

Tabel 2. Media yang dibuat beserta jumlahnya

No. Media Jumlah


1. NP tanpa hormon (600 ml) 8 botol jam
2. NP tanpa hormon (200 ml) 1 erlenmeyer
3. NP + 2,4 D-2 ppm (200 ml) 1 erlenmeyer
4. NP + BA-2 ppm (200 ml) 1 Erlenmeyer

B. Pembahasan

Kultur jaringan merupakan suatu usaha untuk pengembangan tanaman secara


vegetatif yang dapat mengembangkan tanaman dalam jumlah yang besar dan dalam
waktu yang relatif singkat. Pengertian kultur jaringan sendiri adalah usaha untuk
mengisolasi, menumbuhkan dan meregenerasi protoplas, sel, jaringan dan organ tanaman
dalam keadaan aseptik di dalam media yang kaya nutrisi. Teknik kultur jaringan akan
berhasil bilamana memenuhi persyaratan dalam kultur jaringan yaitu media yang cocok,
kondisi lngkungan yang sesuai dan dalam kondisi aseptik atau steril (Basri, 2004).
Dari persyaratan tersebut maka diperlukan sterilisasi dalam melakukan kegiatan
kultur jaringan. Menurut Moeso Suryowinoto (2000), berhasil tidaknya kultur jaringan
sangat bergantung pada keadaan aseptik atau sterilnya komponen-komponen kultur
jaringan yang meliputi eksplan (bagian tanaman yang akan dikultur), peralatan yang
digunakan, pekerja yang melakukan kultur maupun ruangan yang digunakan untuk kultur
jaringan. Sterilisasi adalah suatu proses atau usaha untuk membebaskan atau mematikan
semua organisme yang terdapat pada atau di dalam suatu alat atau bahan yang digunakan
dalam pelaksanaan praktikum (Tjahtjo, 2004).
Praktikum sterilisasi alat dilaksanakan pada hari Rabu, 21 Februari 2018 dengan
tujuan untuk mengetahui cara sterilisasi alat yang akan digunakan untuk praktikum kultur
jaringan. Alat dan bahan yang digunakan dalam praktikum ini adalah autoclave, botol jam
beserta tutupmya, botol infuse, petridish kecil, pinset, sendok pengaduk, kertas payung,
plastik, selotip, dan karet gelang. Adapun jumlah dari botol jam beserta tutup yang
disterilisasi untuk setiap kelompok adalah 6 botol, botol infuse Botol, dan petridish Petri.
Sebelum melakukan sterilisasi, praktikan mengecek keadaan botol jam beserta tutup,
botol infuse, petridish kecil, pinset dan sendok pengaduk dari kotoran. Jika ada alat yang
kotor maka praktikkan harus membersihkannya terlebih dahulu dengan cara mengelap
menggunakan tisu atau mencucinya kemudian dibiarkan hingga kering. Apabila ada
kotoran yang masih menempel pada alat yang akan disterilisasi ditakutkan kotoran
tersebut menjadi kontaminan.
Setelah semua botol jam bersih, botol jam ditutup menggunakan tutupnya.
Sedangkan untuk botol infuse mulut botol ditutup plastik kemudian diikat menggunakan
karet gelang. Petridish ditata enam petri - enam petri kemudian dibungkus menggunakan
kertas payung dan direkatkan menggunakan selotip. Untuk pinset dan sendok dibungkus
juga menggunakan kertas payung dan bagian yang terbuka direkatkan menggunakan
selotip. Fungsi dari pembungkusan alat menggunakan plastik maupun kertas payung
adalah agar tidak terjadi kontak langsung dengan uap air autocalve. Petridish akan mudah
rusak (pecah) jika mengalami kontak langsung dengan uap air yang panas. Sedangkan
alat-alat seperti pisau scalpel dan pinset akan mudah berkarat jika berkontak langsung
dengan uap air.
Semua alat yang akan disterilisasi tersebut kemudian dimasukan ke dalam
keranjang autoclave dan ditata agar keranjang muat banyak. Sebelum memasukan
keranjang ke autoclave, praktikan melihat terlebih dahulu aquadest dalam autoclave.
Apabila banyaknya aquadest di dalam autoclave belum memenuhi atau kurang dari
volume aturan maka praktikkan harus menambahkan aquadest sebanyak volume yang
dibutuhkan. Setelah volume aquadest dilihat dan sudah memenuhi volume aturan,
keranjang dimasukkan dalam tabung autoclave dan di autoclave selama 30 menit pada
suhu 1210C tekanan 1 atm.
Cara sterilisasi yang dilakukan oleh praktikan telah sesuai dengan teori yang ada.
Menurut Sari dan Abdul (2012), sterilisasi peralatan yang terbuat dari gelas seperti botol
jam, botol infuse, dan petridish disterilkan dengan menggunakan autoclave. Sebelum
digunakan peralatan dicuci dan disikat dengan detergen kemudian dibilas air tawar,
tunggu kering, setelah itu ditutup rapat dengan kertas payung dan plastik Setelah itu
diatur rapi dalam autoclave, autoclave ditutup rapat dan dioperasikan pada suhu 121˚C
dengan tekanan 1 atm, selama 30 menit. Sterilisasi menggunakan autoclave termasuk
dalam proses sterilisasi secara fisik
Setelah autoclave berbunyi yang menandakan autoclave telah berjalan selama 30
menit, uap pada autoclave dikeluarkan secara perlahan supaya uap panas tidak mengenai
praktikan. Kemudian setelah semua uap keluar, alat-alat yang disterilisasi dikeluarkan
dari autoclave dan diletakkan dalam rak. Menurut Ni Putu, Ristiati (2000), Jika pada
autoclave alarm tanda selesai berbunyi, maka tunggu tekanan dalam kompartemen
turun hingga sama dengan tekanan udara di lingkungan (jarum pada preisure gauge
menunjuk ke angka nol). Kemudian klep-klep pengaman dibuka dan keluarkan isi
autoklaf dengan hati-hati. Jika dibuka saat tekanan masih tinggi, dikhawatirkan akan
terjadi sentakan mendadak di dalam autoclave yang mengakibatkan botol-botol media
pecah.
Prinsip dasar kultur jaringan adalah totipotensi sel, yang mengungkapkan bahwa
suatu sel atau jaringan tumbuhan dapat tumbuh menjadi individu yang sempurna apabila
berada dalam media dan lingkungan yang sesuai. Menurut Hendaryono dan Wijayani
(1994), medium adalah tempat tumbuh eksplan. Pemilihan medium menjadi faktor yang
sangat penting dalam menentukan keberhasilan kerja pada kultur in vitro karena tujuan
dan kebutuhan nutrisi setiap tanaman berbeda.

Agar bagian organ tanaman yang dikulturkan dapat tumbuh dengan baik, maka
terdapat beberapa syarat tumbuh yang perlu diperhatikan, yaitu media tumbuh steril
nutrisi tercukupi, kondisi iklim klimatik harus sesuai dan eksplan berupa sel, jaringan atau
irisan organ tanama yang digunakan harus memiliki viabilitas yang tinggi. Media tumbuh
buatan diperlukan eksplan untuk mendukung terjadinya morfogenesis dan pertumbuhan.
Dalam teknik kultur jaringan hal lain yang perlu diperhatikan adalah komposisi media
kultur dan zat pengatur tumbuh yang tepat serta sumber eksplan yang digunakan untuk
menghasilkan plantlet sangat erat hubungannya selain faktor lainnya yaitu cahaya, suhu
dan kelembaban pada lingkungan sekeliling media (Rainiyati, 2009). George &
Sherington, 1984 ; Saad & Elshahed, 2012 dalam Rindang Dwiyani (2015) menyebutkan
bahwa secara umum media buatan tumbuh eksplan mengandung komponen hara makro,
hara mikro, gula, vitamin, myoinositol, zat pengatur tumbuh, pemadat media, asam amin
dan senyawa organik alami.

Oleh karena itu dilakukan praktikum pembuatan media yang bertujuan untuk
mengetahui cara membuat media kultur jaringan tumbuhan. Praktikum ini dilaksanakan
pada hari Rabu, 07 Maret 2018 dan Kamis, 08 Maret 2018 di laboratorium kultur jaringan
tumuhan FMIPA UNY. Adapun alat dan bahan yang digunakan adalah erlenmeyer 1000
ml, gelas ukur, hot plate, sendok pengaduk, neraca analitik, magnetic stirrer, mikropipet,
tip pipet, botol jam, erlenmeyer, plastik, karet gelang, autoclave, larutan stok
makronutrien, besi, mikronutrien, vitamin, myoinositol, gula, agar-agar, aquadest, dan
NaOH 1 N.

Media yang dibuat merupakan media padat yaitu media NP. Media NP atau New
Phaleopnosis merupakan media dasar yang digunakan dalam kultur jaringan tumbuhan
anggrek. Pembuatan media NP ini dibuat 3 variasi yaitu media pertama adalah media NP
tanpa diberi hormon sebanyak 800 ml, media NP yang ditambahkan hormone 2,4 D-2
ppm sebanyak 200 ml, dan NP ditambahkan hormone BA-2 ppm sebanyak 200 ml.
Pembuatan media ini dilakukan dalam dua hari, pada hari pertama langkah yang
dilakukan adalah mulai dari perhitungan larutan stok yang digunakan, pencampuran
masing-masing bahan, hingga penambahan gula. Pada hari kedua, dilakukan penambahan
hormone, pengecekan pH, penambahan agar-agar, penambahan aquadest hingga volume
yang ditentukan, dan pembagian media pada erlenmeyer.

Pembuatan media ini dilakukan dengan membuat larutan stok media untuk
volume 1,2 L. Langkah awal yang dilakukan adalah menghitung takaran setiap larutan
stok makronutien, besi, mikronutrien, vitamin, myoinositol, gula, dan agar-agar yang
akan digunakan dalam pembuatan media volume 1,2 L. Perhitungan larutan stok yang
digunakan mengacu pada aturan pemakaian setiap larutan stok yang tertera di label pada
Erlenmeyer. Setelah masing-masing larutan stok dihitung takarannya, praktikkan
menyiapkan 400 ml aquadest dalam Erlenmeyer 1000 ml. Kemudian masing-masing
larutan stok dicampurkan dalam 400 ml aquadest satu per satu secara beruturan sesuai
dengan aturan. Urutan pertama adalah larutan stok makronutrien, kemudian besi, lalu
mikronutrien, vitamin, myoinositol, gula, dan agar-agar. Setiap memasukkan bahan ke
dalam 400 ml aquadest, ditunggu terlebih dahulu hingga bahan yang sebelumnya
homogen. Penambahan setiap bahan ini dilakukan dengan bantuan magnetic stirrer.
Dimasukkannya bahan satu persatu bertujuan agar bahan tersebut dapat tercampur
homogen dan setiap bahan tersebut bisa dipastikan ada dalam media dengan kata lain
bahan lupa ditambahkan atau tertinggal saat pembuatan media yang menyebabkan nutrisi
media berkurang atau tidak terpenuhi.

Unsur hara makro adalah hara yang dibutuhkan tanaman dalam jumlah yang
banyak. Hara makro tersebut meliputi, Nitrogen (N), Fosfor (P), Kalium (K), Kalsium
(Ca), Sulfur (S), Magnesium (Mg), dan Besi (Fe). Kegunaan unsur hara makro tersebut
dalam kultur jaringan menurut Qosim, 2006 dalam Sukarasa, 2007 adalah sebagai
berikut:

1. Nitrogen (N) diberikan dalam bentuk NH4NO3, NH2PO4, NH2SO4.


Berfungsi untuk membentuk protein, lemak, dan berbagai senyawa organik lain,
morfogenesis (pertumbuhan akar dan tunas), pertumbuhan dan pembentukan embrio,
pembentukan embrio zigotik dan pertumbuhan vegetatif.
2. Fosfor (P), diberikan dalam bentuk KH2PO4
Berfungsi untuk metabolisme energi, sebagai stabilitor membran sel, pengaturan
metabolisme tanaman, pengaturan produksi pati/amilum, pembentukan karbohidrat.
3. Kalium (K), diberikan dalam bentuk CaCl2.2H2O
Berfungsi untuk pemanjangan sel tanaman, memperkuat tubuh tanaman,
memperlancar metabolisme dan penyerapan makanan, ion kalsium dan mengatur pH
dan tekanan osmotik di antara sel.
4. Kalsium (Ca), diberikan dalam bentuk CaCl2.2H2O
Berfungsi untuk merangsang bulu-bulu akar, penggandaan atau perbanyakan sel dan
akar, pembentukan tabung polen, dinding dan membran sel lebih kuat, tahan terhadap
serangan patogen, mengeraskan batang, memproduksi cadangan makanan.
5. Sulfur (S)
Unsur S merupakan unsur yang penting untuk pembentukan beberapa jenis protein,
seperti asam amino dan vitamin B1. Unsur S juga berperan penting dalam
pembentukan bitil-bintil akar.
6. Magnesium (Mg), diberikan dalam bentuk MgSO4.7H2O.
Berfungsi untuk meningkatkan kandungan fosfat, pembentukan protein.
7. Besi (Fe), diberikan dalam bentuk Fe2(SO4)3;FeSO4.7H2O
Berfungsi sebagai penyangga (chelatin agent) yang sangat penting untuk menyangga
kestabilan pH media selama digunakan untuk menumbuhkan jaringan tanaman.

Unsur hara mikro adalah hara yang dibutuhkan dalam jumlah yang sedikit. Unsur
hara mikro ini merupakan komponen sel tanaman yang penting dalam proses
metabolisme dan proses fisioligi lainnya (Gunawan, 1992). Unsur hara mikro tersebut
diantaranya adalah :

1. Klor (Cl), diberikan dalam bentu KI.


2. Mangan (Mn), diberikan dalam bentuk MnSO4.4H2O.
3. Tembaga (Cu), diberikan dalam bentuk CuSO4.5H2O.
4. Kobal (CO), diberikan dalam bentuk CoCl2.6H2O.
5. Molibdenun (Mo), diberikan dalam bentuk NaMoO4.2H2O.
6. Seng (Zn), diberikan dalam bentuk ZnSO4.4H2O.
7. Boron (B), diberikan dalam bentuk H3BO3.

Vitamin yang paling sering digunakan dalam media kultur jaringan tanaman
adalah thiamine (vitamin B1), nicotinic acid (niacin), pyridoxine (vitamin B6). Thiamine
merupakan vitamin yang esensial dalam kultur jaringan tanaman karena thiamine
mempengaruhi pertumbuhan dan perkembangan sel. Vitamin C, seperti asam sitrat dan
asam askorbat, kadang-kadang digunakan sebagai antioksidan untuk mencegah atau
mengurangi pencoklatan atau penghitaman eksplan.

Mio-Inositol atau meso-insitol sering digunakan sebagai salah satu komponen


media yang penting, karena terbukti bersinergis dengan zat pengaturtumbuh merangsang
pertumbuhan jaringan yang dikulturkan (Yusnita, 2004). Dalam media kultur jaringan,
asam amino merupakan sumber nitrogen organik. Namun sumber N organik ini jarang
ditambahkan dalam media kultur jaringan, karena sumber sumber nitrogen utamanya
sudah tersedia dari NO3- dan NH4+. Asam amino yang sering digunakan adalah glisin,
lysin dan threonine. Penambahan glisin dalam media dengan konsentrasi tertentu dapat
melengkapi vitamin sebagai sumber bahan organik (Yusnita, 2004).

Gula digunakan sebagai sumber energi dalam media kultur, karena umumnya
bagian tanaman atau eksplan yang dikulturkan tidak autotrof dan mempunyai laju
fotosintesis yang rendah. Oleh sebab itu tanaman kultur jaringan membutuhkan
karbohidart yang cukup sebagai sumber energi. Menurut Gautheret dalam Gunawan
(1992), sukrosa adalah sumber karbohidrat penghasil energi yang terbaik melebihi
glukosa, maltosa, rafinosa. Namun jika tidak terdapat sukrosa, sumber karbohidrat
tersebut dapat digantikan dengan gula pasir. Gula pasir cukup memenuhi syarat untuk
mendukung pertumbuhan kultur. Selain sebagai sumber energi, gula juga berfungsi
sebagai tekanan osmotik media.

Setelah semua bahan dimasukkan dalam 400 ml aquadest dan tercampur secara
homogen, praktikkan mengukur volume dari larutan yang dibuat. Hal ini dilakukan untuk
menghitung pembagian volume larutan yang akan dibuat 3 variasi media. Volume yang
diperoleh dari pembuatan larutan adalah 525 ml. Dari 525 ml ini dihitung banyaknya
larutan untuk membuat masing-masing variasi media. Setelah dihitung, untuk pembuatan
media NP tanpa diberi hormon dengan volume 600 ml dibutuhkan larutan media
sebanyak 262,5 ml, media NP tanpa diberi hormone dengan volume 200 ml dibutuhkan
larutan media sebanyak 87,5 ml, media NP yang ditambah hormon 2,D-2 ppm volume
200 ml dibutuhkan larutan media 87,5 ml, dan untuk media NP yang ditambah hormon
BA-2 ppm volume 200 ml dibutuhkan larutan media sebanyak 87,5 ml.

Masing-masing volume larutan media yang telah dihitung diambil dan dituangkan
ke erlenmeyer. Media NP tanpa diberi hormon kemudian dilakukan tes pH menggunakan
pH stik. Apabila pH asam maka perlu dilakukan penambahan NaOH 1 N sampai pH
larutan media pada rentang 5,0-6,0. Keasaman (pH) adalah nilai yang menyatakan derajat
keasaman atau kebasaan larutan dalam air. Sel-sel tanaman yang dikembangkan dengan
teknik kultur jaringan mempunyai toleransi pH yang relatif sempit dengan titik optimal
antara pH 5,0 – 6,0 (Daisy, 1994). Faktor pH dalam media juga perlu mendapat perhatian
khusus. pH tesebut harus diatur sedemikian rupa sehingga tidak mengganggu fungsi
membran sel dan pH dari sitoplasma. Menurut Gamborg dan Shyluk, 1981 dalam
Gunawan, 1992, sel-sel tanaman membutuhkan pH yang sedikit asam berkisar antara 5,5–
5,8. Pengaturan pH, biasa dilakukan dengan dengan menggunakan NaOH (atau kadang-
kadang KOH) atau HCL pada waktu semua komponen sudah dicampurkan (Gunawan,
1992). Setelah larutan media NP tanpa diberi hormon dilakukan tes pH dan pH larutan
sudah dalam rentang 5,0-6,0 maka larutan media dapat ditambahkan agar-agar sesuai
takaran yang telah dihitung. Kemudian media ditambahkan aquadest hingga volume
sesuai dengan volume yang telah ditentukan.
Untuk media yang diberi tambahan hormon, sebelum dilakukan tes pH larutan
media ditambahkan hormon terlebih dahulu. Media NP 2,4 D-2 pp, (200 ml)
ditambahakan hormon 2,D sebanyak 4 ml. Hormon 2,D ini merupakan hormone auksin
yang memiliki rumus molekul C8H6Cl2O3 (Hogan, 2011). 2,4-D merupakan golongan
auksin sintesis yang mempunyai sifat stabil, karena tidak mudah terurai oleh enzim-enzim
yang dikeluarkan saat pemanasan pada proses sterilisasi. Sebagai salah satu senyawa yang
masuk ke dalam grup hormon auksin, maka 2,4-D dapat bekerja maksimum untuk
pembelahan dan pembesaran sel serta pembentukan akar (Hendaryono dan Wijayani,
1994). Setelah ditambahkan hormone 2,D larutan ini dites pH nya, sama seperti pada
media tanpa diberi hormon. Apabila pH larutan media sudah dalam rentang 5,0-6,0 maka
media dapat ditambahkan agar-agar dengan takaran sesuai perhitungan dan aquadest
hingga volume 200 ml.

Media NP BA-2 ppm (200ml) dites pH setelah ditambahkannya hormon BA


sebanyak 0,4 ml atau 400 mikrolite. BA merupakan salah satu hormone sitokinin, Zat
pengatur tumbuh BA (benzyl adenin) paling banyak digunakan untuk memacu
penggandaan tunas karena mempunyai aktivitas yang kuat dibandingkan dengan kinetin
(Zaer danMapes, l982). Hormon Benzyl Adenine (BA) mempunyai fungsi untuk
merangsang pembelahan sel (Schmulling, 2004). BA mempunyai struktur dasar yang
sama dengan kinetin tetapi lebih efektif karena BA mempunyai gugus benzil (George dan
Sherington, l984). Setelah ditambahkan hormone BA larutan ini dites pH nya, sama
seperti pada media sebelum-sebelumnya apabila pH larutan media sudah dalam rentang
5,0-6,0 maka media dapat ditambahkan agar-agar dengan takaran sesuai perhitungan dan
aquadest hingga volume 200 ml.

Menurut Suryowinoto (1990), dalam budidaya tanaman dengan menggunakan


teknik kultur jaringan, pemberian zat pengatur tumbuh dalam media juga perlu
diperhatikan karena mempengaruhi pertumbuhan dan perkembangan eksplan tersebut
menjadi bibit yang baru. Dalam kultur jaringan zat pengatur tumbuh auksin dan sitokinin
sangat berpengaruh. Auksin dan sitokinin adalah zat pengatur tumbuh yang sering
ditambahkan dalam media tanam karena mempengaruhi pertumbuhan dan organogenesis
dalam kultur jaringan dan organ.Hendaryono et al.(1994) mengungkapkan auksin dalam
budidaya jaringan berperan dalam perkembangan dan pembesaran sel, sehingga tekanan
dinding sel terhadap protoplasma berkurang. Hal ini mengakibatkan protoplast dapat
mengabsorbsi air di sekitar sel, sehingga sel menjadipanjang terutama sel-sel di bagian
maristem. Di sisi lain, auksin dapat juga mendorong terbentuknya sejumlah selyang
cukup banyak tetapi tidak membelah, kumpulandari sel ini yang disebut kalus. Sitokinin
merupakan turunan dari adenin, golongan ini berperan penting dalam pengaturan
pembelahan sel dan morfogenesis. Sitokinin digunakan untuk merangsang pembelahan
sel, terutama bila ditambahkan bersama-sama dengan auksin.

Eksplan yang dikulturkan harus selalu bersinggungan atau terkena dengan


medianya. Bahan pemadat media yang paling banyak digunakan adalah agar-agar. Agar-
agar adalah campuran polisakarida yang diperoleh dari beberapa spesies algae. Dalam
analisa unsur, diperoleh data bahwa agar-agar mengandung sedikit unsur Ca, Mg, K, dan
Na (Debergh, 1982 dalam Gunawan, 1992). Keuntungan dari pemakaian agar-agar adalah
:Agar-agar membeku pada suhu 45° C dan mencair pada suhu 100°C sehingga dalam
kisaran suhu kultur, agar-agar akan berada dalam keadaan beku yang stabil.

Setelah semua variasi media dibuat, langkah terakhir adalah memanaskan media
pada hot plate dan menghomogenkannya menggunakan magnetic stirrer hingga media
mendidih. Jika media telah mendidih, media tanpa diberi hormon (600 ml) dituangkan ke
dalam 8 botol jam kemudian ditutup menggunakan plastik dan diikat menggunakan karet
gelang. Semua media (NP tanpa hormone (200 ml), media NP 2,4 D-2 ppm (200 ml), dan
media NP BA-2 ppm (200 ml)) ditutup dengan tutup plastik kemudian diikat mengguakan
karet gelang. Langkah terakhir adalah sterilisasi media yaitu, semua media ditata pada
keranjang autoclave kemudian keranjang dimasukkan ke dalam autoclave dan di
autoclave dengan suhu 1210C tekanan 1 atm selama ±20 menit.
BAB V
PENUTUP

A. Kesimpulan
Berdasarkan praktikum yang telah dilaksanakann dapat disimpulkan bahwa
sterilisasi alat, bahan seperti aquadest dan media sangatlah penting dilakukan. Semua alat,
bahan, dan media yang digunakan untuk kultur jaringan harus disterilisasi terlebih dahulu
karena salah satu syarat dalam melakukan kultur jaringan tumbuhan adalah dalam kondisi
yang aseptik supaya tidak terdapat kontaminan dalam alat – alat tersebut. Setelah itu
semua alat yang akan disterilisasi di tata pada keranjang autoclave yang kemudian
dilakukan sterilisasi menggunakan autoclave pada suhu 1210C tekanan 1 atm selama 30
menit.
Berdasarkan kegiatan pembuatan media diketahui bahwa dilakukan pembuatan media
NP dengan melakukan penambahan makronutrient, mikronutrient, besi, myoinositol,
vitamin dan gula. Bahan-bahan berfungsi untuk menstimulir pembelahan sel epidermis
dan mengarah pada pembentukan protocorm jaringan supaya bergenerasi lebih lanjut dan
lebih cepat.

B. Saran
Didalam laboratorium kultur jaringan sebaiknya disediakan meja kerja yang
digunakan oleh praktikan untuk menulis log book, log book tersebut berisi cara membuat
media tertentu dan hasilnya bagaimana, jika hasilnya baik dapat diikuti oleh praktikan
disaat selanjutnya namun jika hasilnya kurang baik dilampirkan evaluasi dan saran untuk
praktikan yang nantinya akan melakukan praktikum tersebut. Log book ini sebagai arsip
laboratorium. Untuk teknik sterilisasi yang baik dan benar diharapkan dapat dipraktekan
oleh praktikan untuk menunjang proses melakukan pengkullturan jaringan tumbuhan
agar tidak terjadi kontaminasi pada kultur
DAFTAR PUSTAKA

Basri, Z., 2004. Kultur Jaringan Tanaman. Palu: Universitas Tadulako Press.
Dwiyani, R. 2015. Kultur Jaringan Tanaman. Denpasar: Pelawa Sari.
Gamborg, O. L., G. C. Phillips. 1995. Media Preparation and Handling, p 21-33.In Gamborg
and Phillips (Eds.). Springer-Verlag. Berlin
George, E. F. dan T. D. Sherrington. 1984. Plant Propagation by Tissue Culture. Handbook
and Directionary of Commercial Laboratories. England. pp. 285—302.
George, E.F and P.D Sherington, 1983. Handbook of Plant Propagation by Tissue Culture.
Easterm Press Ltd. England.
Gunawan, L. W. 1987 Teknik Kultur Jaringan Tumbuhan. PAU Bioteknologi IPB. Bogor.
Hadioetomo, R. S., 1993. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Gramedia. Jakarta.
Hartmann, H. T and D. E Kester., 1997. Plant Propagation. Prantice. New Jersey: Hall,
Engelwood Cliffs.
Hartmann, H.T., D.E. Kester, F.T. Davies Jr., and R.L. Geneve. 1997. Plant Propagation:
Principle And Practices. Sixth Ed.
Hendaryono, D. P. S dan Wijayani. 1994. Teknik Kultur Jaringan dan Petunjuk Perbanyakan
Tanaman Secara Vegetatif Modern. Yogyakarta: Kanisius.
Irianto, Koes. Mikrobiologi Menguak Dunia Mikroorganisme Jilid I. Bandung: CV. Y. Rama
Widya. 2007.
Lestari, Endang. G. 2011. Peranan Zat Pengatur Tumbuh dalam Perbanyakan Tanaman
melalui Kultur Jaringan. Jurnal AgroBiogen 7 (1).
Ni Putu, Ristiati. 2000. Pengantar Mikrobiologi Umum. Jakarta : Ditjen Dikti.
Pierik, R.L.M. l987.In Vitro Culture of Higher Plants. Martinus Nijhoff Publisher. London.
344p.
Rainiyati, Dede Martino, Gusniwati dan Jasminarni. 2009. THE DEVELOPMENT OF
BANANA (Musa sp.) CV. RAJA NANGKA VIA TISSUE CULTURE USING
SUCKER AND FLORAL MERISTEM EXPLANTS. Jurnal Agronomi Vol. 11 No. 1,
Januari – Juni 2009 ISSN 1410-1939.
Rainiyati, Lizawati, dan M. Kristiana. 2009. Peranan IAA dan BAP terhadap perkembangan
nodul pisang (Musa AAB) raja nangka secara in vitro. Jurnal Argronomi 13(1):51-
57.
Saad, A. I. M., dan A. M. Elshahed. 2012. Plant Tissue Culture Media.
http://www.intwechopen.com/ . 14 Maret 2018.
Smith, R.H. 2000. Plant Tissue Culture: Techniques and Experiments : Second Edition.
Academic Press. New York.
Suriawiria U. 2005. Mikrobiologi Dasar. Jakarta : Papas Sinar Sinanti
Suriawiria, Unus. 1986. Mikrobiologi Masa Depan Penuh Kecerahan Di Dalam
Pembangunan. Kumpulan Beberapa Tulisan dari Unus Suriawiria. Jurusan Biologi.
Bandung: ITB.
Vasil, I.K., 1988. Progress in The Regeneration and Genetic Multiplication of Cereal Crops.
Bio/Technol, 6:397-402
Wattimena, G. A., L. W. Gunawan, N. A. Mattjik, E. Syamsudin, N. M. A. Wiendi, dan A.
Ernawati, 1992. Bioteknologi Tanaman. Bogor PAU: Bioteknologi IPB.
Yusnita. 2003. Kultur Jaringan. Cara Perbanyakan Tanaman Secara Efisien. Agromedia
Pustaka. Jakarta. 105 hlm.
LAMPIRAN 1

LAMPIRAN 2

Aquadest diambil Larutan stok dimasukkan satu


Larutan kedua
sebanyak 400 ml dan persatu, yang pertama maktonutrien
adalah larutan
dituangkan ke dalam dimasukkan ke dalam Erlenmeyer
Besi
erlemeyer 1000 ml 1000 ml yang telah berisi 400 ml
aquadest

Larutan yang kelima Larutan yang Larutan yang


adalah Myoinositol, keempat ketiga adalah
dan kemudian gula Vitamin Mikronutriet

Dihomogenkan
menggunakan
magnetic stirrer
LAMPIRAN 2

Setelah mendidih, media NP


dituang ke dalam botol jam
Proses memanaskan media selain
dan botol infuse sesuai
dengan hotplate juga dengan
volume yang telah ditentukan
kompor. Pemanasan dilakukan
sampai berwarna bening

Media ditutup dengan tutup


plastik dan ditata pada
keranjang autoclave untuk
disterilisasi
LAMPIRAN 3

Perhitungan :

Menggunakan rumus pengenceran : M1×v1 = M2×v2

1. Larutan Stok Makronutien dan Myoinositol


Aturan pemakaian = 40 𝑚𝑙⁄1000 𝑚𝑙
M1×v1 = M2×v2
M1×1000 ml = 40 ml ×1200 ml
40 𝑚𝑙 ×1200 ml
M1 =
1000 𝑚𝑙
M1 = 48 ml
2. Larutan Stok Besi (Fe)
Aturan pemakaian = 5 𝑚𝑙⁄1000 𝑚𝑙
M1×v1 = M2×v2
M1×1000 ml = 5 ml ×1200 ml
5 𝑚𝑙 ×1200 ml
M1 =
1000 𝑚𝑙
M1 = 6 ml

3. Larutan Stok Mikronutrient (Fe)


Aturan pemakaian = 2 𝑚𝑙⁄1000 𝑚𝑙
M1×v1 = M2×v2
M1×1000 ml = 2 ml ×1200 ml
2 𝑚𝑙 ×1200 ml
M1 =
1000 𝑚𝑙
M1 = 2,4 ml
4. Larutan Stok Vitamin
Aturan pemakaian = 4 𝑚𝑙⁄1000 𝑚𝑙
M1×v1 = M2×v2
M1×1000 ml = 4 ml ×1200 ml
4 𝑚𝑙 ×1200 ml
M1 =
1000 𝑚𝑙
M1 = 6 ml
5. Gula
20 𝑔𝑟⁄
Aturan pemakaian = 1000 𝑚𝑙
M1×v1 = M2×v2
M1×1000 ml = 20 gr ×1200 ml
20 𝑔𝑟 ×1200 ml
M1 =
1000 𝑚𝑙
M1 = 24 gr
6. Agar
7 𝑔𝑟⁄
Aturan pemakaian = 1000 𝑚𝑙
M1×v1 = M2×v2
 Untuk volume 600 ml
M1×1000 ml = 7 gr ×600 ml
7 𝑚𝑙 ×600 ml
M1 =
1000 𝑚𝑙
M1 = 4,2 gr
 Untuk volume 200 ml
M1×1000 ml = 7 gr ×200 ml
7 𝑚𝑙 ×200 ml
M1 =
1000 𝑚𝑙
M1 = 1,4 gr