Meninjau Ulang Mikroskopi Basil Tahan Asam dari Apusan

Sputum Konsentrasi Sebagai Alat yang Efisien untuk

Diagnosis Tuberkulosis : Penelitian dari Pusat Perawatan
Tersier di India Selatan
J.Anto Jesuraj Uday Kumar1,2, Chirag Dhar1,3, Hiresave Srinivasa2

Abstrak
Latar Belakang dan Tujuan : Dengan 2,2 juta kasus baru tiap tahun, tuberkulosis
(TB) terus menjadi epidemi proporsi besar di India. Mikroskopi apusan sputum
konvensional, walaupun terbatas dalam hal sensitifitas, masih merupakan metode yang
paling sering digunakan dalam pemeriksaan TB. Teknik terbaru seperti teknik
mikroskopi sputum konsentrasi telah menunjukkan beberapa hal yang menjanjikan
dalam meningkatkan sensitifitas yang terbatas ini. Kami telah membandingkan efikasi
dari metode konsentrasi dengan teknik apusan langsung pada 1000 sampel sputum dari
pasien yang dicurigai menderita TB. Metode : Sebanyak 1000 spesimen sputum
dikumpulkan dari apusan BTA langsung, apusan BTA konsentrasi dan kultur dari St.
John’s Medical College and Hospital. Tiga puluh sembilan sampel (3,9%)
terkontaminasi dihilangkan saat analisis akhir. Kultur mycobacterium digunakan
sebagai metode standar referensi untuk deteksi TB. Hasil : 184 dan 198 dari 961
sampel ditemukan positif BTA masing-masing melalui mikroskopi apusan langsung
dan teknik apusan konsentrasi. Nilai sensitifitas dan spesifisitas dari mikroskopi apusan
langsung adalah masing-masing 69,86% dan 95,82%, sedangkan untuk mikroskopi
apusan konsentrasi masing-masing 76,71% dan 95,96%. Tiga puluh tiga sampel
ditemukan negatif dengan metode apusan langsung namun positif dengan teknik apusan
konsentrasi. Kesimpulan : Meskipun penelitian kami menunjukkan tidak adanya
perbedaan yang signifikan secara statistik antara kedua teknik dalam mendeteksi
tubekulosis paru, kami merekomendasikan penggunaan teknik apusan konsentrasi di
pusat perawatan lain yang seperti kami, dimana fasilitas telah tersedia. Melalui cara ini,
jumlah kasus TB yang tidak diobati dapat turun secara signifikan.
Kata kunci : BTA, Diagnosis TB, Apusan konsentrasi, Apusan langsung,
Pewarnaan ZN

1
 1. Pendahuluan
Tuberkulosis terus menjadi epidemi dari proporsi besar di India. Setiap tahun,
terdeteksi 2,2 juta kasus baru. TB juga menyumbang lebih dari 478.000 kematian tiap
tahunnya. Pada tahun 2015, diperkirakan sekitar 10,4 juta kasus secara global dan
hampir 1,4 juta kematian. Hal ini membuat TB menjadi penyebab kematian kedua
terbesar pada pasien dengan penyakit infeksi.1 Sebuah makalah terkenal oleh Nirmalan
dkk menyebutkan bahwa jumlah kasus TB di India mungkin jauh lebih banyak dari
yang diperkirakan sebelumnya. Hal ini disebabkan oleh jumlah besar dari kasus yang
ditatalaksana oleh sektor swasta.2
Diagnosis dini dan efisien dari TB mutlak diperlukan. Saat ini, baku emas untuk
diagnosis TB adalah kultur sputum. Metode ini membutuhkan fasilitas kultur dan
meningkatkan waktu penyelesaian diagnosis. Karena keterbatasan ini, mikroskopi
Ziehl-Neelsen langsung untuk mendeteksi basil tahan asam menjadi pemeriksaan
diagnostik yang paling umum di India. Teknik ini, dimana saat ini telah digunakan lebih
dari 130 tahun, dipercaya menjadi cara tercepat untuk mendeteksi TB di negara
berkembang.3,4 Selain dari cepatnya waktu penyelesaian, pewarnaan ZN sederhana dan
murah. Namun, kelemahan terbesarnya adalah sensitifitasnya. Bahkan dalam kondisi
yang optimal, teknik ini hanya dapat mendiagnosis 60% kasus kultur bakteri sputum
positif.5 dan membutuhkan 104 sampai 105 basil per ml dahak untuk keberhasilannya.6
Tes diagnostik terbaru seperti GeneXpert telah dikembangkan dalam upaya
meningkatkan sensitifitas ini.
Sejak pergantian milenium, telah ada bukti yang berkembang bahwa pencairan
dahak dan konsentrasi subsequent dengan sentrifugasi dan sedimentasi diikuti oleh
pewarnaan BTA dapat secara signifikan meningkatkan efikasi dari deteksi mikroskopis
TB.7 N-acetyl-L-cysteine (NALC) bersama dengan 4% Sodium Hydroxide (NaOH)
paling sering digunakan untuk persiapan dahak. Pada sisi negatifnya, persiapan sputum
terkonsentrasi ini membutuhkan ahli yang terlatih, tingkat biosafety yang lebih tinggi
dan peningkatan waktu yang digunakan untuk membuat diagnosis.
Dalam upaya untuk mengembangkan tes diagnostik yang kuat untuk rumah sakit
perawatan tersier kami, kami meninjau kembali metode konsentrasi pada pemeriksaan
mikroskopis sputum. Kami telah membandingkan efikasi metode konsentrasi versus
teknik apusan langsung pada 1000 sampel sputum pasien yang diduga menderita TB.

2
Selain itu, kami juga mengkulturkan sampel sputum untuk mengukur sensitifitas kedua
teknik berbasis mikroskopi ini.
2. Metodologi
Penelitian ini disetujui oleh Komite Pengkajian Etis dari St. John’s Medical College
and Hospital, Bangalore, India. Semua subjek penelitian terlibat dalam penelitian ini
hanya setelah mereka memberikan informed consent tertulis.
Desain penelitian adalah studi komparatif dari akurasi diagnostik. Tes apusan
metode konsentrasi dan standar Referensi (apusan langsung) dilakukan secara simultan.
Penelitian ini melibatkan 1.000 pasien dengan dugaan tuberkulosis, baik pasien rawat
inap maupun pasien rawat jalan yang datang ke rumah sakit pendidikan perawatan
tersier di India selatan. Sampel sputum pasien berusia 4 tahun ke atas dengan dugaan
tuberkulosis, yang terdaftar untuk pemeriksaan sputum BTA di Klinik RNTCP,
dimasukkan dalam penelitian ini. Sampel dikumpulkan dari klinik RNTCP antara
Januari 2013 hingga Desember 2015, murni berdasarkan inklusi dalam pencatatan dan
kemudahan sampling. Sampel sputum yang kurang dari 1 ml dikeluarkan dari
penelitian. Informasi pasien dirahasiakan sebelum analisis.
Sampel yang dikumpulkan dikirim dalam kotak spill-proof ke laboratorium untuk
pemeriksaan BTA dan kultur.
Sebuah loop yang penuh dengan bagian purulen dari sputum digunakan untuk
apusan langsung. Sputum yang tersisa kemudian diproses melalui metode
dekontaminasi-digesti NALC-NaOH.8 Dengan volume yang sama, 4% NaOH dan
2,94% sodium sitrat yang mengandung 0,5% NALC ditambahkan kedalam masing-
masing tabung dan isi didalamnya di vortex dan di inkubasi pada suhu 25oC selama 15
menit. Dalam interval yang teratur, tabung dikocok. Phosphate-buffered saline (pH 6,8)
ditambahkan pada akhir masa inkubasi hingga volume menjadi 45 ml. Tabung
kemudian disentrifus pada 3000rpm selama 15 menit. Supernatan dibuang dan sedimen
yang dihasilkan di re-suspended dalam 1-2 ml phosphate buffered saline. Suspensi ini
digunakan untuk membuat apusan tambahan (apusan konsentrasi). (9).
Dua sampai tiga tetes sedimen yang di resuspended juga diinokulasi dalam media
kultur Lowenstein Jensen. Lima ratus µl dari sedimen yang di resuspended ini juga
diinokulasi pada tabung indikator pertumbuhan Mycobacterium (MGIT) beserta PNTA
(kombinasi dari obat antimikroba). Kedua tabung tersebut diinkubasi pada suhu 370C

3
masing-masing selama 8 minggu dan 6 minggu atau hingga ditemui pertumbuhan pada
media solid dan tabung MGIT mengindikasikan pertumbuhan sesuai dengan intruksi
pabrik.10,11,12 Seluruh tabung yang terkontaminasi dibuang dan sampel primer yang
sesuai tidak dimasukkan pada analisis akhir. Pertumbuhan pada kultur cairan
dikonfirmasi dengan mikroskop. Sampel yang ditemukan positif menggunakan alat
pembaca mikro MGIT juga digoreskan pada agar darah untuk menyingkirkan
kontaminasi.
Kedua apusan langsung dan konsentrasi diwarnai dengan teknik Ziehl-Neelsen.
Sediaan dibaca dalam 48 jam persiapan menggunakan lampu mikroskop (perbesaran
1000x). Apusan, dimana BTA ditemukan, dinilai derajatnya berdasarkan guidelines
RNTCP : 1 sampai 9 BTA dalam 100 lapang pandang disebut sebagai minimal positif,
10 sampai 99 BTA pada 100 lapang pandang diberi skor +1, 1 sampai 10 BTA per
lapang pandang dalam setidaknya 50 lapang pandang diberi skor +2, dan lebih dari 10
BTA per lapang pandang dalam setidaknya 20 lapang pandang bernilai +3.13 Apusan
langsung dan konsentrasi diperiksa secara terpisah dan blinded untuk mencegah bias
dari pemeriksa.
Analisis Statistik
Apusan langsung dan apusan konsentrasi dibandingkan secara independen dengan
kultur sputum sebagai tolak ukur diagnosis TB. Sensitifitas, spesifisitas, prediksi nilai
positif dan prediksi nilai negatif dinilai menggunakan tabel 2x2. Lebih lanjut lagi, uji
Mc. Nemar (GraphPad, sebuah piranti lunak online) digunakan untuk menghitung
signifikansi statistik.
3. Hasil
Dari 1000 spesimen yang dikumpulkan untuk penelitian ini, 961 dimasukkan dalam
analisis akhir. Tiga puluh sembilan sisanya terkontaminasi dan tidak dimasukkan dalam
penelitian. Seratus delapan puluh empat (19,1%) dari 961 sampel tersebut ditemukan
BTA positif dan sisanya (80,9%) ditemukan BTA negatif melalui pemeriksaan apusan
langsung. Berikut ini adalah derajat dari spesimen positif, 24 (13,0%) minimal positif,
39 (21,2%) bernilai +1, 71 (38,6%) spesimen bernilai +2, dan 50 (27,1%) spesimen
bernilai +3. Sebaliknya, 198 (20,6%) ditemukan BTA positif dengan metode apusan
konsentrasi. Diantara spesimen positif, 29 (14.6%), 45 (22.7%), 45 (22.7%), 79
(39.9%) masing-masing bernilai minimal positif, +1, +2, dan +3.

4
 Lebih jauh lagi, kami membandingkan apusan langsung dan apusan konsentrasi
dengan kultur sputum sebagai baku emas dari diagnosis TB. Dari kultur sputum, 219
(22,7%) sampel adalah positif. Tabel 1 menunjukkan perbandingan dari apusan
konsentrasi versus kultur sputum.
Sensitifitas dan spesifisitas dari apusan langsung dibandingkan dengan kultur
sputum adalah 69,86% dan 95,82% masing-masingnya. Nilai prediktif positif dan nilai
prediktif negatif ditemukan masing-masing 83,15% dan 91,51%. Nilai P yang dihitung
ditemukan 0,0006 (Tabel 2).
Sebaliknya, sensitifitas dan spesifisitas dari apusan konsentrasi yang dibandingkan
dengan kultur sputum adalah masing-masing 76,71% dan 95,95%. Nilai prediktif positif
dan nilai prediktif negatif masing-masing 84,85% dan 93,32% (Nilai P 0,02).
Tabel 1. Apusan konsentrasi versus kultur sputum untuk deteksi BTA
Kultur Positif (219) Kultur Negatif (742)
Apusan positif (198) 168 30
Apusan negatif (763) 51 712
Catatan : Dari 1000 sampel yang dimasukkan dalam penelitian, 39 sampel yang
terkontaminasi dikeluarkan dari analisis akhir

Tabel 2. Apusan langsung versus kultur sputum untuk deteksi BTA

Kultur positif (219) Kultur negatif (742)
Apusan positif (184) 153 31
Apusan negatif (777) 66 711
Catatan : Dari 1000 sampel yang dimasukkan dalam penelitian, 39 sampel yang
terkontaminasi dikeluarkan dari analisis akhir

4. Diskusi
Penelitian ini lakukan untuk mengevaluasi kegunaan apusan konsentrasi sebagai
alternatif apusan langsung dalam deteksi BTA pada sampel sputum. Perbedaan dalam
sensitifitas dari apusan langsung dan konsentrasi ditemukan tidak signifikan secara
statistik (masing-masing 69,86% dan 76,71%). Penelitian kami juga menunjukkan
perbedaan yang tidak berarti dalam spesifisitas dari 2 uji tersebut (95,82% dengan
apusan langsung dan 95,96% dengan apusan konsentrasi). Perbandingan dari apusan

5
langsung dan teknik apusan konsentrasi, hasil kultur yang independen, menghasikan
nilai p yang juga tidak signifikan secara statistik.
Beberapa penelitian telah dilakukan sebelumnya mengetahui keggunaan dari
apusan konsentrasi versus apusan langsung. Sebuah penelitian yang dilakukan oleh
Barez dkk menunjukkan bahwa sensitifitas hampir sama pada kedua metode : 81,6%
untuk apusan langsung dan 82,7% untuk metode konsentrasi.14 Demikian pula
penelitian yang dilakukan oleh Cattamanchi dkk yang tidak menemukan perbedaan
antara metode apusan langsung dan apusan konsentrasi. Mereka melaporkan
sensitifitasnya adalah 51% dan 52% pada masing masing metode apusan langsung dan
apusan konsentrasi.15
Adapula penelitian lain yang menunjukkan teknik apusan konsentrasi lebih baik
daripada teknik apusan langsung. Salah satunya adalah penelitian yang dilakukan di
Bangladesh (negara endemik TB) oleh Uddin dkk dimana sependapat dengan pendapat
ini dan melaporkan sensitifitas dari apusan konsentrasi sebesar 83%, berbeda dengan
apusan langsung sebesar 71%.16 Penelitian lainnya yang sejalan adalah penelitian oleh
Peterson dkk yang dilakukan di dua laboratorium berbeda (laboratorium rumah sakit
pelayanan tersier dan beberapa klinik rawat jalan), ditemukan bahwa pada laboratorium
RS pelayanan tersier, apusan langsung dinyatakan kurang sensitif daripada apusan
sputum konsentrasi (masing-masing 28% dan 51%).17
Analisis statistik dari hasil kami menunjukkan bahwa efikasi dari apusan
konsentrasi tidak secara signifikan lebih baik dibandingkan dengan teknik apusan
langsung. Namun, dengan peningkatan jumlah kasus TB yang besar di India, teknik
apusan konsentrasi dapat secara signifikan meningkatkan kemampuan kita dalam
mendeteksi TB secara efisien. Selain itu, sputum konsentrasi saat di apus pada kaca
slide, menyebar rata dan menghasilkan gambar mikroskopis yang lebih jernih kepada
observer.
Menariknya, 33 sampel pada penelitian kami memiliki hasil negatif pada
pemeriksaan mikroskopis apusan langsung namun bernilai positif pada pemeriksaan
apusan konsentrasi. Meskipun secara statistik tidak signifikan, analisis kami
menyarankan bahwa kemampuan deteksi tambahan dari apusan konsentrasi ini sangat
penting. Dari 33 tersebut, 19 ditemukan positif pada pemeriksaan kultur. Hasil dari ke
33 sampel apusan konsentrasi tersebut ditunjukkan detil pada tabel 3. Pada sisi lain, 19

6
sampel yang ditemukan negatif pada apusan konsentrasi ditemukan positif pada apusan
langsung. Namun, 14 dari 19 pasien tersebut ditemukan positif pada pemeriksaan
kultur. Hal ini dapat terjadi karena pengumpulan yang salah, konsentrasi dan persiapan
sampel, pewarnaan yang tidak adekuat, atau karena observasi mikroskopik yang salah.
Penelitian berikutnya harus dilakukan untuk memastikan jika hal ini disebabkan oleh
human error.

Tabel 3. Distribusi dari 33 sampel yang bernilai BTA negatif melalui teknik
apusan langsung dan teknik apusan konsentrasi.

Concentrated Number
smear grade
Scanty 21
1+ 11
2+ 1
3+ 0
Total 33

Beberapa spesimen sputum positif pada kedua metode yaitu apusan langsung dan
apusan konsentrasi namun negatif pada pemeriksaan kultur. Data klinis menunjukkan
pasien tersebut mendapatkan OAT pada saat pengumpulan sputum. Selama pengobatan
berjalan, basil yang mati atau terbunuh tersisa di traktus respiratori (dahak) dan dapat
dideteksi dengan pemeriksaan mikroskopi namun tidak terdeteksi pada kultur.
Terdapat angka kejadian yang terus bertambah yang menunjukkan bahwa metode
konsentrasi lebih baik daripada metode langsung. Metode ini, walaupun sulit untuk
diimplementasikan pada laboratorium TB perifer di negara berkembang karena
beberapa kendala berikut : terbatasnya sumber daya listrik yang tidak teratur yang
mempengaruhi sentrifugasi dan pendinginan dari reagen; terbatasnya sumber finansial;
kurangnya tenaga ahli; kapasitas training yang tidak adekuat dan pengaturan biosafety
yang tidak adekuat.16 Kemudian, aerosolisasi dari basil TB selama sentrifugasi,
vortexing, dan penanganan sampel sputum konsentrasi menimbulkan ancaman bagi
tenaga kesehatan dilaboratorium tersebut. Kemudian, sterilitas dari reagen juga harus
dipastikan. Demikian pula syarat wajib untuk adanya fasilitas autoklaf.

7
 Pada negara endemik TB seperti India, kebanyakan unit pelayanan kesehatan
primer dan unit pelayanan kesehatan sekunder mengunakan pemeriksaan apusan
langsung untuk diagnosis TB dengan sensitivitas rendah. Bagaimana pun, sesuai dengan
hasil penelitian kami, dapat disebutkan bahwa mikroskopi apusan konsentrasi dapat
menggantikan mikroskopis apusan langsung pada pusat yang memiliki anggota terlatih,
back up tenaga listrik, dan fasilitas autoklaf. Hal ini akan membantu identifikasi
sejumlah besar kasus yang true positive pada stadium awal. Hal ini bila diterjemahkan
ke tingkat nasional dapat secara signifikan membantu melawan epidemiologi TB.
Secara bergantian, apusan konsentrasi dapat digunakan pada sampel sputum yang
bernilai negatif melalui pemeriksaan mikroskopis metode apusan langsung. Hal ini
dapat meningkatkan sensitivitas tanpa mengorbankan teknik lain untuk mendeteksi TB
yang telah ditetapkan. Perlu dicatat, bahwa teknik apusan konsentrasi mungkin bukan
merupakan alternatif terbaik dibandingkan metode mikroskopis apusan langsung,
mengingat biaya dan dan kebutuhan sumber daya yang lebih tinggi.
Teknik terbaru seperti mikroskopi fluorescent LED telah menunjukkan hal yang
menjanjikan dengan angka sensitivitas yang menjanjikan bila dibandingkan dengan
pewarna ZN konvensional dan mikroskop cahaya. LED FM menyediakan latar yang
lebih terang sehingga mempermudah teknisi untuk mengidentifikasi sediaan dengan
basil yang sedikit.18 Sejak pertengahan 2012, 200 perguruan tinggi kedokteran India
telah diinstruksikan untuk menggunakan teknik LED-FM daripada metode pewarnaan
ZN.19 Penelitian yang dilakukan Badri dkk menunjukkan bahwa teknik ini lebih baik
dalam mengambil kasus diduga TB-MDR pada saat pengumpulan sputum untuk follow-
up. Penelitian selanjutnya harus dilakukan untuk indentifikasi teknik mikroskopi yang
ideal pada deteksi TB.20
5. Kesimpulan
Sebagai kesimpulan, meskipun mendapatkan manfaat yang tidak signifikan dari
teknik pemeriksaan mikroskopi apusan konsentrasi dibandingkan dengan apusan
langsung dalam deteksi TB, kami merekomendasikan penggunaan teknik apusan
konsentrasi dimana fasilitas tersedia dengan baik. Peningkatan sensitifitas mungkin
muncul sedikit tapi dapat secara signifikan mengurangi jumlah kasus TB yang tidak
terdeteksi.

8
 6. Ringkasan
Penelitian ini dilakukan untuk mengkaji ulang teknik mikroskopis apusan sputum
konsentrasi, dan menilai efikasinya dalam deteksi tuberkulosis paru. Secara statistik,
tidak ada perbedaan yang signifikan yang didapatkan antara teknik apusan konsentrasi
dan metode apusan langsung konvensional. Namun, kami menyarankan penggunaan
metode konsentrasi pada laboratorium dengan fasilitas yang baik.