Pengaruh irigasi hipo-, iso- dan hipertonik pada sekresi

musin dan Kultur morfologi sel epitel hidung manusia

Abstrak
Kesimpulan. Kami berspekulasi bahwa garam isotonik adalah solusi irigasi yang paling
fisiologis dalam hal sekresi lendir dan morfologi seluler sel epitel hidung.

Objektif. Untuk menentukan konsentrasi garam paling fisiologis dan efektif untuk
irigasi hidung dalam hal sekresi lendir dan morfologi seluler dengan menggunakan sel-
sel epitel normal hidung manusia yang diobati dengan saline hipo-, iso- dan hipertonik.

Bahan dan metode. Sepenuhnya dibedakan bagian-2 sel-sel epitel normal hidung
manusia diobati dengan air murni dan dengan 0,3% (hipotonik), 0,9% (isotonik) dan 3%
(hipertonik) larutan garam. mRNA tingkat ekspresi MUC5AC dan MUC5B, yang
dikenal sebagai mucin saluran napas utama, dianalisis setelah 30 menit menggunakan
Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction. Sekresi musin total dan musin
MUC5AC dan MUC5B dianalisis menggunakan dot-blotting. Morfologi seluler diamati
dengan mikroskop cahaya setelah pewarnaan hematoxylin Eosin dan dengan Scanning
Electron Microscopy.

Hasil. Tingkat mRNA MUC5AC dan MUC5B tidak berubah setelah perlakuan dengan
air murni dan berbagai konsentrasi garam. Sekresi musin total dan musin MUC5AC
hanya meningkat setelah perlakuan dengan air murni, sementara sekresi mucin MUC5B
meningkat dengan perlakuan air murni, hipo- dan hipertonik.

Analisis morfologi mengungkapkan bahwa air murni merusak sel-sel epitel hidung
manusia yang normal dan hanya isotonik salin tidak mempengaruhi morfologi mereka.

Kata kunci: Irigasi, musin, lendir, saline, sekresi

Pengantar
Transpor mukosiliar (Clearance mukosiliar) adalah salah satu mekanisme pertahanan
yang paling penting dan memainkan peran penting dalam melindungi terhadap
rangsangan dan infeksi eksternal. Lendir epitel saluran napas terdiri dari dua lapisan:
lapisan lendir atas dan bagian bawah lapisan cairan periciliary [1]. Transpor mukosiliar
adalah terutama diatur oleh jumlah dan rheologic sifat dari musin yang disekresikan dan
oleh aktivitas siliaris; disfungsi dapat menghasilkan perkembangan atau bertambah nya
berbagai penyakit hidung. Meskipun transpor mukosiliar diketahui menurunkan
rinosinusitis kronik [2], perubahan ini adalah fungsi reversibel. Saat ini, irigasi hidung
dengan saline digunakan dalam berbagai penyakit hidung, seperti sinusitis kronis [3],
rinitis alergi [3,4] dan kistik fibrosis [5].

Saline isotonik sudah umum digunakan dalam irigasi hidung. Namun, sejak efek dari
saline hipertonik, seperti pengurangan edema karena tekanan osmotik diinduksi air
melalui transportasi membran epitel mukosa dan perbaikan dalam pembersihan
mukosiliar hidung, telah dilaporkan [5-7], penggunaan saline hipertonik dalam irigasi
hidung telah meningkat. Sebagai tambahan, saline hipertonik telah dilaporkan [5,6] untuk
memperbaiki transpor mukosiliar pada pasien dengan kistik fibrosis dan asma, seperti
serta pada mereka dengan penyakit hidung.

Namun, ada beberapa laporan[8] tentang efek dari berbagai konsentrasi garam pada
sekresi musin dan morfologi mukosa hidung. Karena itu, dalam hal ini kami belajar
menyelidiki efek dari berbagai konsentrasi saline pada ekspresi gen musin dan sekresi
musin dalam kultur sel epitel hidung manusia. Kami juga memeriksa sifat morfologi sel
menggunakan Scanning Electron Microscopy dan Light Microscopy.

Bahan dan metode

Air-Liquid Interface culture (ALI)

Passage-2 Normal Human Nasal Epithelial (NHNE) sel (1/105 sel / kultur) diunggulkan
dalam 0,5 ml medium kultur ke 24,5 mm, 0,45 mm pori Sisipan kultur yang jelas dari
Transwell (Costar Co., Cambridge,MA). Sel dikulturkan menggunakan campuran 1:1
medium pertumbuhan sel epitel bronkus dan Medium Eagle Dulbecco yang
dimodifikasi mengandung semua suplemen [9]. Kultur tumbuh terendam untuk 9 hari
pertama, selama waktu itu kultur sedang diubah pada hari pertama dan setiap hari hari
lain sesudahnya. Air-Liquid Interface (ALI) diciptakan pada hari kesembilan dengan
menghapus apikal sedang dan memberi makan kultur hanya dari basal kompartemen.
Media kultur berubah setiap hari setelah membuat ALI. Dua minggu setelahnya
pertemuan, sel NHNE diobati dengan saline selama 30 menit.

Pengobatan salin dan pengumpulan sampel

Sel kultur diperlakukan dengan 1 ml air murni (dietil pyrocarbonate, DEPC) dan dengan
berbagai perlakuan konsentrasi larutan garam (0,3%, 0,9%, 3%); larutan itu diberikan
pada sampel setelah 30 menit. Total RNA kemudian diekstraksi dari yang garam Sel
NHNE menggunakan Tri-Reagen (Penelitian Molekuler Center, Cincinnati, OH).

Reverse Trascriptase Polymerase Chain Reaction untuk sekretorik musin

Oligonucleotide primer untuk sekresi mucin mayor (MUC5AC, MUC5B) dirancang

menurut urutan diterbitkan [10]. Oligonucleotida amplimers untuk b2-microglobulin
(b2M; Clontech Laboratories Inc., Palo Alto, CA) digunakan sebagai kontrol dan
menghasilkan reaksi berantai polimerase 335-bp (PCR) fragmen. Reverse Transcriptase
(RT) –PCR reaksi dilakukan menggunakan Cetus DNA Thermal Cycler (Perkin-Elmer
Biosystems, Foster City, CA) sesuai dengan rekomendasi produksi.

Proses menguatkan dilakukan selama 1 menit di 55C untuk MUC5B dan pada 60C
untuk MUC5AC dan b2M. Kami menggunakan analisis kinetika komparatif untuk
membandingkan tingkat mRNA untuk setiap gen di bawah setiap set kondisi kultur,
seperti yang dijelaskan sebelumnya [9]. Produk PCR (MUC5AC, 580 bp; MUC5B, 338
bp) dipisahkan oleh elektroforesis pada gel Seakem agarose 2% (FMC, Rockland, ME)
mengandung 50 ng / ml ethidium bromide dan difoto dengan film Polaroid Type 55.
Setiap percobaan diulang tiga kali.

Imunodeteksi dan kuantisasi sekresi

Metode untuk mendeteksi sekresi dari sel kultur sebelumnya telah dijelaskan secara
detail [9]. Musin total disekresi (17Q2) dan musin MUC5AC dan MUC5B dideteksi
menggunakan tes imunoblot. Musin total disekresikan (17Q2) dideteksi menggunakan
antibodi 17Q2 (Covance Research Produk Inc., Berkeley, CA), monoklonal antibodi
terhadap musin manusia, musin MUC5AC dideteksi menggunakan poliklonal anti-
MUC5AC antibodi (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA) dan MUC5B
dideteksi menggunakan antibodi monoklonal MUC5B (Santa Cruz Biotechnology Inc.).
Pengenceran sekresi apikal adalah diterapkan pada membran nitroselulosa, yang mana
kemudian diinkubasi dengan antibodi primer yang sesuai. Ini diikuti oleh reaksi dengan
horse–radish peroksidase-terkonjugasi IgG anti-tikus atau IgG anti-kelinci. Sinyal
terdeteksi dengan cara chemiluminescence (ECL kit; Amersham, Little Chalfont, UK),
dan kurva standar dihasilkan dengan analisis regresi linier untuk menentukan
konsentrasi dari masing-masing sampel. Datanya adalah disajikan sebagai mean ±SD
dari rangkap tiga kultur dari percobaan yang sama. Perbandingan statistik dibuat
menggunakan t-test Student. Secara statistik P<0,05 adalah dianggap signifikan.

Pemeriksaan morfologis

Sel-sel kultur diperiksa setiap hari menggunakan fase mikroskop cahaya kontras (Vanox
S-type Light Mikroskop; Olympus, Jepang). Untuk pemeriksaan perubahan morfologi
sel tergantung saline , Sel NHNE diobati dengan saline pada permeabel membran,
difiksasi dalam 10% buffer netral formalin, tertanam dalam parafin dan dipotong. Sel-
sel itu kemudian diwarnai dengan hematoxylin- eosin. Untuk memindai studi
mikroskopi elektron, sel-sel yang diobati pada membran berpori telah diperbaiki
dengan dingin 2,5% glutaraldehyde selama 4-6 jam dan dicuci dengan 0,1 M PBS. Sel-
sel post-tetap dengan 1% osmium tetroxide selama 2 jam. Spesimen diamati
menggunakan mikroskop elektron scanning (H-800; Hitachi, Jepang).
Hasil
Ekspresi gen sekresi mucin dan sekresi musin

Tingkat mRNA MUC5AC dan MUC5B tidak dipengaruhi oleh perlakuan dengan air
murni atau beragam konsentrasi garam (Gambar 1).

Sekresi musin total (17Q2) meningkat secara signifikan dengan perlakuan air murni (4,0
± 0,3 kali lebih besar dari kontrol; p<0,5; Gambar 2A). Namun, tidak ada satupun
konsentrasi garam yang digunakan untuk percobaan secara signifikan mempengaruhi
sekresi musin total (Gambar 2A). Selanjutnya, kami mengukur sekresi MUC5AC dan
MUC5B, dua sekresi musin yang besar di jalan nafas manusia. MUC5AC musin
sekresi hanya meningkat dengan perlakuan air murni (5,6±1,4 kali lebih besar daripada
kontrol; p<0,5); tidak ada konsentrasi garam secara signifikan berubah Sekresi musin
MUC5AC (Gambar 2B). Dengan kondisi Sekresi MUC5B, terapi dengan air murni
(19,7 ± 2,1 kali lebih besar daripada kontrol; p<0,5), 0,3% saline (4,2±0,1 kali lebih
besar dari kontrol; p<0,5) dan 3% saline (10.9 ± 0.5 kali lebih besar dari kontrol; p<0.5)
secara tiba-tiba sekresi musin MUC5B meningkat secara signifikan (Gambar 2C),
sementara perlakuan dengan saline 0,9% tidak.

Perubahan morfologi kultur sel epitelial hidung manusia

Kami memeriksa perubahan morfologi sel NHNE menggunakan Scanning Electron

Microscopy Dan Light Microscopy. Dalam studi kontrol (tanpa perawatan), sel NHNE
sehat dan memiliki silia yang berdiferensiasi baik meliputi ≈50% dari permukaan sel.
integritas sel-dengan-sel dipertahankan (Gambar 3A). Dalam kelompok perlakuan
dengan air murni , sel NHNE mengalami kerusakan parah dan integrits sel-dengan-sel
nya hancur. Droplet mukus banyak disekresikan dari sel-sel sekretorik, dan jumlah total
silia yang mengandung sel menurun secara signifikan (Gambar 3B). Dalam Kelompok
perlakuan salin 0,3%, sel NHNE rusak sedang dan jumlah total silia yang mengandung
sel juga menurun secara signifikan.

Sekresi masif droplet mukus (dibuktikan dalam kelompok perlakuan air murni) tidak
diamati dalam kelompok ini (Gambar 3C). Dalam kelompok perlakuan saline 0,9%,
epitel tampak normal dan ditutupi dengan silia yang sehat. integritas sel-dengan-sel juga
tampak dipertahankan. Ekskresi droplet mukus tidak diamati (Gambar 3D).
Ketika sel diobati dengan 3% saline, beberapa lubang muncul di tempat di mana sel-sel
sekret yang terkelupas, tetapi integritas sel-dengan-sel dipertahankan (Gambar 3E).

Diskusi
Transpor mukosiliar (Clearance mukosiliar) dari epitel saluran napas terutama diatur
oleh aktivitas silia dan jumlah dan sifat rheologic dari lendir yang disekresikan.
Diketahui bahwa frekuensi gerakan silia berkurang dalam berbagai penyakit saluran
napas [2]. Dengan pemikiran ini, upaya telah dilakukan untuk meningkatkan aktivitas
siliaris dan transpor mukosiliar menggunakan hiper-, iso- atau irigasi salin hipotonik.
Namun, mengingat laporan tentang kurangnya korelasi langsung antara frekuensi
gerakan silia dan transpor mukosiliar [11] dan hasil kontradiktif mengenai efeknya
irigasi dengan berbagai konsentrasi garam aktivitas siliaris [3-8], dapat dispekulasikan
bahwa faktor paling penting yang menentukan transpor mukosiliar adalah jumlah dan
sifat rheologic dari lendir yang disekresikan.

Dengan demikian, dalam penelitian kami ini ditujukan untuk menganalisis tingkat
ekspresi gen dan sekresi dua mucin sekretori utama: MUC5AC dan MUC5B. Penelitian
kami juga ditujukan untuk memeriksa perubahan morfologi epitel hidung setelah
perawatan dengan berbagai konsentrasi larutan garam, dalam urutan untuk menentukan
konsentrasi garam yang paling fisiologis dan efektif untuk irigasi hidung.

Di sel NHNE, tingkat ekspresi MUC5AC dan MUC5B, dua gen musin besar di saluran
napas [12], tidak terpengaruh oleh pengobatan dengan air murni atau garam hipo-, iso-
atau hipertonik. Akibatnya, itu dapat diasumsikan bahwa jika ada perubahan dalam
sekresi musin dengan pengobatan salin kemudian sekresi lendir terutama diatur oleh
efek secretagogue lendir preformed, dan bukan oleh modulasi genetik gen mucin.

Peningkatan sekresi musin total hanya sebagai hasil dari pengobatan dengan air murni
(Gambar 2A). Namun, berbagai konsentrasi garam tidak mempengaruhi total sekresi
musin dari sel NHNE. Sekresi musin MUC5AC juga hanya meningkat dengan
pengobatan air murni (Gambar 2B). Namun, air murni dan garam hipo dan hipertonik
meningkatkan sekresi MUC5B (Gambar 2C). Di kelompok yang menjalani pengobatan
dengan saline hipertonik 3%, temuan yang menarik telah dicatat. Terjadi peningkatan
10,9 kali lipat dalam sekresi musin MUC5B, meskipun tidak ada peningkatan sekresi
musin total atau musin MUC5AC .

Ini menunjukkan bahwa jumlah dari MUC5B tidak mempengaruhi jumlah musin total,
seperti jumlah musin MUC5B yang disekresikan oleh kultur sel epitel hidung manusia
mungkin minimal. Berdasarkan hasil ini, kami menyarankan bahwa MUC5AC mungkin
merupakan sekresi mucin utama yang paling penting disekresikan oleh epitel saluran
napas. Dengan demikian, hasil ini menunjukkan bahwa pengobatan saline isotonik
adalah perawatan yang paling fisiologis karena saline isotonik tidak mempengaruhi
sekresi musin total atau musin MUC5AC dari kultur sel epitel hidung manusia.

Hingga saat ini, belum ada penelitian yang dilakukan terhadap perubahan morfologis
dari epitel hidung yang dianalisis setelah perawatan saline. Di laboratorium kami telah
menetapkan sistem kultur sel NHNE [13], dan kami berspekulasi bahwa dengan
memperlakukan permukaan apikal kultur sel epitel hidung dengan berbagai konsentrasi
garam sistem ini bisa meniru situasi nyata irigasi salin. Observasi morfologis
menunjukkan bahwa perawatan dengan air murni sel NHNE menghasilkan kerusakan
seluler yang parah dan pecah, serta sekresi aktif lendir dari sel mukosa (Gambar 3B).

Menurut untuk sekresi dan data morfologi, kami berspekulasi bahwa peningkatan
sekresi musin total setelahperawatan dengan air murni bisa dijelaskan oleh degranulasi
droplet mukus dari sel mukosa, salah satunya bisa disebabkan oleh efek secretagogue
atau oleh ekskresi lendir oleh penghancuran sel mukosa. Dalam kelompok pengobatan
saline 0,3% (hipotonik), kerusakan sel sangat minim, tetapi edema seluler dan tingkat
kerusakan silia moderat diamati (Gambar 3C).

Efek ini dianggap karena gradien tekanan osmotik antara saline dan sitoplasma
intraseluler. Dalam kelompok perlakuan saline 0,9% (isotonik) , silia sehat mencakup >
50% dari permukaan epitel (Gambar 3D), menunjukkan tidak ada kerusakan seluler. Ini
menyarankan bahwa garam isotonik adalah solusi irigasi paling fisiologis. Di kelompok
perlakuan garam 3% (hipertonik), beberapa lubang tampak jelas di tempat-tempat di
mana sekresi sel-sel telah terkelupas (Gambar 3E); Namun, itu tidak jelas saat ini
bagaimana sel-sel sekretorik dikelupas. Jumlah sel yang mengandung silia sedikit
menurun.

Kesimpulannya, hasil penelitian in vitro ini menunjukkan bahwa garam isotonik adalah
yang paling fisiologis untuk solusi irigasi dalam hal sekresi musin dan morfologi seluler
sel epitel hidung.

Ucapan terima kasih

Penelitian ini didukung oleh hibah penelitian fakultas
(No. 6-2004-92) dari Yonsei University College of
Kedokteran untuk 2004.