Milk Oligosaccharides Inhibit Human Rotavirus Infectivity in MA104 Cells

Daniel R Laucirica,1 Vassilis Triantis,2 Ruud Schoemaker,2 Mary K Estes,1 and

Sasirekha Ramani1

1 Departemen Virologi Molekuler dan Mikrobiologi, Fakultas Kedokteran Baylor,

Houston, TX; dan 2 FrieslandCampina, Amersfoort, Belanda

Abstrak
Latar belakang: Oligosakarida dalam ASI berperan sebagai reseptor umpan yang dapat larut
dan mencegah adhesi patogen pada usus bayi. Oligosakarida susu mengurangi infektivitas
strain rotavirus babi; Namun, efeknya pada rotavirus manusia kurang dimengerti.
Tujuan: Dalam penelitian ini, kami menentukan efek oligosakarida susu spesifik dan
berlimpah pada infektivitas 2 strain rotavirus manusia yang dominan secara global.
Metode: Empat susu oligosakarida — 2 # -fucosyllactose (2 # FL), 3 # -sialilaktosa (3 # SL),
6 # -sialilaktosa (6 # SL), dan galacto-oligosakarida — diuji untuk pengaruhnya terhadap
infektifitas bakteri. human rotavirus G1P [8] dan G2P [4] melalui uji fokus fluoresen pada sel
epitel ginjal monyet hijau Afrika (sel MA104). Oligosakarida ditambahkan pada titik waktu
yang berbeda dalam tes infektivitas. Infeksi tanpa adanya oligosakarida berperan sebagai
kontrol.
Hasil: Bila dibandingkan dengan infeksi tanpa glisans, semua oligosakarida secara substansial
mengurangi infektivitas kedua jenis virus rota manusia secara in vitro; Namun, perbedaan
khusus pada efek virus diamati. Dibandingkan dengan infeksi kontrol, pengurangan maksimum
dalam infektivitas G1P [8] terlihat dengan 2 # FL ketika ditambahkan setelah timbulnya infeksi
(pengurangan 62%, P <0,01), sedangkan pengurangan maksimum dalam infektivitas G2P [4]
terlihat dengan campuran 3 # SL + 6 # SL bila ditambahkan selama infeksi (pengurangan 73%,
P <0,01). Campuran 3 # SL + 6 # SL pada rasio yang sama seperti yang ada dalam ASI lebih
kuat dalam mengurangi infektivitas G2P [4] (pengurangan 73%, P <0,01) dibandingkan bila
dibandingkan dengan 3 # SL (pengurangan 47%) ) atau 6 # SL (pengurangan 40%) secara
individual. Untuk semua oligosakarida pengurangan infektivitas dimediasi oleh efek pada virus
dan bukan pada sel.
Kesimpulan: Susu oligosakarida mengurangi infektivitas rotavirus manusia dalam sel MA104,
terutama melalui efek pada virus. Meskipun bayi yang diberi ASI secara langsung dilindungi,
penambahan oligosakarida spesifik untuk susu formula bayi dapat memberikan manfaat ini
untuk bayi yang diberi susu formula. J Nutr 2017; 147: 1709–14
Kata kunci: oligosakarida susu manusia, reseptor umpan, rotavirus, infeksi, 2 # -
fucosyllactose, sialoglycans

Pendahuluan
Oligosakarida susu manusia (HMO) adalah kelompok yang kompleks secara struktural,
glikans tak terkonjugasi yang ditemukan dalam ASI. Rata-rata, ASI manusia mengandung 5-
15 g oligosakarida / L, menjadikan HMO komponen padat ketiga yang paling banyak dari ASI
setelah lipid dan laktosa.1 Profil oligosakarida dalam ASI beragam, dengan 200 struktur
berbeda diidentifikasi sampai saat ini.2 Pertama kali dideskripsikan sebagai substrat prebiotik
untuk mikrobiota usus bayi, HMO sekarang diakui memainkan banyak peran bermanfaat dalam
neonatus yang sedang berkembang. HMO memodulasi imunitas neonatal dengan mengubah
respon sel epitel dan imun inang dalam usus bayi dan bertindak sebagai reseptor pemikat yang
larut untuk memblokir perlekatan berbagai mikroba patogen ke reseptor permukaan sel.1
Penelitian in vitro menunjukkan bahwa HMO mencegah pengikatan dan infeksi sel oleh
sejumlah patogen diare seperti Escherichia coli, Vibrio cholerae, dan Salmonella fyris.3 Sebuah
studi populasi pada pasangan ibu-bayi menunjukkan bahwa konsentrasi
fucosyloligosaccharides 2 # -linked yang lebih tinggi (2 # FL) dalam ASI berhubungan dengan
perlindungan terhadap diare yang disebabkan oleh bakteri Campylo dan calicivirus.4
Penyakit diare adalah penyebab utama kematian kedua di dunia pada anak-anak <5
tahun. Di antara agen penyebab diare pada kelompok usia ini, rotavirus adalah penyebab utama
gastroenteritis dehidrasi parah dan bertanggung jawab atas> 215.000 kematian setiap
tahunnya.5 Vaksin terhadap rotavirus dilisensikan untuk digunakan pada tahun 2006 dan telah
efektif dalam mengurangi kejadian penyakit rotavirus parah di negara maju.6 Namun,
kemanjuran vaksin rotavirus jauh lebih rendah di negara-negara berkembang, di mana sebagian
besar kasus gastroenteritis rotavirus parah terjadi.5,6 Studi epidemiologis telah menunjukkan
manfaat perlindungan dari menyusui terhadap gastroenteritis rotavirus parah, dengan anak-
anak yang tidak disusui menunjukkan peningkatan risiko dua kali lipat dari diare yang
disebabkan oleh rotavirus.7,8 Tingkat antigenemia rotavirus lebih rendah pada bayi yang disusui
daripada bayi yang tidak disusui.9 Beberapa komponen susu telah terbukti menghasilkan
perlindungan terhadap infeksi rotavirus. Antibodi ASI terhadap rotavirus berkorelasi dengan
perlindungan terhadap infeksi pada neonatus, dan anti-rotavirus IgA dari ASI manusia
memiliki efek menetralkan pada infektivitas rotavirus secara in vitro.10,11 Dalam sebuah kohort
pasangan ibu-bayi di Meksiko, kadar lactadherin protein globule lemak yang lebih tinggi
dikaitkan dengan perlindungan terhadap infeksi rotavirus simtomatik.12 Peran oligosakarida
susu dalam perlindungan dari infeksi rotavirus manusia kurang dipahami dengan baik. Bukti
langsung untuk pengikatan rotavirus ke HMO ditunjukkan melalui studi array glycan. Domain
pengikat glikat (VP8*) dari protein kapsid rotavirus VP4 menunjukkan pengikatan pada
berbagai HMO pada susunan gula shotgun yang dikembangkan melalui penggunaan kumpulan
sampel susu donor, dengan perbedaan spesifik-regangan pada mitra pengikat.13 HMOs 3 # -
sialyllactose (3 # SL) dan 6 # -sialyllactose (6 # SL) menghambat infektivitas strain rotavirus
babi OSU (Ohio State University) baik secara in vitro maupun dalam model loop ileal babi;
Namun, efek ini tidak diamati ketika strain rotavirus manusia diuji.14 Durasi diare yang
diinduksi rotavirus dengan OSU juga berkurang pada anak babi yang diberi campuran galacto-
oligosaccharides rantai pendek (GOS) dan fructo-oligosaccharides rantai panjang; Namun,
efek dari senyawa ini pada strain rotavirus manusia tidak dinilai.15 Dalam penelitian ini, kami
menguji efek oligosakarida susu spesifik dan berlimpah pada infektivitas 2 strain rotavirus
manusia yang dominan secara global dalam sistem infektivitas in vitro.

Metode
Sel dan virus
Infeksi rotavirus dilakukan pada sel epitel ginjal monyet hijau Afrika (sel MA104),
model mapan untuk studi rotavirus in vitro.16 Dua strain rotavirus manusia, Wa dan DS1,
masing-masing mewakili genotipe dominan global G1P [8] dan G2P [4], diuji. Oligosakarida
susu. Kemurnian tinggi (> 95%) oligosakarida 3 # SL dan 6 # SL (keduanya dari IsoSep), 2 #
FL, dan galacto-oligosaccharides [(Vivinal GOS) yang terakhir 2 dari FrieslandCampina
DOMO] diuji untuk efeknya terhadap infektivitas rotavirus. Komponen Vivinal GOS telah
dijelaskan sebelumnya.17 Oligosakarida (konsentrasi 2,5 dan 5,0 mg / mL) dilarutkan dalam
DMEM bebas serum dan disaring dengan melewatkan larutan melalui filter 0,22 mm. DMEM
bebas serum tanpa oligosakarida yang difilter melalui filter 0,22 mm digunakan sebagai kontrol
dalam setiap percobaan.

Tes infektivitas
Efek oligosakarida susu pada infektivitas rotavirus dinilai melalui uji fokus fluoresen standar
pada sel MA104.14,18 Pengenceran virus G1P [8] dan G2P [4] yang menghasilkan, 100-200 unit
pembentuk fokus / sumur diuji.
GAMBAR 1 Skema kondisi percobaan. Panah hitam dan abu-abu menunjukkan ada dan tidak
adanya oligosakarida 2 # fucosyllactose, galacto-oligosaccharides, 3 # sialyllactose, dan 6 #
sialyllactose di berbagai titik.

Oligosakarida pertama kali ditambahkan selama inokulasi virus dan selama infeksi untuk
menentukan efek pada infektivitas rotavirus (Gambar 1, kondisi 1). Modifikasi protokol ini
kemudian digunakan untuk menilai secara spesifik mode aktivitas oligosakarida dan efek
waktu penambahan oligosakarida pada infektivitas virus (Gambar 1, kondisi 2-6 dan Gambar
Tambahan 1).18-20 Dalam semua percobaan, infektivitas dengan tidak adanya oligosakarida
berfungsi sebagai kontrol. Metode terperinci untuk pengujian infektivitas disediakan dalam
metode Tambahan.

Analisis data
Setiap kondisi percobaan diuji minimum3 kali, dengan replikasi teknis untuk setiap
virus dan konsentrasi oligosakarida dimasukkan dalam setiap pengujian. Sarana dan SD dari
minimal 6 titik data diwakili untuk setiap kondisi dalam tabel dan gambar. Untuk setiap
percobaan, titer virus yang diukur dengan tidak adanya oligosakarida dianggap 100%
infektivitas, dan perubahan titer virus di hadapan oligosakarida dinyatakan sebagai persentase
infektivitas dibandingkan dengan tanpa perawatan oligosakarida. Untuk setiap kondisi,
persentase infektivitas di hadapan setiap oligosakarida dibandingkan dengan persentase
infektivitas tanpa adanya oligosakarida. Dengan pengecualian data yang disajikan pada Tabel
1, di mana efek kombinasi 3 # SL + 6 # SL dibandingkan dengan 3 # SL dan 6 # SL secara
individual, tidak ada perbandingan antara oligosakarida yang berbeda atau antara 2 konsentrasi
oligosakarida yang sama telah dilakukan. Semua analisis statistik dilakukan dengan
menggunakan ANOVA dengan uji post hoc Dunnett pada GraphPad Prism versi 6.0 untuk
Windows (Perangkat Lunak GraphPad). Nilai P yang disesuaikan dengan multiplisitas
ditentukan dan nilai P <0,01 dianggap signifikan secara statistik.

Hasil
Efek oligosakarida susu pada infektivitas virus. Dua konsentrasi masing-masing
oligosakarida diuji untuk menentukan efek pada infektivitas rotavirus (Gambar 1, kondisi 1).
Dibandingkan dengan infeksi yang dilakukan dengan tidak adanya oligosakarida, penurunan
signifikan dalam infektivitas G1P [8] (Gambar 2A) dan G2P [4] (Gambar 2B) diamati dengan
semua 4 oligosakarida pada 5 mg / mL. Pada konsentrasi oligosakarida yang lebih rendah (2,5
mg / mL), pengurangan signifikan dalam infektivitas G1P [8] dan G2P [4] diamati dengan
oligosakarida sialylated 3 # SL dan 6 # SL, tetapi tidak dengan GOS atau 2 # FL. Secara
keseluruhan, kami mengamati penurunan 16-40% dalam infektivitas untuk G1P [8] dan
pengurangan 15-47% untuk G2P [4] dengan oligosakarida individu (Tambahan Tabel 1).
3 # SL dan 6 # SL adalah HMO sialilasi paling banyak dan telah terbukti mengurangi
infektivitas rotavirus babi OSU in vitro.14 Untuk menentukan apakah efek penghambatan 3 #
SL dan 6 # SL dapat ditingkatkan dengan campuran oligosakarbon ini, tes infektivitas
dilakukan dengan kombinasi 3 # SL + 6 # SL pada rasio yang sama dengan yang ada pada
manusia. ASI (29%: 71%). Meskipun campuran SL tidak lebih efektif
TABEL 1 Kombinasi dari 3 # SL dan 6 # SL meningkatkan pengurangan infektivitas G2P [4]
tetapi tidak infektivitas G1P [8] dibandingkan dengan masing-masing glycan saja dalam sel
MA1041
Infectivity, % of
no oligosaccharide control

Virus Concentration, mg/mL 3#SL 6#SL 3#SL + 6#SL

G1P[8] 2.5 73 6 12* 75 6 7* 68 6 13*

5.0 60 6 9* 63 6 7* 65 6 14*
G2P[4] 2.5 54 6 2*,# 66 6 5*,# 32 6 6*
5.0 53 6 4*,# 60 6 12*,# 27 6 4*
Nilai rata-rata adalah 6 SD, n = 3. Infektivitas dengan tidak adanya oligosakarida dianggap
100% (G1P [8]: 100% 6 8%, G2P [4]: 100% 6 16%). Data diekspresikan relatif terhadap
kontrol no-oligosaccharide. * Berbeda dari kontrol, P, 0,01; # berbeda dari 3 # SL + 6 # SL, P,
0,01. MA104, sel epitel ginjal monyet hijau Afrika; 3 # SL, 3 # -sialyllactose; 6 # SL, 6 # -
sialyllactose.

GAMBAR 2 Susu oligosakarida mengurangi infektivitas strain rotavirus manusia dalam sel
MA104. Efek oligosakarida susu (2 # FL, GOS, 3 # SL, dan 6 # SL) pada infektivitas 2 strain
rotavirus manusia yang relevan secara klinis G1P [8] (A) dan G2P [4] (B) diuji (lihat Gambar
1, kondisi 1 untuk pengaturan eksperimental). Data berarti 6 SD, dan $ 3 percobaan
independen. Infektivitas dengan tidak adanya oligosakarida dianggap 100% (G1P [8]: 100% 6
8%, G2P [4]: 100% 6 16%) (garis putus-putus hitam). Data diekspresikan relatif terhadap
kontrol no-oligosaccharide. * Berbeda dari kontrol, P, 0,01. GOS, galacto-oligosaccharide;
MA104, sel epitel ginjal monyet hijau Afrika; 2 # FL, 2 # -fucosyllactose; 3 # SL, 3 # -
sialyllactose; 6 # SL, 6 # -sialyllactose. mengurangi infektivitas G1P [8] dari 3 # SL dan 6 #
SL bila digunakan secara terpisah, kombinasi dari glycans ini lebih kuat dalam mengurangi
infektivitas G2P [4] daripada reduksi yang diamati dengan glycans sialylated individu (Tabel
1). Campuran SL juga secara signifikan mengurangi infektivitas G2P [4] dibandingkan dengan
GOS atau 2 # FL (data tidak ditampilkan). Hasil ini menunjukkan bahwa 3 # SL dan 6 # SL
bisa lebih efektif dalam menghambat infeksi rotavirus manusia dalam kombinasi, tetapi efek
ini tergantung pada genotipe rotavirus.
Mode aktivitas. Pengurangan infektivitas rotavirus dapat dimediasi oleh efek oligosakarida
susu pada sel MA104 atau langsung pada virus. Untuk menentukan apakah oligosakarida
memiliki efek langsung pada virus, G1P [8] dan G2P [4] dipreinkubasi dengan oligosakarida
pada suhu 37 ° C selama 2 jam sebelum infeksi (Gambar 1, kondisi 2). Atau, sel MA104 diobati
dengan oligosakarida susu semalaman pada suhu 37 ° C (Gambar 1, kondisi 3). Sel-sel
dipretreatment untuk durasi yang lebih lama karena tidak ada perbedaan infektivitas yang
diamati dengan pretreatment sel selama 2 jam (data tidak ditunjukkan), dan inkubasi sel Caco-
2 yang diperpanjang dengan adanya oligosakarbon susu telah dibuktikan untuk mengubah
ekspresi permukaan glikus sel dan mempengaruhi adhesi E. coli enteropatogenik.18 Setelah
pretreatment virus dengan oligosakarida, reduksi substansial diamati untuk infektivitas G1P
[8] di semua kecuali satu kondisi (2,5 mg / mL 2 # FL), dengan kisaran 10-39% penurunan
infeksi (Gambar 3A). , Tabel Tambahan 1). Pengurangan signifikan dalam infektivitas diamati
di hadapan semua oligosakarida pada kedua dosis untuk G2P [4], dengan kisaran pengurangan
38-67% dalam
GAMBAR 3 Susu oligosakarida mengurangi infektivitas strain rotavirus manusia melalui efek
pada virus dan bukan sel MA104. Preinkubasi virus selama 2 jam dengan adanya oligosakarida
susu (2 # FL, GOS, 3 # SL, dan 6 # SL) mengurangi infektivitas strain rotavirus manusia G1P
[8] (A) dan G2P [4] (B) (lihat Gambar 1, kondisi 2 untuk pengaturan eksperimental), sedangkan
preinkubasi sel dengan adanya oligosakarida susu selama 24 jam tidak mengurangi infektivitas
kedua galur [G1P [8] (C) dan G2P [4] (D); lihat Gambar 1, kondisi 3 untuk pengaturan
eksperimental]. Data berarti 6 SD, dan $ 3 percobaan independen. Infektivitas tanpa adanya
oligosakarida dianggap 100% (G1P [8]: 100% 6 10%, G2P [4]: 100% 6 9%).

infektivitas di semua kondisi (Gambar 3B, Tabel Tambahan 1). Tidak ada pengurangan
infektivitas G1P [8] atau G2P [4] yang terlihat ketika sel-sel tersebut diobati dengan
oligosakarida (Gambar 3C, D). Selanjutnya, efek 5 mg / mL 2 # FL dan 3 # SL + 6 # SL pada
pengikatan dan entri virus dinilai (Tambahan Gambar 1). Tidak ada perbedaan yang signifikan
dalam antigen virus yang terlihat dengan ELISA setelah pengikatan campuran virus-
oligosakarida ke sel pada suhu 4 ° C selama 1 jam bila dibandingkan dengan pengobatan tanpa-
glycan (data tidak ditunjukkan). Ini sebagian mungkin merupakan hasil dari keterbatasan
sensitivitas ELISA di mana perbedaan dalam nilai kepadatan optik mungkin tidak diamati
ketika titer virus berbeda 50%. Pengurangan yang signifikan dalam pewarnaan virus
intraseluler diamati, bagaimanapun, dengan oligosakarida untuk G1P [8] (Gambar Tambahan
2A) dan G2P [4] (Gambar Tambahan 2B) setelah pengikatan pada suhu 4 ° C. Virus dibiarkan
menginternalisasi pada suhu 37 ° C selama 1 jam dan sel-sel diperbaiki sebelum menyelesaikan
1 putaran replikasi virus. Secara keseluruhan, hasil kami menunjukkan bahwa oligosakarida
susu mengurangi infektivitas rotavirus manusia dengan bertindak terutama pada virus.
Sebanyak 2,5 mg / mL GOS, 2 # FL, atau campuran 3 # SL + 6 # SL digunakan untuk
pretreatment virus selama 2 jam dan ditambahkan selama infeksi untuk menentukan apakah
pengurangan infektivitas lebih lanjut dapat dicapai, khususnya untuk konsentrasi oligosakarida
yang lebih rendah, jika virus dipretreatment dan oligosakarida juga dipertahankan dalam
medium selama infeksi (Gambar 1, kondisi 4). Keberadaan oligosakarida yang terus menerus
tidak secara signifikan meningkatkan reduksi untuk kedua strain dibandingkan dengan
pretreatment saja atau keberadaan glycan hanya selama infeksi. Satu-satunya pengecualian
adalah untuk G2P [4] dan 2 # FL, di mana kehadiran yang terus-menerus dari glycan
menghasilkan penurunan 47% dalam infektivitas dibandingkan dengan pengurangan 15%
ketika 2 # FL dimasukkan hanya selama infeksi (Tambahan Tabel 1 ).
Kami selanjutnya ingin menentukan apakah oligosakarida susu memiliki efek pada infektivitas
ketika ditambahkan setelah penyerapan virus pada sel (Gambar 1, kondisi 5). Pengurangan
besar dalam infektivitas diamati di hadapan semua oligosakarida untuk infeksi G1P [8], dengan
pengurangan mulai dari 29% hingga 62% (Gambar 4A). Besarnya pengurangan lebih besar
dengan 2 # FL dan campuran SL daripada apa yang terlihat dengan pretreatment virus dan /
atau keberadaan oligosakarida selama infeksi. Untuk strain G2P [4], pengurangan yang
signifikan hanya diamati dengan 2 # FL (45%, P <0,01; Gambar 4B). Karena periode infeksi
15-jam dapat mencakup 2 siklus replikasi rotavirus, ada kemungkinan bahwa pengurangan
infektivitas dimediasi oleh efek pada partikel virus yang baru disintesis, daripada efek pada
replikasi virus dalam sel. Memang, tidak ada efek yang terlihat ketika infeksi dihentikan pada
6 jam (Gambar 1, kondisi 6), sesuai dengan satu siklus replikasi, setelah infeksi sel selama 20
menit dan penambahan oligosakarida (data tidak ditampilkan). Temuan ini mengkonfirmasi
bahwa oligosakarida susu dapat mengurangi infektivitas rotavirus manusia bahkan setelah awal
infeksi.

Diskusi
Pemblokiran perlekatan mikroba ke sel inang oleh oligo sakarida susu telah dijelaskan untuk
sejumlah patogen enterik. Campylobacter jejuni mengikat H-2 antigen histo-golongan darah
kelompok (HBGA) yang diekspresikan pada permukaan sel inang, dan pengikatan dan infeksi
sel-sel inang dihambat oleh oligosakarida terfosilasi yang menunjukkan kemiripan struktural
dengan H-2 HBGA (22). Oligosakarida susu selama 24 jam tidak mengurangi infektivitas
keduanya
GAMBAR 4 Penambahan oligosakarida setelah penyerapan virus mengurangi infektivitas
strain rotavirus manusia dalam sel MA104. Penambahan oligosakarida (2 # FL, GOS, 3 # SL,
dan 6 # SL) setelah penyerapan G1P [8] (A) dan G2P [4] (B) selama 20 menit mengurangi
infektivitas kedua strain (lihat Gambar 1, kondisi 5 untuk pengaturan eksperimental). Data
berarti 6 SD, dan $ 3 percobaan. Infektivitas tanpa adanya oligosakarida dianggap 100% (G1P
[8]: 100% 6 10%, G2P [4]: 100% 6 18%) (garis putus-putus hitam). Data diekspresikan relatif
terhadap kontrol no-oligosaccharide. * Berbeda dari kontrol, P, 0,01. GOS, galacto-
oligosaccharide; MA104, sel epitel ginjal monyet hijau Afrika; 2 # FL, 2 # - fucosyllactose; 3
# SL, 3 # -sialyllactose; 6 # SL, 6 # -sialyllactose.

GOS secara efektif menghambat adhesi E. coli enteropatogenik pada sel HEp-2 dan Caco-2.23
Pengikatan protein capsid norovirus dengan HBGA didokumentasikan dengan baik. Penelitian
telah menunjukkan pengikatan protein kapsid norovirus dengan HMO; 2 # FL dan 3 # FL
ditemukan menempati kantong pengikatan HBGA pada kapsul norovirus, memberikan dasar
struktural untuk penghambatan virus.24,25 Penelitian ini menunjukkan efektivitas 4
oligosakarida (2 # FL, 3 # SL, 6 # SL, dan GOS) dalam secara substansial mengurangi
infektivitas rotavirus manusia yang lazim secara global, G1P [8] (Wa) dan G2P [4] (DS1) in
vitro. Meskipun tingkat reduksi tidak dapat secara langsung diekstrapolasi ke pengaturan in
vivo, penelitian ini memberikan bukti prinsip bahwa susu oligosakarida dapat menghambat
infektivitas strain rotavirus manusia yang relevan secara klinis.
Temuan penelitian ini berbeda dari laporan sebelumnya di mana kumpulan HMO atau
oligosakarida tertentu tidak terbukti memiliki efek pada infektivitas g1P [8] strain rotavirus
manusia. Pengurangan signifikan dalam infektivitas diamati, bagaimanapun, untuk G5P [7]
strain rotavirus babi OSU di hadapan 3 # SL, 6 # SL, dan dikumpulkan HMO, tetapi tidak di
hadapan 2 # FL (14). VP8 * strain rotavirus babi OSU diketahui mengikat glikans sialilasi,
tetapi mengikat HBGA yang tidak tersialilasi belum dijelaskan. Meskipun HMO tidak
mencegah timbulnya infeksi rotavirus babi, mereka mengurangi durasi diare pada anak babi
dengan memiliki efek pada mikrobiota kolon dan modulasi respon sitokin yang disebabkan
oleh infeksi.15
Konsentrasi oligosakarida susu yang diuji dalam penelitian ini sebanding dengan penelitian
sebelumnya tentang rotavirus hewan.14; Namun, kadarnya lebih tinggi dari konsentrasi
fisiologis HMO individu yang ada dalam ASI.1 Perlu dicatat bahwa dengan tidak adanya HMO
asam lainnya, konsentrasi 3 # SL + 6 # SL yang diuji dalam penelitian ini sesuai dengan jumlah
total HMO asam yang ada dalam ASI (10-20% dari total HMO).1 Selain itu, akun oligosakarida
berfukosilasi untuk; 50% dari total HMO.1 Oligosakrosa berfluosilasi paling banyak adalah 2
# FL, yang ditemukan pada konsentrasi # 4,5 mg / mL.26 Konsentrasi oligosakarida individu
diuji dalam tes infektivitas in vitro karena itu mirip dengan konsentrasi fraksi oligosakarida
asam hadir dalam ASI dan konsentrasi biologis 2 # FL. Selain itu, konsentrasi yang lebih tinggi
mungkin diperlukan dalam pengujian in vitro di mana oligosakarida ditambahkan pada satu
titik selama infeksi bila dibandingkan dengan kondisi fisiologis di mana seorang anak
menerima beberapa makanan selama periode 15 jam yang sama.
Penelitian ini menunjukkan bahwa baik oligosakarida sialylated dan fucosylated dapat
mengurangi infektivitas rotavirus manusia. Ini menarik dalam konteks penelitian tentang
reseptor permukaan sel untuk strain rotavirus manusia. Secara klasik, banyak strain rotavirus
manusia, termasuk G1P [8], diperkirakan menggunakan residu asam sialic internal pada
permukaan sel sebagai reseptor. Namun, semakin banyak bukti menunjukkan bahwa HBGA
adalah faktor keterikatan penting untuk rotavirus manusia.27 Secara khusus, glikos
berfososilasi, termasuk H-tipe 1 dan Lewis b HBGA, sekarang diakui sebagai mitra pengikatan
potensial untuk strain G1P [8] dan G2P [4].28 Semua susu oligosakarida yang diuji dalam
penelitian ini dapat mengurangi infektivitas strain rotavirus manusia G1P [8] dan G2P [4].
Dibandingkan dengan infeksi tanpa oligosakarida, penurunan maksimum infektivitas G1P [8]
diamati dengan 5 mg / mL 2 # FL ketika ditambahkan setelah timbulnya infeksi (pengurangan
62%), sedangkan pengurangan maksimum G2P [4] infektivitas diamati dengan campuran 3 #
SL dan 6 # SL (5 mg / mL) ketika ditambahkan selama infeksi (pengurangan 73%). Meskipun
kami mengamati perbedaan strain spesifik dalam efek oligosakarida susu, semua glycan
tampaknya bekerja pada virus dan bukan pada sel. Oligosakarida susu telah terbukti
memengaruhi proliferasi, maturasi, dan karakteristik pertumbuhan sel epitel usus manusia.29-
32
; Namun, penelitian pendahuluan kami menunjukkan bahwa aksi oligosakarida pada sel
tampaknya memiliki efek terbatas pada replikasi virus. Penelitian lebih lanjut diperlukan untuk
menjelaskan apakah pengurangan infektivitas dimediasi oleh aktivitas reseptor umpan
oligosakarida 'mencegah pengikatan virus ke reseptor permukaan sel atau sebagai akibat dari
efek pada masuknya virus.
Meskipun oligosakarida tunggal tidak sepenuhnya memblokir infektivitas rotavirus dalam
garis sel epitel ginjal monyet MA104 yang diubah, ada kemungkinan bahwa efek langsung dari
oligosakarida pada virus, bersama-sama dengan komponen lain dari imunitas usus dan
pertahanan bawaan, akan menghasilkan penghambatan infektivitas yang lebih besar. Kami
telah menunjukkan penggunaan kultur enteroid usus manusia sebagai model praklinis baru
untuk rotavirus.33 Menguji oligosakarida susu untuk pengaruhnya pada infektivitas rotavirus
dalam kultur enteroid usus manusia akan memungkinkan evaluasi senyawa ini dalam sistem
kultur manusia yang relevan secara fisiologis dan untuk menjelaskan apakah, selain efek
langsung pada virus, ada efek lebih lanjut dari HMO pada host epitel usus yang memengaruhi
infektivitas rotavirus. Studi semacam itu akan penting untuk menerjemahkan temuan saat ini
dari bangku laboratorium ke populasi manusia.
Meskipun penting bagi bayi yang sedang berkembang, HMO bukan merupakan komponen dari
formula bayi yang tersedia secara komersial. Efek perlindungan oligosakarida susu diberikan
kepada anak-anak yang disusui, tetapi tidak semua anak disusui secara eksklusif,
apakah karena alasan medis, keadaan, atau pilihan pribadi ibu. Dalam kasus ini, susu formula
bayi digunakan untuk menambah atau mengganti ASI sebagai sarana gizi. Susu formula bayi
sebagian besar diproduksi dari susu sapi, dan oligosakarida dalam susu sapi jauh lebih sedikit
dan lebih kompleks daripada yang ada dalam ASI. Ada peningkatan minat dalam penambahan
HMO pada formula bayi dan untuk menentukan apakah suplementasi dengan HMO spesifik
memberikan manfaat yang sama dengan ASI. Dalam uji klinis pengujian susu formula yang
ditambah dengan 2 # FL, bayi yang diberi susu formula yang ditambah menunjukkan
pertumbuhan dan pengambilan 2 # FL yang serupa dengan bayi yang disusui.26 Meskipun
optimalisasi lebih lanjut dari konsentrasi efektif dan pengujian dalam model preklinis dan studi
pada manusia diperlukan, pengurangan infektivitas rotavirus oleh oligosakarida susu
memberikan insentif tambahan untuk penambahan oligosakarida khusus untuk susu formula
dan dapat memberikan manfaat tambahan untuk bayi yang diberi susu formula.
Ucapan Terima Kasih
Tanggung jawab penulis adalah sebagai berikut — DRL: merancang dan melakukan percobaan
dan menganalisis data; MKE dan SR: mengawasi proyek, merancang eksperimen dan
menganalisis data; VT dan RS: memberikan reagen dan saran konseptual untuk merancang
percobaan; DRL dan SR: menulis draf awal naskah; dan semua penulis: memberikan ulasan
kritis dan persetujuan akhir dari naskah.

Daftar Pustaka
1. Bode L. Human milk oligosaccharides: every baby needs a sugar mama. Glycobiology
2012; 22: 1147–62.
2. Ninonuevo MR, Park Y, Yin H, Zhang J, Ward RE, BH Clowers, German JB, Freeman
SL, Killeen K, Grimm R, et al. A strategy for notating the human milk glycome. J Agric
Food Chem 2006; 54: 7471–80.
3. Coppa GV, Zampini L, Galeazzi T, Facinelli B, Ferrante L, Capretti R, Orazio G.
Human milk oligosaccharides inhibit the adhesion to Caco-2 cells of diarrheal
pathogens: Escherichia coli, Vibrio cholerae, and Salmonella fyris. Pediatr Res 2006;
59: 377–82.
4. Morrow AL, Ruiz-Palacios GM, Altaye M, Jiang X, Guerrero ML, Meinzen-Derr JK,
Farkas T, Chaturvedi P, Pickering LK, Newburg DS. Human milk oligosaccharides are
associated with protection against diarrhea in breast-fed infants. J Pediatr 2004; 145:
297-303.
5. Tate JE, Burton AH, Boschi-Pinto C, Parashar UD; WHO-Coordinated Global
Rotavirus Surveillance Network. Global, regional, and national estimates of rotavirus
mortality in children <5 years of age, 2000–2013. Clin Infect Dis 2016; 62 (Suppl 2):
S96-105.
6. Jiang V, Jiang B, Tate J, Parashar UD, Patel MM. Performance of crime vaccines in
developed and developing countries. Hum Vaccin 2010; 6: 532–42.
7. Plenge-Boig nig, Soto-Ramirez N, Karmaus W, Petersen G, Davis S, Forster J.
Breastfeeding protects against acute gastroenteritis due to rotavirus in infants. Eur J
Pediatr 2010; 169: 1471–6.
8. Kurugo Z, Geylani S, Karaca Y, Umay F, Erensoy S, Vardar F, Bak M, Yaprak I,
Ozkinay F, Ozkinay C. Rotavirus gastroenteritis among children under five years of
age in Izmir, Turkey. Turk J Pediatr 2003; 45: 290–4.
9. Das S, Sahoo GC, Das P, Singh UK, Jaiswal AK, Singh P, Kumar R, Kumar R.
Evaluating the impact of breastfeeding on rotavirus antigenemia and disease severity in
Indian children. PLoS One 2016; 11: e0146243.
10. Jayashree S, Bhan MK, Kumar R, Bhandari N, Sazawal S. Protection against neonatal
rotavirus infection by breast milk antibodies and trypsin inhibitors. J Med Virol 1988;
26: 333–8.
11. Asensi MT, Martinez-Costa C, Buesa J. Anti-rotavirus antibodies in human milk:
quantification and neutralizing activity. J Pediatric Gastroenterologist Nutr 2006; 42:
560-7.
12. Newburg DS, Peterson JA, Ruiz-Palacios GM, Matson DO, Morrow AL, Shults J,
Guerrero ML, Chaturvedi P, Newburg SO, Scallan CD, et al. Role of human-milk
lactadherin in protection against symptomatic rotavirus infection. Lancet 1998; 351:
1160-4.
13. Yu Y, Lasanajak Y, Song X, Hu L, Ramani S, Mickum ML, Ashline DJ, Prasad BV,
Estes MK, Reinhold VN, et al. Human milk contains novel glycans that are potential
decoy receptors for neonatal rotaviruses. Mol Cell Proteomics 2014; 13: 2944–60.
14. Hester SN, Chen X, Li M, Monaco MH, Comstock SS, Kuhlenschmidt TB,
Kuhlenschmidt MS, Donovan SM. Human milk oligosaccharides inhibit rotavirus
infectivity in vitro and in acutely infected piglets. Br J Nutr 2013; 110: 1233–42.
15. Li M, Monaco MH, Wang M, Comstock SS, Kuhlenschmidt TB, Fahey GC Jr., Miller
MJ, Kuhlenschmidt MS, Donovan SM. Human milk oligosaccharides shorten
rotavirus-induced diarrhea and modulate piglet mucosal immunity and colonic
microbiota. ISME J 2014; 8: 1609-20.
16. Ciarlet M, Estes MK, Barone C, Ramig RF, Conner ME. Analysis of host range
restriction determinants in the rabbit model: comparison of immunologic and
heterologous rotavirus infections. J Virol 1998; 72: 2341–51.
17. van Leeuwen SS, BJ Kuipers, Dijkhuizen L, Kamerling JP. Comparative structural
characterization of 7 commercial galacto-oligosaccharide (GOS) products. Carbohydr
Res 2016; 425: 48–58.
18. Ciarlet M, Crawford SE, Cheng E, Blutt SE, Rice DA, Bergelson JM, Estes MK. VLA-
2 (alpha2beta1) integrin promotes rotavirus entry into cells but is not necessary for
rotavirus attachment. J Virol 2002; 76: 1109-23.
19. Gutie´rrez M, Isa P, Sanchez-San Martin C, Prez-Vargas J, Espinosa R, Arias CF, Lpez
S. Different rotavirus strains enter MA104 cells through different endocytic pathways:
 the role of clathrin-mediated endocytosis. J Virol 2010; 84: 9161-9.
20. Zrate S, Cuadras MA, Espinosa R, Romero P, Jurez KO, Camacho-Nuez M, Arias CF,
Lpez S. Interaction of rotaviruses with Hsc70 during cell entry is mediated by VP5. J
Virol 2003; 77: 7254–60.
21. Angeloni S, Ridet JL, Kusy N, Gao H, Crevoisier F, Guinchard S, Kochhar S, Sigrist
H, Sprenger N. Glycoprofiling with micro-arrays of glycoconjugates and lectins.
Glycobiology 2005; 15: 31–41.
22. Ruiz-Palacios GM, Cervantes LE, Ramos P, Chavez-Munguia B, Newburg DS.
Campylobacter jejuni binds intestinal H (O) antigen (Fuc alpha 1, 2 Gal beta 1,
4GlcNAc), and fucosyloligosaccharides of human milk inhibit its binding and infection.
J Biol Chem 2003; 278: 14112-20.
23. Shoaf K, Mulvey GL, Armstrong GD, Hutkins RW. Prebiotic gal-actooligosaccharides
reduce adherence of enteropathogenic Escherichia coli to tissue culture cells. Infect
Immun 2006; 74: 6920–8.
24. Schroten H, Hanisch FG, Hansman GS. Human norovirus interactions with GOS -
blood group antigens and human milk oligosaccharides. J Virol 2016; 90: 5855-9.
25. Weichert S, Koromyslova A, Singh BK, Hansman S, Jennewein S, Schroten H,
Hansman GS. Structural basis for norovirus inhibition by human milk oligosaccharides.
J Virol 2016; 90: 4843–8.
26. Marriage BJ, Buck RH, Goehring KC, Oliver JS, Williams JA. Infants fed a lower
calorie formula with 2 # FL show growth and 2 # FL uptake like breast-fed infants. J
Pediatr Gastroenterol Nutr 2015; 61: 649–58.
27. Hu L, Crawford SE, Czako R, Cortes-Penfield NW, Smith DF, Le Pendu J, Estes MK,
Prasad BV. Cell attachment VP8 protein * of a human rotavirus specifically interacts
with A-type histo-blood group antigens. Nature 2012; 485: 256-9.
28. Huang P, Xia M, Tan M, Zhong W, Wei C, Wang L, Morrow A, Jiang X. Spike protein
VP8 * of human rotavirus recognizes histo-blood group antigens in a type-specific
manner. J Virol 2012; 86: 4833–43.
29. Holscher HD, Davis SR, Tappenden KA. Human milk oligosaccharides influence the
maturation of human intestinal Caco-2Bbe and HT-29 cell lines. J Nutr 2014; 144: 586–
91.
30. Kuntz S, Kunz C, Rudloff S. Oligosaccharides from human milk induce growth arrest
via G2 / M by influencing growth-related cell cycle genes in intestinal epithelial cells.
Br J Nutr 2009; 101: 1306-15.
31. Kuntz S, Rudloff S, Kunz C. Oligosaccharides from human milk influencing growth-
related characteristics of intestinally transformed and non-transformed intestinal cells.
Br J Nutr 2008; 99: 462–71.
32. Hester SN, Donovan SM. Individual and combined effects of nucleosides and human
milk oligosaccharides on proliferation, apoptosis and necrosis in a human fetal
intestinal cell line. Food Nutrition Sci 2012; 3: 1567–76.
33. Saxena K, Blutt SE, Ettayebi K, Zeng XL, Broughman JR, Crawford SE, Karandikar
UC, Sastri NP, Conner ME, Opekun AR, et al. Human intestinal enteroids: a new model
for the study of human rotavirus infection, host restriction, and pathophysiology. J Virol
2015; 90: 43–56.