PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Kultur jaringan merupakan salah satu metode yang biasa digunakan dalam
pengembangan Bioteknologi Tumbuhan. Prosedur dari metode ini terdiri dari
pemeliharaan dan pertumbuhan jaringan tanaman (sel, kalus, protoplas) serta organ
(batang, akar, embrio) pada kultur aseptis (in vitro). Metode kultur jaringan digunakan
untuk perbanyakan tanaman, modifikasi genotip (plant breeding), produksi metabolit
sekunder, pemeliharaan plasma nutfah, penyelamatan embrio (embryo rescue) (Hartmann
dkk, 1997). Prinsip dasar kultur jaringan adalah totipotensi sel, yang mengungkapkan
bahwa suatu sel atau jaringan tumbuhan dapat tumbuh menjadi individu yang sempurna
apabila berada dalam media dan lingkungan yang sesuai. Teknik kultur jaringan
tumbuhan dapat menghasilkan bibit tanaman yang seragam dalam jumlah besar dan
dalam waktu yang singkat, sehingga kultur jaringan merupakan cara yang praktis untuk
memproduksi bibit unggul dalam jumlah banyak dan cepat.
Tujuan dari kultur jaringan adalah untuk membiakkan bagian tanaman dalam
ukuran yang sekecil-kecilnya seperti organ tanaman, sel, jaringan, protoplas, kloropls dan
sebagainya sehingga menjadi banyak tanaman kecil (klon), oleh karena itu diperlukan
laboratorium khusus kultur jaringan yang selalu mengutamakan dan memperhatikan
tingkat sterilitas dari ruang-ruangnya, sehingga dapat terhindar dari kontaminasi mikrobia
yang tidak dikehadaki. Selain diperlukan laboratorium khusus untuk kultur jaringan, hal
lain yang tidak kalah penting untuk diperhatikan yaitu keseterilan dari peralatan dan
bahan-bahan yang digunakan selama melakukan kultur jaringan. Peralatan kulur jaringan
yang bermacam-macam dari segi bentuk dan ukuran sangat perlu diperhatikan
kesterilannya, karna sumber kontaminan utama dapat berasal dari peralatan yang
digunakan. Oleh sebab itu sebelum melakukan praktik kultur jaringan diperlukan tahap
preparasi yang berkegiatan untuk mensterilkan semua alat dan bahan yang akan
digunakan.
Agar bagian organ tanaman yang dikulturkan dapat tumbuh dengan baik, maka
terdapat beberapa syarat tumbuh yang perlu diperhatikan, yaitu media tumbuh steril
nutrisi tercukupi, segala kegiatan kultur dilakukan secara aseptis, kondisi iklim klimatik
harus sesuai dan eksplan berupa sel, jaringan atau irisan organ tanama yang digunakan
harus memiliki viabilitas yang tinggi. Media tumbuh buatan diperlukan eksplan untuk
mendukung terjadinya morfogenesis dan pertumbuhan. Dalam teknik kultur jaringan hal
lain yang perlu diperhatikan adalah komposisi media kultur dan zat pengatur tumbuh
yang tepat serta sumber eksplan yang digunakan untuk menghasilkan plantlet sangat erat
hubungannya selain faktor lainnya yaitu cahaya, suhu dan kelembaban pada lingkungan
sekeliling media (Rainiyati, 2009). George & Sherington, 1984 ; Saad & Elshahed, 2012
dalam Rindang Dwiyani (2015) menyebutkan bahwa secara umum media buatan tumbuh
eksplan mengandung komponen hara makro, hara mikro, gula, vitamin, myoinositol, zat
pengatur tumbuh, pemadat media, asam amin dan senyawa organik alami.
Berdasarkan penjelasan diatas, maka dilakukan praktikum kultur jaringan guna
mengenalkan mahasiswa pada tahapan preparasi kegiatan kultur jaringan termasuk dalam
kegiatan sterilisasi alat dan bahan, serta pembuatan media kulur jaringan.
B. Rumusan Masalah
1. Bagaimana cara sterilisasi alat yang digunakan dalam laboratorium kultur jaringan
tumbuhan?
2. Bagaimana cara membuat media kultur jaringan tumbuhan?
C. Tujuan
1. Mengetahui cara sterilisasi alat yang digunakan dalam laboratorium kultur jaringan
tumbuhan.
2. Mengetahui cara membuat media kultur jaringan tumbuhan.
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
a. Eksplan
Menurut Yusnita (2003), penggunaan eksplan yang bersifat meristematik
umumnya memberikan keberhasilan pembentukan embrio somatik yang lebih tinggi.
Eksplan yang dapat digunakan berupa aksis embrio zigotik muda dan dewasa,
kotiledon, mata tunas, epikotil maupun hipokotil. Umur fisiologi, umur ontogenik,
ukuran eksplan, serta bagian tanaman yang diambil merupakan hal yang harus
dipertimbangkan dalam memilih eksplan yang akan digunakan sebagai bahan awal
kultur. Umumnya bagian tanaman yang digunakan sebagai eksplan merupakan
jaringan muda yang aktif tumbuh.
b. Media kultur
Media kultur jaringan dibedakan menjadi media dasar dan media perlakuan.
Media dasar adalah kombinasi zat yang mengandung hara esensial (makro dan
mikro), sumber energi dan vitamin. Dalam teknik kultur jaringan dikenal puluhan
macam media dasar. Media dasar yang paling sering dan banyak digunakan adalah
komposisi media dari Murashige dan Skoog (Gunawan, 1992).
Selain faktor jenis eksplan dan genotip tanaman, regenerasi tanaman juga
dipengaruhi oleh komposisi media yang digunakan. Masing-masing jenis eksplan/sel
dan genotip tanaman memerlukan komposisi media yang berbeda-beda (Pierik 1987).
Menurut Wattimena et al. (1992), media untuk menumbuhkan sel/eksplan tanaman
pada dasarnya berisi unsur hara makro, mikro, dan gula sebagai sumber karbon.
Selain itu, media kultur juga dilengkapi dengan zat besi, vitamin, mineral, dan zat
pengatur tumbuh.
c. Zat pengatur tumbuh
Zat pengatur tumbuh adalah persenyawaan organik selain nutrien yang dalam
jumlah sedikit (1 mM) dapat merangsang, menghambat, atau mengubah pola
pertumbuhan dan perkembangan tanaman (Moore, 1979 dalam Gunawan, 1992). Zat
pengatur tumbuh sangat berperan di dalam mengarahkan pertumbuhan sel tanaman.
Kombinasi zat pengatur tumbuh yang tepat akan menghasilkan pertumbuhan sel yang
optimal (Wattimena et al., 1992). Penggunaan zat pengatur tumbuh di dalam kultur
jaringan tergantung pada arah pertumbuhan jaringan tanaman yang diinginkan. Jenis
dan konsentrasi zat pengatur tumbuh yang tepat untuk setiap tanaman tidak sama,
tergantung pada genotip serta kondisi fisiologi jaringan tanaman (Lestari, 2011).
Menurut Gunawan (1992), dua golongan zat pengatur tumbuh dalam kultur jaringan
yang sangat penting adalah sitokinin dan auksin.
d. Genotip
Menurut Wattimena et al. (1992), genotip merupakan salah satu faktor yang
lebih dominan dalam mempengaruhi pertumbuhan dan morfogenesis tanaman dalam
kultur jaringan. Media dan kondisi fisik lingkungan tumbuh kultur seringkali berbeda
antara satu genus dengan yang lain, atau spesies tanaman tertentu dengan spesies yang
lain. Bahkan antar varietas yang memiliki sifat dekat membutuhkan lingkungan dan
media yang berbeda. Setiap jenis eksplan atau sel dan genotip tanaman memerlukan
komposisi media yang berbeda-beda.
B. Sterilisasi
Dalam melakukan kultur jaringan tumbuhan dalam media, diperlukan alat-alat
yang menunjang dalam usaha mengupayakan agar kultur tidak mengalami kontaminasi.
Saat melakukan kultur jaringan tumbuhan, peralatan laboratorium merupakan unsur
penting yang harus ada. Peralatan yang digunakan dalam laboratorium pun haruslah steril
agar dapat menunjang pekerjaan saat mengkultur jaringan tumbuhan dan hal tersebut
merupakan syarat mutlak. Artinya, pada bahan serta peralatan yang akan digunakan harus
bebas dari mikroorganisme yang tidak diinginkan seperti fungi yang dapat merusak media
pertumbuhan atau bahkan jaringan yang dikultur itu sendiri (Suriawira,2005).
Sterilisasi adalah proses dimana seluruh mikroorganisme hidup dihancurkan.
Mikroorganisme tersebut dapat dimatikan dengan uap atau pemanasan. Jika kita
mengatakan itu steril, berarti telah benar-benar bebas dari mikroorganisme. Secara umum,
sterilisasi merupakan keamanan laboratorium yang utama (Benson, 2001). Sterilisasi
adalah segala kegiatan dalam kultur jaringan harus dilakukan di tempat yang steril, yaitu
di laminar flow dan menggunakan alat-alat yang juga steril. Sterilisasi juga dilakukan
terhadap peralatan, yaitu menggunakan etanol yang disemprotkan secara merata pada
peralatan yang digunakan. Teknisi yang melakukan kultur jaringan juga harus steril
(Dwiyani, 2015).
Menurut Hadioetomo (1993), ada tiga cara yang umum digunakan dalam
sterilisasi yaitu :
1. Penggunaan panas
Bila panas digunakan bersama – sama dengan uap air maka disebut sterilisasi panas
lembut atau sterilisasi basah, bila tanpa kelembapan maka disebut sterilisasi panas
kering atau sterilisasi kering
2. Penggunaan bahan kimia
Sterilisasi kimiawi dapat dilakukan dengan menggunakan gas atau radiasi..
3. Penyaringan (Filtrasi)
Metode sterilisasi yang umum digunakan dalam laboratorium kultur jaringan ialah yang
menggunakan panas (Hadioetomo, 1993).
Mikroorganime hidup di segala tempat (tanah, air, udara, bahkan pada permukaan
tubuh). Keberadaan mereka yang ada di segala tempat dapat menyulitkan proses
pengkulturan jaringan tumbuhan untuk memperoleh kultur yang bebas kontaminasi dari
mikroorganisme lain (Hadioetomo, 1993). Salah satu faktor penentu keberhasilan kultur
jaringan adalah tahap sterilisasi. Kegiatan sterilisasi ini meliputi pada: sterilisasi pada
lingkungan kerja, sterilisasi pada alat-alat dan media tanam, dan terilisasi bahan tanaman
(eksplan). Kegiatan sterilisasi ini sangat penting untuk dilakukan, karena kontaminasi
pada kultur jaringan dapat berasal dari:
METODE
Sterilisasi alat dilakukan dengan langkah sebagai berikut : pertama, alat yang
akan disterilkan disiapkan. Alat yang dibutuhkan diambil oleh masing-masing
kelompok sejumlah yang diperlukan. Botol infuse berjumlah …., botol jam berjumlah
6 buah setiap kelompok beserta tutup dan petridish kecil berjumlah …. Botol infuse,
botol jam beserta tutup, dan petridish dipastikan terlebih dahulu dalam keadaan yang
bersih. Jika kurang bersih, alat-alat yang akan digunakan harus dibersihkan terlebih
dahulu degan cara dicuci menggunakan sabun cuci kemudian dikeringkan dengan
ditiriskan dan dilap. Setelah bersih, bagian mulut botol infuse ditutupi menggunakan
plastik dan diikat menggunakan karet gelang hingga tertututp rapat. Sedangkan
petridish kecil ditata sebanyak enam petri enam petri¸ kemudian dibungkus
menggunakan kertas payung dan direkatkan menggunakan selotip. Sama halnya
dengan botol infuse dan botol jam, pinset dan sendok pengaduk yang akan digunakan
dalam praktikum disterilkan dengan langkah yang sama seperti sebelumnya yaitu
ditutup rapat satu sisi pinset maupun sendok pengaduk dengan menggunakan kertas
payung yang dililit hingga sisi satunya, kemudian sisi tersebut direkatkan
menggunakan selotip.
Jika alat-alat yang akan disterilkan telah siap untuk dilakukan sterilisasi, alat-
alat tersebut dimasukkan dan ditata di dalam keranjang autoclave. Apabila semua
sudah tertata di keranjang autoclave, keranjang autoclave kemudian dimasukkan ke
dalam autoclave dengan suhu 1210C tekanan 1 atm. Autoclave ditutup rapat dan
dikancing. Ditunggu proses autoclave nya ± 30 menit tiap satu kali autoclave.
2. Pembuatan media
Disiapkan semua alat dan bahan, kemudian dihitung banyaknya masing-
masing larutan stok yang dibutuhkan untuk membuat media dengan volume total 1,2
L menggunakan rumus pengenceran yaitu M1×v1= M2×v2. Aturan pemakaian larutan
stok makronutrient pada label adalah 40 𝑚𝑙⁄𝐿, sehingga untuk membuat medium NP
1,2 L dibutuhkan 48 ml larutan stok makronutrient. Aturan pemakaian larutan stok
besi pada label adalah 5 𝑚𝑙⁄𝐿, sehingga banyaknya larutan stok besi yang digunakan
untuk membuat 1,2 L media NP adalah 6 ml. Untuk aturan pemakaian larutan stok
mikronutrient pada label 2 𝑚𝑙⁄𝐿, sehingga untuk membuat media NP 1,2 L
dibutuhkan larutan stok mikronutrient sebanyak 2,4 ml. Pada label larutan stok
vitamin aturan pemakaiannya adalah 4 𝑚𝑙⁄𝐿, sehingga banyaknya larutan stok yang
dibutuhkan untuk membuat media NP 1,2 L sebanyak 4,8 ml. Sedangkan aturan
pemakaian larutan stok myoinositol adalah 40 𝑚𝑙⁄𝐿 sama dengan aturan pemakaian
larutan stok makronutrien. Maka banyaknya larutan stok myoinositol yang dibutuhkan
𝑔𝑟
adalah 48 ml. Untuk sukrosa (gula) aturan pemakaiannya adalah 20 ⁄𝐿, sehingga
untuk membuat media dengan volume 1,2 L dibutuhkan gula sebanyak 2,4 g
(lampiran 3).
Setelah takaran untuk masing-masing larutan stok, dan gula dihitung, langkah
selanjutnya adalah diambil aquadest sebanyak 400 ml dan dituangkan ke dalam
erlemeyer 1000 ml. Satu persatu larutan stok dimasukkan dengan berurutan sesuai
aturan yang ada, yaitu makronutrient, besi, mikronutrient, vitamin, myoinositol, gula,
dan agar-agar. Larutan stok maktonutrient dimasukkan ke dalam erlenmeyer 1000 ml
yang telah berisi 400 ml aquadest sebanyak 48 ml, kemudian dihomogenkan
menggunakan magnetic stirrer dan ditunggu hingga homogen. Setelah homogen
larutan stok berikunya dimasukkan, yaitu larutan stok besi sebanyak 6 ml, larutan
mikronutrient sebanyak 2,4 ml, larutan vitamin sebanyak 4,8 ml, larutan myoinositol
sebanyak 48 ml, dan gula sebanyak 24 gram. Masing-masing larutan stok dimasukkan
setelah larutan stok sebelumnya homogen (lampiran 1).
Setelah semua larutan stok dimasukkan ke dalam 400 ml aquadest dan sudah
homogen, larutan tersebut diukur volumenya menggunakan gelas ukur. Dari
pengukuran didapatkan volume sebanyak 525 ml. Kemudian, campuran dari larutan
tersebut dibagi ke dalam erlenmeyer, untuk pembuatan media NP tanpa hormon
volume 600 ml dalam botol jam, diambil larutan stok media sebanyak 262,5 ml.
Untuk pembuatan media NP tanpa hormon volume 200 ml dalam erlenmeyer, diambil
larutan stok media sebanyak 87,5 ml. Pembuatan media NP dengan penambahan 2,4
D volume 200 ml dalam erlenmeyer, diambil larutan stok media sebanyak 87,5 ml.
Kemudian untuk media NP dengan penambahan BA volume 200 ml dalam
erlenmeyer, diambil larutan stok media sebanyak 87,5 ml (lampiran 2).
A. Hasil
Tabel 1. Takaran Larutan Stok yang digunakan untuk Membuat Media New
Phaeleonopsis (NP) 1,2 L
B. Pembahasan
Agar bagian organ tanaman yang dikulturkan dapat tumbuh dengan baik, maka
terdapat beberapa syarat tumbuh yang perlu diperhatikan, yaitu media tumbuh steril
nutrisi tercukupi, kondisi iklim klimatik harus sesuai dan eksplan berupa sel, jaringan atau
irisan organ tanama yang digunakan harus memiliki viabilitas yang tinggi. Media tumbuh
buatan diperlukan eksplan untuk mendukung terjadinya morfogenesis dan pertumbuhan.
Dalam teknik kultur jaringan hal lain yang perlu diperhatikan adalah komposisi media
kultur dan zat pengatur tumbuh yang tepat serta sumber eksplan yang digunakan untuk
menghasilkan plantlet sangat erat hubungannya selain faktor lainnya yaitu cahaya, suhu
dan kelembaban pada lingkungan sekeliling media (Rainiyati, 2009). George &
Sherington, 1984 ; Saad & Elshahed, 2012 dalam Rindang Dwiyani (2015) menyebutkan
bahwa secara umum media buatan tumbuh eksplan mengandung komponen hara makro,
hara mikro, gula, vitamin, myoinositol, zat pengatur tumbuh, pemadat media, asam amin
dan senyawa organik alami.
Oleh karena itu dilakukan praktikum pembuatan media yang bertujuan untuk
mengetahui cara membuat media kultur jaringan tumbuhan. Praktikum ini dilaksanakan
pada hari Rabu, 07 Maret 2018 dan Kamis, 08 Maret 2018 di laboratorium kultur jaringan
tumuhan FMIPA UNY. Adapun alat dan bahan yang digunakan adalah erlenmeyer 1000
ml, gelas ukur, hot plate, sendok pengaduk, neraca analitik, magnetic stirrer, mikropipet,
tip pipet, botol jam, erlenmeyer, plastik, karet gelang, autoclave, larutan stok
makronutrien, besi, mikronutrien, vitamin, myoinositol, gula, agar-agar, aquadest, dan
NaOH 1 N.
Media yang dibuat merupakan media padat yaitu media NP. Media NP atau New
Phaleopnosis merupakan media dasar yang digunakan dalam kultur jaringan tumbuhan
anggrek. Pembuatan media NP ini dibuat 3 variasi yaitu media pertama adalah media NP
tanpa diberi hormon sebanyak 800 ml, media NP yang ditambahkan hormone 2,4 D-2
ppm sebanyak 200 ml, dan NP ditambahkan hormone BA-2 ppm sebanyak 200 ml.
Pembuatan media ini dilakukan dalam dua hari, pada hari pertama langkah yang
dilakukan adalah mulai dari perhitungan larutan stok yang digunakan, pencampuran
masing-masing bahan, hingga penambahan gula. Pada hari kedua, dilakukan penambahan
hormone, pengecekan pH, penambahan agar-agar, penambahan aquadest hingga volume
yang ditentukan, dan pembagian media pada erlenmeyer.
Pembuatan media ini dilakukan dengan membuat larutan stok media untuk
volume 1,2 L. Langkah awal yang dilakukan adalah menghitung takaran setiap larutan
stok makronutien, besi, mikronutrien, vitamin, myoinositol, gula, dan agar-agar yang
akan digunakan dalam pembuatan media volume 1,2 L. Perhitungan larutan stok yang
digunakan mengacu pada aturan pemakaian setiap larutan stok yang tertera di label pada
Erlenmeyer. Setelah masing-masing larutan stok dihitung takarannya, praktikkan
menyiapkan 400 ml aquadest dalam Erlenmeyer 1000 ml. Kemudian masing-masing
larutan stok dicampurkan dalam 400 ml aquadest satu per satu secara beruturan sesuai
dengan aturan. Urutan pertama adalah larutan stok makronutrien, kemudian besi, lalu
mikronutrien, vitamin, myoinositol, gula, dan agar-agar. Setiap memasukkan bahan ke
dalam 400 ml aquadest, ditunggu terlebih dahulu hingga bahan yang sebelumnya
homogen. Penambahan setiap bahan ini dilakukan dengan bantuan magnetic stirrer.
Dimasukkannya bahan satu persatu bertujuan agar bahan tersebut dapat tercampur
homogen dan setiap bahan tersebut bisa dipastikan ada dalam media dengan kata lain
bahan lupa ditambahkan atau tertinggal saat pembuatan media yang menyebabkan nutrisi
media berkurang atau tidak terpenuhi.
Unsur hara makro adalah hara yang dibutuhkan tanaman dalam jumlah yang
banyak. Hara makro tersebut meliputi, Nitrogen (N), Fosfor (P), Kalium (K), Kalsium
(Ca), Sulfur (S), Magnesium (Mg), dan Besi (Fe). Kegunaan unsur hara makro tersebut
dalam kultur jaringan menurut Qosim, 2006 dalam Sukarasa, 2007 adalah sebagai
berikut:
Unsur hara mikro adalah hara yang dibutuhkan dalam jumlah yang sedikit. Unsur
hara mikro ini merupakan komponen sel tanaman yang penting dalam proses
metabolisme dan proses fisioligi lainnya (Gunawan, 1992). Unsur hara mikro tersebut
diantaranya adalah :
Vitamin yang paling sering digunakan dalam media kultur jaringan tanaman
adalah thiamine (vitamin B1), nicotinic acid (niacin), pyridoxine (vitamin B6). Thiamine
merupakan vitamin yang esensial dalam kultur jaringan tanaman karena thiamine
mempengaruhi pertumbuhan dan perkembangan sel. Vitamin C, seperti asam sitrat dan
asam askorbat, kadang-kadang digunakan sebagai antioksidan untuk mencegah atau
mengurangi pencoklatan atau penghitaman eksplan.
Gula digunakan sebagai sumber energi dalam media kultur, karena umumnya
bagian tanaman atau eksplan yang dikulturkan tidak autotrof dan mempunyai laju
fotosintesis yang rendah. Oleh sebab itu tanaman kultur jaringan membutuhkan
karbohidart yang cukup sebagai sumber energi. Menurut Gautheret dalam Gunawan
(1992), sukrosa adalah sumber karbohidrat penghasil energi yang terbaik melebihi
glukosa, maltosa, rafinosa. Namun jika tidak terdapat sukrosa, sumber karbohidrat
tersebut dapat digantikan dengan gula pasir. Gula pasir cukup memenuhi syarat untuk
mendukung pertumbuhan kultur. Selain sebagai sumber energi, gula juga berfungsi
sebagai tekanan osmotik media.
Setelah semua bahan dimasukkan dalam 400 ml aquadest dan tercampur secara
homogen, praktikkan mengukur volume dari larutan yang dibuat. Hal ini dilakukan untuk
menghitung pembagian volume larutan yang akan dibuat 3 variasi media. Volume yang
diperoleh dari pembuatan larutan adalah 525 ml. Dari 525 ml ini dihitung banyaknya
larutan untuk membuat masing-masing variasi media. Setelah dihitung, untuk pembuatan
media NP tanpa diberi hormon dengan volume 600 ml dibutuhkan larutan media
sebanyak 262,5 ml, media NP tanpa diberi hormone dengan volume 200 ml dibutuhkan
larutan media sebanyak 87,5 ml, media NP yang ditambah hormon 2,D-2 ppm volume
200 ml dibutuhkan larutan media 87,5 ml, dan untuk media NP yang ditambah hormon
BA-2 ppm volume 200 ml dibutuhkan larutan media sebanyak 87,5 ml.
Masing-masing volume larutan media yang telah dihitung diambil dan dituangkan
ke erlenmeyer. Media NP tanpa diberi hormon kemudian dilakukan tes pH menggunakan
pH stik. Apabila pH asam maka perlu dilakukan penambahan NaOH 1 N sampai pH
larutan media pada rentang 5,0-6,0. Keasaman (pH) adalah nilai yang menyatakan derajat
keasaman atau kebasaan larutan dalam air. Sel-sel tanaman yang dikembangkan dengan
teknik kultur jaringan mempunyai toleransi pH yang relatif sempit dengan titik optimal
antara pH 5,0 – 6,0 (Daisy, 1994). Faktor pH dalam media juga perlu mendapat perhatian
khusus. pH tesebut harus diatur sedemikian rupa sehingga tidak mengganggu fungsi
membran sel dan pH dari sitoplasma. Menurut Gamborg dan Shyluk, 1981 dalam
Gunawan, 1992, sel-sel tanaman membutuhkan pH yang sedikit asam berkisar antara 5,5–
5,8. Pengaturan pH, biasa dilakukan dengan dengan menggunakan NaOH (atau kadang-
kadang KOH) atau HCL pada waktu semua komponen sudah dicampurkan (Gunawan,
1992). Setelah larutan media NP tanpa diberi hormon dilakukan tes pH dan pH larutan
sudah dalam rentang 5,0-6,0 maka larutan media dapat ditambahkan agar-agar sesuai
takaran yang telah dihitung. Kemudian media ditambahkan aquadest hingga volume
sesuai dengan volume yang telah ditentukan.
Untuk media yang diberi tambahan hormon, sebelum dilakukan tes pH larutan
media ditambahkan hormon terlebih dahulu. Media NP 2,4 D-2 pp, (200 ml)
ditambahakan hormon 2,D sebanyak 4 ml. Hormon 2,D ini merupakan hormone auksin
yang memiliki rumus molekul C8H6Cl2O3 (Hogan, 2011). 2,4-D merupakan golongan
auksin sintesis yang mempunyai sifat stabil, karena tidak mudah terurai oleh enzim-enzim
yang dikeluarkan saat pemanasan pada proses sterilisasi. Sebagai salah satu senyawa yang
masuk ke dalam grup hormon auksin, maka 2,4-D dapat bekerja maksimum untuk
pembelahan dan pembesaran sel serta pembentukan akar (Hendaryono dan Wijayani,
1994). Setelah ditambahkan hormone 2,D larutan ini dites pH nya, sama seperti pada
media tanpa diberi hormon. Apabila pH larutan media sudah dalam rentang 5,0-6,0 maka
media dapat ditambahkan agar-agar dengan takaran sesuai perhitungan dan aquadest
hingga volume 200 ml.
Setelah semua variasi media dibuat, langkah terakhir adalah memanaskan media
pada hot plate dan menghomogenkannya menggunakan magnetic stirrer hingga media
mendidih. Jika media telah mendidih, media tanpa diberi hormon (600 ml) dituangkan ke
dalam 8 botol jam kemudian ditutup menggunakan plastik dan diikat menggunakan karet
gelang. Semua media (NP tanpa hormone (200 ml), media NP 2,4 D-2 ppm (200 ml), dan
media NP BA-2 ppm (200 ml)) ditutup dengan tutup plastik kemudian diikat mengguakan
karet gelang. Langkah terakhir adalah sterilisasi media yaitu, semua media ditata pada
keranjang autoclave kemudian keranjang dimasukkan ke dalam autoclave dan di
autoclave dengan suhu 1210C tekanan 1 atm selama ±20 menit.
BAB V
PENUTUP
A. Kesimpulan
Berdasarkan praktikum yang telah dilaksanakann dapat disimpulkan bahwa
sterilisasi alat, bahan seperti aquadest dan media sangatlah penting dilakukan. Semua alat,
bahan, dan media yang digunakan untuk kultur jaringan harus disterilisasi terlebih dahulu
karena salah satu syarat dalam melakukan kultur jaringan tumbuhan adalah dalam kondisi
yang aseptik supaya tidak terdapat kontaminan dalam alat – alat tersebut. Setelah itu
semua alat yang akan disterilisasi di tata pada keranjang autoclave yang kemudian
dilakukan sterilisasi menggunakan autoclave pada suhu 1210C tekanan 1 atm selama 30
menit.
Berdasarkan kegiatan pembuatan media diketahui bahwa dilakukan pembuatan media
NP dengan melakukan penambahan makronutrient, mikronutrient, besi, myoinositol,
vitamin dan gula. Bahan-bahan berfungsi untuk menstimulir pembelahan sel epidermis
dan mengarah pada pembentukan protocorm jaringan supaya bergenerasi lebih lanjut dan
lebih cepat.
B. Saran
Didalam laboratorium kultur jaringan sebaiknya disediakan meja kerja yang
digunakan oleh praktikan untuk menulis log book, log book tersebut berisi cara membuat
media tertentu dan hasilnya bagaimana, jika hasilnya baik dapat diikuti oleh praktikan
disaat selanjutnya namun jika hasilnya kurang baik dilampirkan evaluasi dan saran untuk
praktikan yang nantinya akan melakukan praktikum tersebut. Log book ini sebagai arsip
laboratorium. Untuk teknik sterilisasi yang baik dan benar diharapkan dapat dipraktekan
oleh praktikan untuk menunjang proses melakukan pengkullturan jaringan tumbuhan
agar tidak terjadi kontaminasi pada kultur
DAFTAR PUSTAKA
Basri, Z., 2004. Kultur Jaringan Tanaman. Palu: Universitas Tadulako Press.
Dwiyani, R. 2015. Kultur Jaringan Tanaman. Denpasar: Pelawa Sari.
Gamborg, O. L., G. C. Phillips. 1995. Media Preparation and Handling, p 21-33.In Gamborg
and Phillips (Eds.). Springer-Verlag. Berlin
George, E. F. dan T. D. Sherrington. 1984. Plant Propagation by Tissue Culture. Handbook
and Directionary of Commercial Laboratories. England. pp. 285—302.
George, E.F and P.D Sherington, 1983. Handbook of Plant Propagation by Tissue Culture.
Easterm Press Ltd. England.
Gunawan, L. W. 1987 Teknik Kultur Jaringan Tumbuhan. PAU Bioteknologi IPB. Bogor.
Hadioetomo, R. S., 1993. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Gramedia. Jakarta.
Hartmann, H. T and D. E Kester., 1997. Plant Propagation. Prantice. New Jersey: Hall,
Engelwood Cliffs.
Hartmann, H.T., D.E. Kester, F.T. Davies Jr., and R.L. Geneve. 1997. Plant Propagation:
Principle And Practices. Sixth Ed.
Hendaryono, D. P. S dan Wijayani. 1994. Teknik Kultur Jaringan dan Petunjuk Perbanyakan
Tanaman Secara Vegetatif Modern. Yogyakarta: Kanisius.
Irianto, Koes. Mikrobiologi Menguak Dunia Mikroorganisme Jilid I. Bandung: CV. Y. Rama
Widya. 2007.
Lestari, Endang. G. 2011. Peranan Zat Pengatur Tumbuh dalam Perbanyakan Tanaman
melalui Kultur Jaringan. Jurnal AgroBiogen 7 (1).
Ni Putu, Ristiati. 2000. Pengantar Mikrobiologi Umum. Jakarta : Ditjen Dikti.
Pierik, R.L.M. l987.In Vitro Culture of Higher Plants. Martinus Nijhoff Publisher. London.
344p.
Rainiyati, Dede Martino, Gusniwati dan Jasminarni. 2009. THE DEVELOPMENT OF
BANANA (Musa sp.) CV. RAJA NANGKA VIA TISSUE CULTURE USING
SUCKER AND FLORAL MERISTEM EXPLANTS. Jurnal Agronomi Vol. 11 No. 1,
Januari – Juni 2009 ISSN 1410-1939.
Rainiyati, Lizawati, dan M. Kristiana. 2009. Peranan IAA dan BAP terhadap perkembangan
nodul pisang (Musa AAB) raja nangka secara in vitro. Jurnal Argronomi 13(1):51-
57.
Saad, A. I. M., dan A. M. Elshahed. 2012. Plant Tissue Culture Media.
http://www.intwechopen.com/ . 14 Maret 2018.
Smith, R.H. 2000. Plant Tissue Culture: Techniques and Experiments : Second Edition.
Academic Press. New York.
Suriawiria U. 2005. Mikrobiologi Dasar. Jakarta : Papas Sinar Sinanti
Suriawiria, Unus. 1986. Mikrobiologi Masa Depan Penuh Kecerahan Di Dalam
Pembangunan. Kumpulan Beberapa Tulisan dari Unus Suriawiria. Jurusan Biologi.
Bandung: ITB.
Vasil, I.K., 1988. Progress in The Regeneration and Genetic Multiplication of Cereal Crops.
Bio/Technol, 6:397-402
Wattimena, G. A., L. W. Gunawan, N. A. Mattjik, E. Syamsudin, N. M. A. Wiendi, dan A.
Ernawati, 1992. Bioteknologi Tanaman. Bogor PAU: Bioteknologi IPB.
Yusnita. 2003. Kultur Jaringan. Cara Perbanyakan Tanaman Secara Efisien. Agromedia
Pustaka. Jakarta. 105 hlm.
LAMPIRAN 1
LAMPIRAN 2
Dihomogenkan
menggunakan
magnetic stirrer
LAMPIRAN 2
Perhitungan :