ACARA II

PENGUJIAN BAKTERI SALMONELLA

I. TUJUAN

Mahasiswa dapat melakukan pengujian bakteri Salmonella yang terdapat pada

beberapa komoditas hasil perkebunan.

II. DASAR TEORI

Salmonella Sp. Pertama kali ditemukan (diamati) pada penderita demam tifoid pada

tahun 1880 oleh Elberth dan dibenarkan oleh Robert Koch dalam budidaya bakteri pada

tahun 1881 (Todar, 2008). Salmonella Sp adalah bakteri berbentuk batang, pada pengecatan

berwarna merah (bakteri gram negatif, berukuran 2u-×0,6, memiliki flagel (kecuali S.

Gallinarum dan S pullorum), dan tidak berspora. Habitat salmonella Sp adalah pada saluran

pencernaan (usus halus) manusia dan hewan, suhu pertumbuhan salmonella Sp ialah 37oC

dan pada pH 6-8 (Julius, 1990).

Salmonella Sp bersifat anaerob dan aerob fakultatif. Pada media BAP (Blood Agar

Plate) menyebabkan hemolisi, pada MC (Mac Conkey) tidak memfermentasi laktosa atau

disebut non lactose fermentasi. Salmonella Sp mempermentasi glukosa, manitol, dan maltose

disertai pembentukan asam dan gas kecuali salmonella Thyphi yang tidak menghasil gas.

Kemudian pada indol negative, MR positif, dan Sitrat menghasilkan H2S.

Salmonella merupakan bakteri Gram negatif berbentuk batangfakultatif.

GenusSalmonella dinamai oleh seorang ahli patologi hewanAmerika yang bernama Daniel

Elmer Salmon, namun Theobald Smith adalah penemu sebenarnya dari

jenis bakteri ( Salmonella entericavar. choleraesuis) pada 1885,yang menyebabkan penyakit

enterik pada babi (Pratiwi, 2011).

 Berdasarkan hal tersebut, maka sampel yang diuji tidak memenuhi syarat British
Pharmacopoeia Volume IV Tahun 2005, yang seharusnya sediaan pemberian secara oral yang
mengandung bahan alam tidak boleh mengandung bakteri Salmonella typhii . Pencemaran ini
dapat disebabkan karena Salmonella typhii dapat mencemari sampel jamu secara langsung
atau tidak langsung melalui air yang tercemari oleh kotoran dari bahan mentah ataupun dari
peralatan yang dipakai.

Ciri-ciri dari bakteri Salmonella adalah sebagai berikut (Pratiwi,2011):

1. Berbentuk batang dengan ukuran tergantung jenis bakteri.

2. Bersifat Gram negatif.
3. Berkembang biak dengan cara membelah diri.
4. Tidak berspora dan bersifat aerob.
5. Motil (pergerakan) dengan menggunakan flagel.
6. Salmonella mudah tumbuh pada medium sederhana, tetapi hampir tidak pernah
memfermentasikan laktosa atau sukrosa.
7. Salmonella membentuk asam dan kadang-kadang gas dari glukosa danmanosa.
8. Salmonella resisten terhadap bahan kimia tertentu (misal, hijau brilian,natrium
tetrationat,natrium deoksikolat) yang menghambat bakteri enterik lain, oleh karena itu
senyawa – senyawa tersebut berguna untuk inklusiisolate salmonella dari feses pada
medium.
9. Struktur sel bakteriSalmonella terdiri dari : inti (nukleus), sitoplasma, dan dinding sel.
Karena dinding sel bakteri ini bersifat Gram negatif , maka memiliki struktur kimia
yang berbeda dengan bakteri Gram positif.

Penularan

Adapun cara penularan dari penyakit typhus adalah sebagai berikut:

1. Melalui makanan yang terkontaminasi oleh bakteri.

2. Melalui air untuk keperluan rumah tangga yang tidak memenuhi syarat kesehatan
3. Melalui daging, telur, susu yang berasal dari hewan sakit yang dimasak kurang
matang.

Makanan dan minuman berhubungan dengan binatang yang mengandung bakteri salmonella

typh, seperti lalat, tikus, kucing dan ayam. Setelah sembuh dari penyakitnya, penderita akan

kebal terhadap typhus, untuk waktu cukup lama. Interksi ulang (reinfeksi) dapat terjadi, tetapi

biasanya gejalanya sangat ringan.

III. METODELOGI PRAKTIKUM

A. ALAT

1. Tabung kultur 7. jarum inokulasi (ose)

2. Gelas ukur 8. pipet ukur 1 ml, 2ml, 5ml, 10ml

3. Cawan petri 9. gelas preparat

4. Pembakar Bunsen 10. waterbath

5. Autoclave 11. erlenmayer

6. Incubator 12. blender

B. BAHAN
1. Sampel uji
2. Lactose Broth (LB)
3. Seletine Cystine Broth (SCB)
4. Tertrathionate Brilliant Green Broth (TTB)
5. Tryptone Broth (TB)
6. Nutrient Agar (NA)
7. Plate Count Agar (PCA)
8. Urea Agar
9. Methyl Red – Voges Proskauer (MR-VP) Medium
10. Simmons Citrate agar atau Koser Citrate agar
11. Reagen Covacs
12. -naftol dan KOH 40%
 C. LANGKAH KERJA
1. Pra-pengayaan
a. Timbang 25 gram sampel uji, masukan kedalam blender atau plastic steril dan
tambahkan 225 ml LB. Homogenisasi selama ± 2 menit dengan kecepatan rendah.
b. Pindahkan suspensi ke Erlenmeyer atau wadah steril.
c. Inkubasi pada suhu 35C selama 24 jam ± 2 jam.
2. Pengkayaan
a. Aduk perlahan-lahan biakan pra pengkayaan dan ambil masing-masing 1 ml, pindahkan
kedalam 10 ml media TTB dan 10 l media SCB, sedangkan untuk media RV pindahkan
0,1 ml kedalam 10 ml media media RV.
b. Inkubasikan TTB dan SCB pada suhu 35C ± 2C selama 24 jam ± 2 jam, sedangkan
untuk media RV inkubasikan pada suhu 42C ± 0,2C selama 24 jam ± 2 jam.
3. Isolasi dan identifikasi
1. Ambil dari masing-masing media pengayaan yang telah diinkubasikan , 1 (satu) ose dan
diinokulasikan/digoreskan pada media H, XLD dan BSA. Inkubasikan pada suhu 35C
selama 24 jam ± 2 jam. Untuk BSA apabila bekum jelas dapat diinkubasikan lahi
selama 24 jam ± 2 jam.
2. Pembacaan koloni Salmonella sebagai berikut:
a. Pada media HE koloni berwarna hijau kebiruan dengan atau tanpa titik hitam (H2S).
b. Pada media XLD koloni terlihat merah muda (pink) dengan atau tanpa titik
meengkilat atau terlihat hamper seluruh koloni berwarna hitam.
c. Pada merdia BSA koloni terlihat keabu-abuan atau kehitaman, kadang metalik, media
disekitar koloni berwarna coklat dan semakin lama waktu inkubasi akan berubah
menjadi hitam.
3. Lakukan identifikasi ddengan mengambil koloni tersangak dari ketiga media diatas
denga ose dan inokulasikan ke TSIA dan LIA dengan cara menusuk ke dasar media
agar, selanjutnya digores pada media agar miring.
4. Inkubasikan TSIA dan LIA pada suhu 35C selama 24 jam ± 2 jam dengan
membiarkan tutup seddikit dikendurkan untuk menghindarkan produksi H2S berlebih.
Koloni spesifik akan memberikan reaksi seperti pada Tabel 3.
 Table 3. koloni spesifik Salmonella
Agar Miring Agar Dasar
Media H2S Gas
( Slant) (Bult)
Alkalin/K
TSI Asam/A
(merah) + (hitam) -/+
(kuning)

Alkalin/K Alkalin/K
LIA + (hitam) -/+
(ungu) (ungu)

uji biokimia

1. uji urease konvesnsional

inokulasikan dari TSIA tersangka dengan ose ke urea broth. Inkubasi pada suhu 35oC
selama 24 ± 2 jam.

2. Uji lysine Decarboxylase (LBD)

Uji ini dilakukan hanya jika LIA meragukan, ambil 1 ose dari TSIA inokulasikan ke
LBD, inkubasi selama 48 jam ± 2 jam 35oC dan diamati selama 24 jam. Salmonella
memberikan reaksi alkalin ditandai dengan warna ungu pada seluruh media, reaksi negative
memberikan warna kuning. Jika hasil reaksi meragukan (bukan ungu atau kuning) tambahkan
beberapa tets 0,2% bromerasol purple dye dan amatai perubahan warnannya.

3. Uji indol

Inokulisi dengan ose biakan dari media TSIA pada TB dan diinokulasikan pada suhu
35oC selama 24 jam ± 2 jam. Tambahkan 0,2-0,3 ml regen kovacs, amati segera setelah
penetesan. Reaksi positif ditandai dengan terbentuknya cicin merap pada permukaan, reaksi
negative terbentuk cincin kuning. Salmonella memberikan reaksi negative.

4. Uji methyl red

Inokulakukan dengan ose biakan dari media TSIA pada MR-VP dan ingkubasi pada
suhu 35oC selama 48 jam ± 2 jam. Tambahkan 5-6 tetes indicator methyl red baca hasil
segera. Hasil positif ditandai dengan terjadinya difusi warna merah dalam media. Hasil
negative ditandai dengan terjadinya warna kuning pada media.

5. Uji voges proskauers (VP)

Inokulasi dangan ose dari media TSIA pada MR_VP dan ingkubasikan pada suhu
35oC selama 48 jam ± 2 jam. Pindahkan 5 ml MR-VP broth kedalam tabung reaksi dan
tambahkan 0,6 ml larutan α-nafthol dan 0,2 ml larutan KOH 40%, kemudian digoyang-
goyang sampao tercampur dan didiamkan. Untuk mempercepat reaksi tambahkan sedikit
Kristal keratin, baca hasil selama 4 jam. Perubahan warna menjadi pink sampai merah delima
pada media adalah reaksi positif.

6. Uji Cirate

Inokulasi dengan ose biakan dari media TSIA pada SCA dengan menggores agar
miring dan menusuk pada agar dasar. Inokulasikan pada suhu 35oC selama 96 jam ± 2 jam.
Hasil positif ditandai dengan adanya pertumbuhan koloni yang diikuti perubahan warna dari
hijau menjadi biru. Hasil negative ditandai dengan tidak adanya atau sedikit sekali
pertumbuhan koloni dan tida terjadi perubahan warna.
 IV. DATA PENGAMATAN

KOLONI HASIL IDENTIFIKASI

HASIL (MEDIA TSIA) UJI UJI UJI UJI UJI KESIMPULAN
NO SAMPEL
ISOLASI GAS ASAM H2S UREASE INDOL (MR) (VP) SITRAT SALMONELLA
(MEDIA BSA)
JEROAN
1 √ √ - √
IKAN
 V. PEMBAHASAN

Dalam praktikum kali ini dilakukan uji untuk mengidentifikasi adanya salmonella didalam

jeroan ikan.Metode yang digunakan yakni metode analisa secara kualitatif yakni bertujuan

untuk mengetahui ada tidaknya suatu bakteri salmonella dalam suatu makanan.

a. Metode Analisa Kualitatif

Pada pengujian identifikasi bakteri Salmonella metode yang digunakan adalah metode

analisa secara kualitatif. Pada metode analisa kualitatif ini memiliki tahapan – tahapan

tertentu dengan tujuan untuk mengetahui ada tidaknya suatu mikroorganisme dalam

makanan.

Prinsip pengujian deteksi Salmonella menurut Metode Analisis Mikrobiologi (MA PPOM

74/MIK/06) yaitu ada empat tahap untuk mendeteksi adanya Salmonella :

1. Pra. Pengkayaan dalam media cair non selektif yang di inkubasi pada suhu 35C

selama 24 jam ± 2 jam

2. Pengkayaan dalam media cair selektif yang diinkubasi pada 41,5 + 1° C selama 24 ±

3 jam dalam RVS cair dan 37±1° C selama 24±3 jam MKTTn cair.

3. Inokulasi & identifikasi dalam 2 media padat selektif, media selektif pertama

diinkubasi pada 37±1° C selama 24±3 jam dan dengan media yang digunakan.

4. Konfirmasi terhadap identitas Salmonella dengan uji biokimia dan serologi.

Pada pengujan deteksi Salmonella

b. Uji Salmonella

Uji Salmonella digunakan untuk menetapkan adanya Salmonella dalam makanan.

Salmonella merupakan bakteri gram-negatif berbentuk tongkat yang menyebabkan tifus,

paratifus, dan penyakit foodborne. Salmonella terdiri dari sekitar 2500 serotipe yang

kesemuanya diketahui bersifat pathogen baik pada manusia atau hewan.

Pada pengujian salmonella ini dibuat juga kontrol positif yaitu sampel yang telah

diberi biakan kultur salmonella sebagai pembanding. Dari pengkayaan selektif, biakan dari

MKTTn dan RVS diinokulasikanpada media BGA dan XLD untuk tahap inokulasi dan

identifikasi. Pada tahap ini hanya biakan dari BGA yang berasal dari MKTTn yang

menunjukkan pertumbuhan koloni. Sedangkan pada media XLD tidak ada pertumbuhan

koloni. Selanjutnya koloni dari biakan BGA dilakukan uji identifikasi yaitu uji biokimia dan

uji serologi. Uji biokimia yang dilakukan antar lain sebgai berikut :

1. Uji TSIA

Pada uji TSIA warna media slant berubah menjadi merah karena bakteri bersifat basa

ini menandakan bahwa bakteri ini tidak memfermentasi laktosa dan sukrosa. Pada media

daerah butt media berubah berwarna kuning ini menandakan bakteri memfermentasi glukosa.

Pembentukan gas positif ini hasil dari fermentasi H2 dan CO2 dapat dilihat dari pecahnya dan

terangkatnya agar. Pembentukan H2S positif ditandai dengan adanya endapan berwarna

hitam. TSIA agar mengadung laktosa dan sukrosa dalam konsentrasi 1%, glukosa 0,1% dan

phenol red sebagai indikator yang menyebabkan perubahan warna dari merah orange menjadi

kuning dalam suasana asam. TSIA juga mengandung natrium trisulfat, yaitu suatu substrat

untuk penghasil H2S, ferro sulfat menghasilkan FeS (precipitat), bewarna hitam untuk

membedakan bakteri H2S dengan bakteri-bakteri lainnya.

2. Uji urease
 Uji urease digunakan untuk mengetahui kemampuan mikroba menghidrolisis urea

menjadi amonia. Enzim urease akan menguraikan urea menjadi amonia. Uji urease

menunjukkan hasil positif jika terjadi perubahan warna dari kuning menjadi merah keunguan.

Hasil uji urease negatif jika tidak terjadi perubahan warna dari kuning menjadi merah

keunguan.

3. Uji Dekar boksilasi Lysin

Uji Dekarboksilasi Lysin menggunakan media Xylose-Lysine- Desoxycholate Agar

medium digunakan untuk isolasi Salmonella danmemilah organisme lain dengan cara

memfermentasi xylose, dekarboksilasi lysine dan produksi H2S. Fermentasi xylose sangat

lazim bagi kebanyakan organisme enterik kecuali, Shigella, Providencia, Edwardsiella. Pada

media ini, Salmonella akan membentuk koloni merah dengan inti hitam,

sedang Pseudomonas dapat tumbuh dengan warna merah dan Eschericia berwarna kuning.

Mikroba lain yang dapat tumbuh pada media ini antara lain Arizona, Proteus, Aerobacter,

Klebsiella, Citrobacter. Begitu banyak mikroba yang dapat tumbuh, sehingga media ini

kurang dapat memilah Salmonella pada tahap awal. Lebih baik digunakan untuk tahap

konfirmasi kontaminan Salmonella.

4. Uji Indol

Uji Indol bertujuan untuk menentukan kemampuan bakteri dalam memecah asam

amino triptofan. Media ini biasanya digunakan dalam indetifikasi yang cepat. Hasil uji indol

yang diperoleh negatif karena tidak terbentuk lapisan (cincin) berwarna merah muda pada

permukaan biakan, artinya bakteri ini tidak membentuk indol dari tryptopan sebagai sumber

karbon, yang dapat diketahui dengan menambahkan larutan kovacs. Asam amino triptofan

merupakan komponen asam amino yang lazim terdapat pada protein, sehingga asam amino

ini dengan mudah dapat digunakan oleh mikroorganisme akibat penguraian protein.
 5. Uji Voges Proskauer

Uji Voges Proskauer bertujuan untuk mengidentifikasi jenis bakteri Untuk

membedakan bakteri Escherichia coli dengan Enterobacter aerogenes. Hasilnya uji ini

negatif, karena tidak terbentuk warna merah pada medium setelah ditambahkan á-napthol dan

KOH, artinya hasil akhir fermentasi bakteri ini bukan asetil metil karbinol

(asetolin). Salmonella positif jika pada uji biokimia yang dilakukan hasilnya sebagai berikut:

a. TSIA : butt (+), slant (-), gas positif atau negatif dan H2S positif atau negatif.

b. Hidrolisis urea : negative

c. Dekarbosilasi lysine : positif

d. Reaksi voges proskauer : negative

e. Produksi indol : negative

Pada biakan contoh setelah dilakukan uji biokimia dan serologi didapatkan hasil sebagai

berikut:

a. TSIA : butt (-), slant (-), gas negatif dan H2S negatif.

b. Hidrolisis urea : positif

c. Dekarbosilasi lysine : negative

d. Reaksi voges proskauer : negatif·

e. Produksi indol : negative