Pengertian Kromatografi Kolom

Kromatografi kolom merupakan teknik kromatografi yang paling awal yang pertamakali di
lakukan oleh D.T.Davy yaitu untuk membedakan komposisi minyak bumi. Ditinjau dari
mekanismenya kromatografi kolom merupakan kromatografi serapan atau adsorbsi.
Kromatografi kolom digolongkan kedalam kromatografi cair – padat (KCP) kolom
terbuka. Pemisahan kromatografi kolom adsorpsi didasarkan pada adsorpsi komponen-
komponen campuran dengan afinitas berbeda-beda terhadap permukaan fase diam. Kromatografi
kolom adsorpsi termasuk pada cara pemisahan cair-padat. Substrat padat (adsorben) bertindak
sebagai fase diam yang sifatnya tidak larut dalam fase cair. Fase bergeraknya adalah cairan
(pelarut) yang mengalir membawa komponen campuran sepanjang kolom. Prinsip yang
mendasari kromatografi kolom adsorpsi ialah bahwa komponen – komponen dalam zat contoh
yang harus diperiksa mempunyai afinitas yang berbeda-beda terhadap adsorben dalam kolom.
Apabila kita mengalirkan cairan ( elutor ) secara kontinyu melalui kolom yang berisi zat contoh
yang telah diadsorpsikan oleh penyarat kolom, maka yang pertama – tama dihanyutkan elutor
ialah komponen yang paling lemah terikat kepada adsorben. Komponen –komponen lainnya
akan dihanyutkan menurut urutan afinitasnya terhadap adsorben, sehingga terjadi pemisahan
daripada komponen – komponen tersebut.
Pemisahan tergantung pada kesetimbangan yang terbentuk pada bidang antarmuka di
antara butiran-butiran adsorben dan fase bergerak serta kelarutan relatif komponen pada fase
bergeraknya. Antara molekul-molekul komponen dan pelarut terjadi kompetisi untuk teradsorpsi
pada permukaan adsorben sehingga menimbulkan proses dinamis. Keduanya secara bergantian
tertahan beberapa saat di permukaan adsorben dan masuk kembali pada fase bergerak. Pada saat
teradsorpsi komponen dipaksa untuk berpindah oleh aliran fase bergerak yang ditambahkan
secara kontinyu. Akibatnya hanya komponen yang mempunyai afinitas lebih besar terhadap
adsorben akan secara selektif tertahan. Komponen dengan afinitas paling kecil akan bergerak
lebih cepat mengikuti aliran pelarut.
Teknik pemisahan kromatografi kolom partisi sangat mirip dengan kromatografi kolom
adsorpsi. Perbedaan utamanya terletak pada sifat dari penyerap yang digunakan. Pada
kromatografi kolom partisi penyerapnya berupa materi padat berpori seperti kieselguhr, selulosa
atau silika gel yang permukaannya dilapisi zat cair (biasanya air). Dalam hal ini zat padat hanya
berperan sebagai penyangga (penyokong) dan zat cair sebagai fase diamnya. Fase diam zat cair
umumnya diadsorpsikan pada penyangga padat yang sejauh mungkin inert terhadap senyawa-
senyawa yang akan dipisahkan. Zat padat yang penyokong harus penyerap dan menahan fase
diam serta harus membuat permukaannya seluas mungkin untuk mengalirnya fase bergerak.
Penyangga pada umumnya bersifat polar dan fase diam lebih polar dari pada fase bergerak.
Dalam kromatografi partisi fase bergeraknya dapat berupa zat cair dan gas yang mengalir
membawa komponen-komponen campuran sepanjang kolom. Jika fase bergeraknya dari zat cair,
akan diperoleh kromatografi partisi cair-cair. Teknik ini banyak digunakan untuk pemisahan
senyawa-senyawa organik maupun anorganik.
Parameter yang di gunakan dalam mengevaluasi kinerja kolom, setelah mengoptimumkan
efesiensi pemisahan secara kromatografi, mutu kromatografi dapat di kendalikan dengan menerapkan uji
kesesuian sistem tertentu. Salah satu diantaranya adalah perhitungan pelat pelat teoritis untuk suatu kolom
dan terdapat dua parameter utama lainnya untuk menilai kinerja.

Persyaratan kolom
Pola kecepatan arus elutor pada tiap irisan kolom yang dipilih di sembarang tempat
suddah tentu sedapat mungkin harus sama. Keseragaman ini dapat dicapai dengan memilih
adsorben yang ukuran butir – butirnya sama ( diayak ) dan dengan cara penyaratan yang baik.
Makin kecil ukuran butir adsorben, makin cepat keseimbangan adsorpsi akan tercapai, dan makin
besar pula kecepatan elusi yang boleh dipergunakan. Tetapi dilain pihak, makin kecil butir
adsorben, makin besar hambatan bagi cairan yang harus mengalir melalui kolom. Apabila
kecepatan lintas bagi cairan elutor terlalu kecil, dapat dipergunakan pompa vakum yang
menimbulkan tekanan rendah dalam ruang di bawah kolom sehingga cairan dapat mengalir lebih
cepat melalui kolom. Cara yang lain ialah menambahkan tekanan dalam ruang di atas kolom
dengan menggunakan pompa pneumatic.
Bentuk kolom

Penempatan adsorben dalam kolom secara uniform betul sangat sukar dilaksanakan. Sebagai
akibatnya, zona – zona komponen yang dipisahkan menjadi kurang teratur bentuknya. Bagi kolom yang
lebar hal ini dapat menyebabkan pembauran. Tetapi bagi kolom kecil bahaya ini seberapa besar. Namun
di lain pihak, kolom yang lebar dan pendek itu lebih memudahkan dalam pemakaiannya. Oleh karena itu,
tinggi kebanyakan kolom ialah ± 20 kali diameternya. Di bawah tabung yang umumnya terbuat dari gelas
terdapat lempengan meduk yang terbuat dari porselen atau dari serbuk gelas yang dipanaskan hingga
melengket jadi satu. Lempengan yang berbentuk cakram ini bergawai sebagai penahan fasa yang
stasioner. Di bagian tabung yang paling bawah terdapat kapiler penyulur dilengkapi dengan pancur.
Kapiler beserta pancur dirakitkan dengan kolom memakai suku asah sehingga mudah dilepaskan guna
membersihkan kolom dan untuk meniup kolom sehingga menjadi bersih dari cairan. Ruang antara pancur
dan cakram penyaring harus sekecil mungkin supaya tidak terjadi pembauran antara cairan – cairan yang
keluar dari kolom.

Penggunaan Kromatografi Kolom

Menganalisa zat pewarna alami dalam tumbuh-tumbuhan. Contohnya mengekstrak daun atau
wortel. Sampel terlebih dahulu dihaluskan secara manual dengan menggunakan mortar,
kemudian ditambahkan dengan pelarut organic yaitu n-hexane, hasil ekstraksi ini kemudian
disaring dan filtratnya dipanaskan diatas penangas air dan dibiarkan sampai mengental. Kolom
yang dipergunakan misalnya corong pisah yang berbentuk tabung (silinder), dalam
mempersiapkan kolom hal pertama yang perlu dilakukan adalah dengan memasang penahan
pada kolom, penahan yang dipergunakan adalah glass wool, hal ini dilakukan karena glass wool
memiliki kemampuan menyaring dan menahan penyerap lebih baik daripada menggunakan
kapas. Proses memasukan glass wool kedalam corong pisah dilakukan dengan menggunakan
pinset, karena selain dapat menyebabkan gatal pada tangan, glass wool juga berbahaya jika
terhirup. Jumlah glass wool yang ditambahkan secukupnya dan glass wool yang sudah masuk
corong pisah tidak boleh dipadatkan. Penyerap (Alumina/magnesia, silica gel, karbon,
magnesium silikat, magnesium kabonat, kalisum karbonat, dan aluminium silikat). Penyerap
ditimbang secukupnya dan dilarutkan dengan menggunakan pelarut organic n-hexane sampai
penyerap menjadi bubur, kemudian bubur penyerap dimasukan kedalam corong pisah. Proses
memasukan penyerap ini dilakukan dengan menggunakan spatula, proses ini harus dilakukan
dengan cepat karena pelarut yang dipergunakan adalah n-hexane yang volatile maka bahan
penyerap pun menjadi cepat mengering, dan jika bahan penyerap mengering maka proses
memasukannya menjadi lebih sulit.
Manfaat Kromatografi Kolom
Dalam bidang bioteknologi, kromatografi mempunyai peranan yang sangat besar. Misalnya
dalam penentuan, baik kualitatif maupun kuantitatif, senyawa dalam protein. Protein sering
dipilih karena ia sering menjadi obyek molekul yang harus di-purified (dimurnikan) terutama
untuk keperluan dalam bio-farmasi. Kromatografi juga bisa diaplikasikan dalam pemisahan
molekul-molekul penting seperti asam nukleat, karbohidrat, lemak, vitamin dan molekul penting
lainnya. Dengan data-data yang didapatkan dengan menggunakan kromatografi ini, selanjutnya
sebuah produk obat-obatan dapat ditingkatkan mutunya, dapat dipakai sebagai data awal untuk
menghasilkan jenis obat baru, atau dapat pula dipakai untuk mengontrol kondisi obat tersebut
sehingga bisa bertahan lama.
 DAFTAR PUSATAKA

Sudjadi.1988.Metode Pemisahan. Konsius: Yogyakarta.

Arsyad, M. Natsir, 2001, Kamus Kimia Arti dan Penjelasan Istilah, Gramedia: Jakarta.
Aswad.2001.Kimia Untuk Universitas.Erlangga : Jakarta.
Bernaseoni,G. 2005. Teknologi Kimia. PT Padya Pranita: Jakarta.
Keenan, Charles W. dkk. 2002. Kimia Untuk Universitas Jilid 2. Erlangga: Jakarta.
Mulyadi. 2006. Pengenalan Ilmu Kimia . Bumi aksara: Jakarta
Syukri. 2000. Kimia Dasar 3. ITB Press: Bandung.
Synder, L.R,J.J. Kirkland, dan J.L.Glajch. 1997. HPLC Method Development. New York: John
Willey & Sons.
Watson, G David. 2005. Analisis Farmasi edisi 2. Penerbit Buku Kedokteran: Jakarta.
Prof. Dr. Gholib, Ibnu, dan Rohman, Abdul. Kimia Farmasi Analisis. Pustaka Pelajar:
Universitas Gadjah Mada.